Introduction
Acido nucleico precedente lavoro autoassemblaggio 1-25 ha portato alla costruzione di successo di una varietà di strutture complesse, compreso il DNA 2 - 5,8,10 - 13,17,23 o RNA 7,22 3,4,7 periodica, 22 e algoritmico 5 bidimensionali reticoli, nastri 10,12 e tubi 4,12,13, cristalli 3D 17, poliedri 11 e finite, 2D forme 7,8. Un metodo particolarmente efficace è ponteggi origami di DNA, per cui un singolo filo impalcatura viene piegato da molti corti filamenti ausiliari fiocco per formare una forma complessa 9,14 - 16,18 - 21,25.
Recentemente abbiamo segnalato un metodo per costruire nanostrutture discreti con forme 2D prescritte con piastrelle a singolo filamento (SST), e dimostrato strutture con complessità paragonabile a origami di DNA 26. Questo article è un adattamento del nostro lavoro precedente 26 e descrive in dettaglio i protocolli per l'organizzazione di SST indirizzabili individualmente in sofisticate forme 2D finiti con dimensioni prescritte con precisione (larghezze e lunghezze) e morfologie. Uno dei principali vantaggi del metodo SST è la sua modularità. Ogni SST componente di una struttura serve come unità di costruzione modulare nell'assemblaggio, e diversi sottoinsiemi di questi SST produrre forme distinte. Così, abbiamo stabilito una piattaforma generale per costruire nanostrutture con dimensioni e forme prescritte dalla corte, filamenti di DNA sintetico.
SST contengono quattro domini, ciascuno lungo 10 o 11 nucleotidi (Figura 1A). Le SST legano in modo tale che le loro eliche parallele creano un reticolo di DNA tenuti insieme da legami incrociati. Ogni crossover è fosfato tra i domini 2 e 3. Il fosfato è allungato artificialmente nei diagrammi per chiarezza visiva. I crossover sono distanziati due spire elicoidali (21 basi) a parte (<strong> Figura 1B). I rettangoli compositi sono indicati con le dimensioni del numero di eliche e spire elicoidali. Ad esempio, un rettangolo che è di sei eliche e otto elicoidale gira lungo viene fatto riferimento come 6H × 8T rettangolo. SST può essere lasciato fuori, ha aggiunto, o comunque riorganizzate per creare strutture di forme arbitrarie e dimensioni (Figura 1C). Per esempio, un disegno rettangolare può essere arrotolato in un tubo con una lunghezza e raggio desiderato (Figura 1D).
In alternativa, il SST reticolo rettangolare può essere visto come una tela molecolare costituito da SST pixel, ogni 3 nm da 7 nm. In questo studio, usiamo una tela molecolare di 310 full-length SST interne, 24 SST full-length che costituiscono i confini sinistro e destro, e 28 SST a mezzo busto che costituiscono le delimitazioni superiore e inferiore. La tela ha 24 doppie eliche legate da crossover e ogni elica contiene 28 spire elicoidali (294 basi) ed è quindi indicato comeuna 24H × 28T rettangolare tela. Il 24H × 28T tela ha un peso molecolare simile a quella di una struttura origami di DNA ricavato da un fago M13 ponteggio.
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Protocol
1. DNA Sequenza di design
- Utilizzare software UNIQUIMER 27 per progettare una struttura SST-finite specificando il numero di doppie eliche, lunghezze di elica superiore e inferiore per ciascuna doppia elica, e il modello di crossover per creare un 24H × 28T tela. Dopo aver definito questi parametri, l'architettura complessiva (composizione filamento e la disposizione complementarità) è illustrato graficamente nel programma.
- Generare sequenze per i fili della struttura indicata per soddisfare la disposizione complementarità e requisiti aggiuntivi (se presenti). Progettare sequenze di DNA minimizzando la sequenza di simmetria 28 (per la maggior parte delle strutture).
- Generare nucleotidi (A, C, G e T) in modo casuale uno per uno.
- Partita nucleotidi complementari a quelle generate a seguito della regola base-pairing: dalla A alla T e viceversa; C a G e viceversa.
- Non utilizzare i segmenti che si ripetono al di là di otto o nove nucleotidi. Quando tale repmangiare segmenti emergono durante la progettazione, mutare i nucleotidi più recentemente generati fino a quando l'obbligo di ripetere segmento è soddisfatto.
- Non utilizzare quattro basi consecutive A, C, G e T.
- Utilizzare nucleotidi pre-specificati nei punti di collegamento a singolo filamento (per esempio G T e come il ventunesimo e ventiduesimo nucleotidi, rispettivamente, per la maggior parte dei fili) per evitare basi scivolare attorno ai punti di collegamento (ad esempio, se entrambi ventunesimo e ventiduesimo nucleotidi erano T, è stato possibile per il XXI nucleotide di legarsi al nucleotide che la ventiduesima nucleotide dovrebbe legarsi a).
- Modifica sequenze di DNA manualmente per l'etichettatura streptavidina, la trasformazione di rettangoli in tubi, la formazione di diversi rettangoli e tubi diverse scale differenti, e per prevenire l'aggregazione causati da domini esposti su SST.
- Sostituire i domini esposte sul bordo della tela molecolare con poli-T Tracts.
- Per l'etichettatura streptavidina, progettare i segmenti manico (il segmento in più aggiunto al filone componente che può legarsi ad una controparte complementare, come un filo anti-maniglia), tali da poter ospitare un filo anti-maniglia con 3 'modifica biotina.
- Per la conversione di un rettangolo in un tubo, rimuovere le righe superiore e inferiore del rettangolo e inserire una nuova riga cui SST avere complementarità specifico ai corrispondenti piastrelle sul secondo per riga superiore e il secondo per fila inferiore.
- Per un singolo dominio filamento esposto di forme diverse, sostituirlo con poli-T segmenti di lunghezza 10-11 nucleotidi, o coprire da paraspigoli che sono complementari al dominio esposta e terminano con un 10-11 nucleotidi segmenti lunghi poli-T.
2. Preparazione dei Canvas molecolare
- Ottenere filamenti di DNA dei componenti di sequenze specificate disciolti in acqua priva di RNasi da un oligonucleotide produttore in V fondo piastre da 96 pozzetti con oligonucleotidi sintetizzati in una scala di 10 nmol con desalinizzazione standard. Centrifugare le piastre a 96 pozzetti con i filamenti di DNA di circa 10 s a 600 x g.
- Pipettare 1 ml di ciascuna delle 362 pozzetti con filamenti di DNA per la 24H × 28T rettangolo (Figura 3A) a 100 mM per filo (specifica costruttore) in una provetta 2 ml. Aggiungere 138 ml di acqua distillata deionizzata H 2 O alla provetta 2 ml di prova per ottenere una soluzione stock di miscela filamento ad una concentrazione di 200 nM per filo.
- Aggiungere 50 ml della soluzione di 200 nM magazzino di miscela filamento, 10 ml di ricottura 10X tampone A (Tris 50 mM, pH 7,9, EDTA 10 mM, 250 mM MgCl 2), e 40 ml di acqua distillata deionizzata H 2 O a 0,2 Tubo ml PCR. Questo rende un campione di 100 microlitri della tela molecolare in 1X tampone di ricottura A (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCl 2).
- Anneal il SAMPLe per 17 ore in un termociclatore raffreddamento da 90 ° C a 25 ° C. Programmare il termociclatore come segue: rampa di discesa da 90 ° C a 61 ° C ad una velocità costante di 5 min per ° C; rampa di decelerazione da 60 ° C a 25 ° C ad una velocità costante di 20 min per ° C; e incubare a 4 ° C fino a che il campione può essere estratto dal termociclatore.
- Preparare un 2% gel nativo.
- Misurare 2,4 g di agarosio in un becher da 600 ml. Aggiungere 120 ml di tampone TBE 0.5X (44.5 mM Tris-borato, pH 8,3, EDTA 1 mM) e 30 ml di acqua deionizzata distillata nel becher.
- Forno a microonde per 3 minuti (o 40 - 60 sec dopo ebollizione). Ricostituire l'acqua persa durante l'evaporazione mediante aggiunta di 30 ml di acqua, che aiuta a mantenere la concentrazione di agarosio in gel al 2%.
- Agitare il contenuto del bicchiere per 1 min in un bagno di acqua fredda. Aggiungere 1 ml di 1,2 M MgCl 2 (per fare un MgCl 10 mM concentrazione di 2 nel gel) e pre-macchia lo spirito gelh 6 ml di SYBR sicuro tintura (1: 20.000).
- Versare la soluzione di gel in una scatola di gel secco e inserire un 1,5 millimetri di spessore 12 ben elettroforesi su gel pettine. Lasciare solidificare per 15 - 30 min su una piattaforma ancora.
- Versare tampone gel running (44.5 mM Tris-borato, pH 8,3, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl e 2) nella scatola gel. Carico 2 - 3 ml di 1 kb DNA ladder in un pozzo del gel di agarosio. Mescolare 4 ml di 6X bromofenolo colorante blu (0,25% blu di bromofenolo, 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl 2 e 30% glicerolo) con 20 ml di campione della tela molecolare e caricare la soluzione in un altro pozzetto della gel di agarosio.
- Eseguire il nativo 2% agarosio per 2 ore a 100 V in un bagno di acqua ghiacciata (bromofenolo blu, in blu, corre più veloce di fili di componenti in modo che possa servire come indicatore che se il tempo di 2 ore di funzionamento è appropriato).
- Immagine il gel utilizzando uno scanner gel con un filtro appropriato per il SYBR macchia di sicurezza (Figura 2B
- Su un transilluminatore luce blu, accise la banda dominante mobilità simile alla banda di 1.500 paia di basi del DNA scala 1 kb con una lama di rasoio pulito tagliente. Posizionare il pezzo di gel desiderato (s) in una colonna di spin e poi schiacciare il gel in pezzi sottili con un pestello microtubo. Centrifugare a 438 xg per 3 min a 4 ° C.
- Misurare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro ultravioletta a 260 nm.
- Utilizzare 2 ml di acqua distillata ultrapura DNasi / RNase-Free come bianco per calibrare la macchina.
- Utilizzare un volume equivalente di campione prelevato dalla colonna di selezione per ottenere una stima della concentrazione di DNA. Il valore misurato di concentrazione ("a" = ng / ml) conseguito presso un assorbimento UV di 260 nm aiuterà a determinare il fattore di diluizione per AFM e di imaging TEM.
- Convertire la concentrazione misurata da "a" (ng / ml) per "b" (nM) in seguito b = a × 10 6 / (330 &# 215; numero di nucleotidi).
NOTA: Il peso molecolare di un nucleotide è 330 g / mol. Il valore della concentrazione molare calcolato determina il fattore di diluizione per AFM e TEM imaging. Come per il caso di un 24H × 28T rettangolo, la misura comune per il campione purificato è intorno 10 - i 60 ng / ml. Poiché il numero di nucleotidi per una tale struttura è 14616 Da, la concentrazione molare è di circa 2 - 12 nM. La concentrazione finale è determinato dal rendimento di raccolta (~ 20 - 50%) da centrifugazione e il volume della banda gel asportato out (maggiore è il volume, più diluire il campione purificato).
3. microscopia a forza atomica Imaging
- Staccare mica collegato a un disco dei campioni di metallo con nastro adesivo per ottenere una superficie piana e inserire il disco di preparato sul palco di imaging.
- Aggiungere 40 ml di 1X tampone di ricottura A seguiti da 5 microlitri (2 - 5 nM) del campione purificato della 24H × 28Trettangolo sulla superficie mica appena spaccati. Lasciare il composto di stabilirsi per circa 2 minuti.
- Installare AFM nitruro di silicio di chip a sbalzo su un supporto a sbalzo. Utilizzare una punta triangolare C (frequenza di risonanza, f 0 = 40-75 kHz; primavera costante, k = 0,24 Nm -1) per l'imaging.
- Immagine un campione nel modo fluido maschiatura. Utilizzare i seguenti parametri di imaging per la scansione: scansione dimensione di 2 micron, 1024 linee per la risoluzione e una velocità di scansione di 0,5 - 1 Hz (Figura 2C).
- Se necessario, aggiungere 10 ml o più di 10 mM soluzione NiCl 2 per aumentare la forza di legame 29 DNA-mica.
4. Preparazione del campione per Streptavidin Etichettatura
- Progettare manualmente la 24H × 28T rettangolo tale che fili manico in luoghi specifici sono incorporati come complementari alle varie componenti anti-maniglia con modifica biotina, che a loro volta sono in grado di legarsi a streptavidin particolare.
- Modificare la tela molecolare collegando un 'segmento 3 17-nucleotide che consiste in una sequenza di due nucleotidi (TT) come distanziatore e una maniglia 15-nucleotide (GGAAGGGATGGAGGA) per le 14 tessere sulla fila superiore e 14 piastrelle sul fondo fila del rettangolo (Figura 3A) per etichettare confine. Questa sequenza è complementare ad una 3 'biotina modificato strand anti-impugnatura (TCCTCCATCCCTTCC-biotina).
- Per l'etichettatura interna, attaccare il segmento 3 '17 nucleotidi a 8 tessere interne e 6 piastrelle di confine del rettangolo (figura 4A).
- Mescolare le 28 trefoli con manici (etichettatura confine) con il resto dei componenti che costituiscono il 24H × 28T rettangolo (334 fili) per fare una soluzione stock di 200 nM. Mescolare le 14 trefoli con maniglie (etichettatura interna) con il resto dei componenti che costituiscono il 24H × 28T rettangolo (348 filamenti) per ottenere una soluzione madre di 200 nM.
- Per boetichettatura undary, aggiungere 50 ml di soluzione madre di 200 nM dei trefoli, 6 ml di 100 mM biotina modificato anti-maniglia trefoli, 10 ml di ricottura 10X tampone A, e 34 ml di acqua distillata deionizzata ad una 0,1-0,2 provetta ml PCR. La concentrazione finale del filo componente è 100 nm e la concentrazione finale del filamento modificato anti-handle biotina è di 6.000 nM. Si noti che 28 molecole anti-gestiscono biotina modificato filo si legano a una 24 ore × 28T rettangolo in modo che il filo anti-gestire biotina modificata è superiore al 100% per rendere il legame favorevole.
- Per l'etichettatura interna, aggiungere 50 ml di soluzione di riserva 200 Nm dei fili, 3 ml di anti-gestire biotina filo modificato interna a 100 micron, 10 ml di 10X buffer di ricottura A, 37 ml di acqua deionizzata distillata a un 0,1 - 0,2 ml provetta PCR. La concentrazione finale del filo componente è 100 nm e la concentrazione finale di anti-handle biotina modifi ed filone è 3.000 nm. Si noti che 14 molecole anti-handle biotina modificato filo legano ad una 24H × 28T rettangolo così anti-gestire biotina filo modificato è superiore al 100% per rendere il legame favorevole.
- Ricottura entrambi i campioni in un termociclatore per 17 ore utilizzando la procedura descritta in 2.3.
- Preparare un 2% gel nativo come descritto nei punti 2.4.
- Purificare entrambi i campioni come descritto ai punti 2.5.
- Misurare le concentrazioni delle strutture di DNA desiderati come descritto ai punti 2.6.
5. microscopia a forza atomica per l'etichettatura Streptavidin
- Immagine ogni campione con un AFM, come descritto al punto 3 (figure 3B e 4B).
- Dopo il primo turno delle immagini, aggiungere 40 ml di 1X tampone di ricottura A seguita da 1 ml di streptavidina a 10 mg / ml per il campione. Lasciare il composto di stabilirsi per circa 2 minuti prima di re-imaging (Figure 3C e 4C).
- Per progettare un tubo sulla base del rettangolo, mantenere tutti gli SST componenti in posto tranne le file superiore e inferiore. Introdurre una nuova riga cui SST sono progettati concatenando le mezze tegole superiori e inferiori delle rispettive colonne ciclizzare il rettangolo originale in una conformazione tubo (Figura 5A).
- Mescolare la nuova riga di fili (14 fili) con i fili che compongono il 24H × 28T rettangolo escluse le righe superiore e inferiore (336 linee) per ottenere una soluzione stock 200 Nm.
- Seguire la purificazione gel passaggi 2,2-2,7 (Figura 5B).
7. Transmission Electron Microscope Imaging
- Pesare 0,06 g di formiato di uranile in 3 ml di acqua distillata per preparare una soluzione acquosa di uranile macchia formiato 2%. Filtrare la soluzione acquosa macchia uranile formiato 2% utilizzando un filtro da 0,2 micron attaccato ad una siringa.
- Aggiungere 5 ml di5 N NaOH al 1 ml di soluzione macchia filtrata. Brevemente agitare la soluzione e centrifugare a 20000 x g.
- Glow scaricare le griglie di carbonio rivestite (lato rivestito verso l'alto) con le seguenti impostazioni: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar e polarità negativa High Tension.
- Utilizzare pinze a chiusura automatica per afferrare una griglia trattata bagliore scaricatore dal bordo.
- Pipettare 3,5 ml di campione sulla griglia per 4 min. Usare un pezzo di carta da filtro per favorire off campione portando la carta da filtro a contatto con la griglia di lato.
- Aggiungere immediatamente 3,5 ml di soluzione macchia sulla griglia per 1 min.
- Wick via la macchia come in 7.4 e tenere la carta da filtro contro la rete del 1 - 2 min.
- Trasferire la griglia di un titolare TEM campione e immagine utilizzando un JEOL JEM-1400 funzionare a 80 kV con ingrandimento variabile da 10 K a 80 K (Figura 5C).
8. Costruire forme arbitrarie utilizzando la Molecular Canvas
- Identificare una forma e selezionare i fili che corrispondono alla forma sulla tela molecolare. Per una forma triangolare per esempio, selezionare 206 su 362 capi per la tela molecolare.
- Sostituire il dominio esposta (cioè lungo l'ipotenusa del triangolo) con un segmento di poli-T 10 - 11 nucleotidi (disegno 1 nella Figura 6A), o aggiungere una protezione bordo che è complementare al dominio esposta e terminare con 10 - segmento lungo poly-T 11 nucleotide (disegno 2 nella Figura 6A) per prevenire l'aggregazione.
NOTA: Semplicemente ricottura gli SST che corrispondono ai pixel del triangolo (senza utilizzare fili protettore) porterà ad aggregazione e senza formazione di bande distinte prodotto su un gel. Utilizzare il disegno paraspigoli per varie forme in quanto è più efficiente delle risorse; richiede solo quattro set aggiuntivi di filamenti (Figura 6C) rispetto a 14 set aggiuntivi nella progettazione di sostituzione (Figure 6B). - Creare una libreria filo per la tela molecolare 310-pixel, che comprende il nucleo (la tela 362 SST), Set 1 * (paraspigoli che si legano al dominio 1 di una SST), Set 2 * (paraspigoli che si legano al dominio 2 di una SST), Set 3 * (paraspigoli che si legano al dominio 3 di un SST), e Set 4 * (paraspigoli che si legano al dominio di un 4 SST) per dare un totale di 1.344 paraspigoli.
- Centrifugare le piastre a 96 pozzetti per i diversi set per circa 10 s. Pipettare i fili desiderati dalle piastre in modo da ottenere una soluzione stock di una certa forma.
- Per la forma di un triangolo con paraspigoli, pipetta 1 ml di 206 fili dal nucleo, 0 della serie 1 *, 0 della serie 2 *, 0 della serie 3 * e 24 fili della serie 4 * in una centrifuga 2 ml tubo. Aggiungere 20 ml di acqua distillata deionizzata al tubo per ottenere una soluzione stock di 400 nM dei filamenti di DNA.
- Aggiungere 50 ml di soluzione di 400 NM di stra DNA nds, 10 ml di 10X buffer di ricottura B (50 mM Tris, pH 7.9, EDTA 10 mm, 125 mM MgCl 2) soluzione madre e 40 ul distillata H 2 O deionizzata in una provetta da 0,2 ml PCR. Questo rende un campione di 100 microlitri del triangolo in 1X tampone di ricottura B (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl 2) con trefoli a una concentrazione di circa 200 nM per filo.
- Anneal il composto in un termociclatore per 17 ore come descritto al punto 2.3.
- Preparare un 2% gel nativo come descritto al punto 2.4.
- Purificare il campione come descritto al punto 2.5.
- Misurare la concentrazione del DNA come descritto al punto 2.6.
- Immagine del campione sotto AFM come descritto al punto 3 (Figura 7C e 7D).
- Scegli e mescolare capi per forme diverse utilizzando la stessa libreria filamento. Ricuocere le diverse soluzioni e combinare campioni purificati di forme diverse per risparmiare tempo durante l'imaging AFM.
- Utilizzare un programma MATLAB personalizzato per aiutare la progettazione di forme complesse.
- Utilizzare il software per fornire indicazioni, sotto forma di una sequenza di dispensazione di un gestore di robot liquido. Utilizzare il gestore liquido robot di selezionare e miscelare i fili che costituiscono la forma di destinazione.
NOTA: la progettazione e la ciocca di miscelazione è stato automatizzato per ridurre l'errore umano e rendere intensa la costruzione meno lavoro.
10. Rettangoli e tubi Across diverse scale
- Costruire rettangoli di diverse dimensioni (Figura 10) semplicemente modificando il numero di eliche parallele (H) e il numero di spire elicoidali (T).
- Eseguire il punto 3 per un rettangolo dimensione specifica.
- Eseguire il punto 6 per un tubo di dimensione specifica.
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Representative Results
L'auto-assemblaggio di SST (Figura 1) produrrà un 24H × 28T rettangolo, come illustrato in figura 2. Sequenze di DNA per i diversi SST possono essere modificati / ottimizzata per abilitare l'etichettatura streptavidina (Figura 3 e 4), la trasformazione di un rettangolo in un tubo (figura 5), programmabile autoassemblaggio di SST per formare tubi e rettangoli di diverse dimensioni (Figura 10), e la costruzione di forme arbitrarie 2D utilizzando la tela molecolare (Figura 8). Due disegni (dominio progettazione sostituzione e design protettore bordo) sono stati testati come soluzioni di aggregazione lungo domini esposti di forme arbitrarie (Figura 7). Entrambi i disegni hanno resa gel comparabile e integrità strutturale, ma il design protezione bordo è più conveniente in quanto richiede meno specie ausiliari (Figura 6).Strand raccolta e miscelazione possono essere automatizzati, come illustrato nelle figure 9 a ridurre l'errore umano e risparmiare tempo.
Figura 1. Auto-assemblaggio di forme molecolari con piastrelle a singolo filamento. (A) Il motivo SST canonica, adattato da 12 (B) a sinistra e al centro:. Due raffigurazioni di SSTs assemblati. SST interni hanno una lunghezza totale di 42 basi e sono classificati come "U", mentre SST di confine hanno 21 basi e sono etichettati come "L". Nel diagramma di sinistra, colori distinguono diversi domini. Nel diagramma mezzo, colori distinguono differenti filamenti. A destra: Uno schema della vista muro di mattoni di strutture SST. Mattoni spesse sono SST pieni e mattoni sottili sono SSTs confine. I bordi arrotondati, non indicano nessun accoppiamento complementare. Come nella figura centrale, i colori distinguono singole tessere. In tutto diagpistoni, ogni piastrella ha una sequenza unica. (c) la mancata un'opportuna selezione di trefoli della collezione SST che compongono il disegno rettangolo nella Figura B provoca la formazione di una forma desiderata diversa come un triangolo (sinistra) o un anello rettangolare (a destra). (D) La progettazione di un tubo con una larghezza predeterminata e lunghezza. (E) Data una piscina pre-sintetizzati di sequenze SST (in alto), forme arbitrarie (inferiore) può essere progettato scegliendo un sottoinsieme di trefoli utilizzare nella miscela filamento (blu scuro pixel) ed eliminando il resto (luce blu pixel). Questo dato è stato modificato da una figura in precedenza pubblicato 26. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Boundary etichettatura di 24H × 28T Rectangle. (A) Schema del bi specifica24H × 28T rettangolo Otin marcato. I fili evidenziate in blu sono i fili della maniglia. I fili evidenziate in rosso sono i fili anti-maniglia marcati con 3 'di biotina (punti neri). Streptavidin è raffigurato come una sfera arancione immagine (B) AFM prima di aggiungere (formato di scansione: 1 micron × 1 micron) streptavidina.. (C) AFM immagine dopo l'aggiunta streptavidina (formato di scansione: 1 micron × 1 micron). Inset, una vista ingrandita nel mostrare l'etichettatura di successo. Si noti che streptavidina apparso sia come puntini bianchi o strisce a causa delle loro altezze sollevate. Questo dato è stato modificato da una figura in precedenza pubblicato 26. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. InTernal Etichettatura di 24H × 28T rettangolo. (A) Schema del biotina specifico 24H etichettato × 28T rettangolo. I fili evidenziate in blu sono i fili della maniglia. I fili evidenziate in rosso sono i fili anti-maniglia marcati con 3 'di biotina (punti neri). Streptavidin è raffigurato come una sfera arancione immagine (B) AFM prima di aggiungere (formato di scansione: 1 micron × 1 micron) streptavidina.. (C) AFM immagine dopo l'aggiunta streptavidina (formato di scansione: 1 micron × 1 micron). Inset, una vista ingrandita nel mostrare l'etichettatura di successo. Si noti che streptavidina apparso sia come punti bianchi o strisce dovuti alle altezze sollevate. Questo dato è stato modificato da una figura in precedenza pubblicato 26. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5. Progettazione e TEM Immagine della 24H × 28T Tube. (A) Schema del 24H × barile 28T. Due viste ingrandite-in nella parte superiore e parte inferiore mostrano i dettagli identità segmento. Si noti che i segmenti a24.x * (ad esempio, a24.13 *) e b24.x * (ad esempio, b24.12 *) della prima fila sono complementari ai segmenti a24.x (ad esempio, a24.13) e b24.x (ad esempio, b24.12) della fila inferiore; tale complementarità dovrebbe portare alla formazione della struttura tubolare. (B) 2% nativo elettroforesi su gel di agarosio. U, non purificato; P, purificato (per estrazione gel dalla corsia U) (C) Immagine TEM della struttura barile (barra della scala: 100 nm).. Questo dato è stato modificato da una figura in precedenza pubblicato 26.ighres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Due disegni a prevenire l'aggregazione causati da Exposed Sticky Domini. (A) Una dimostrazione side-by-side di due metodi per coprire domini esposti. Il dominio appiccicoso spaiato (dominio 4) è indicato con un rosso, scatola tratteggiata. Disegno 1 è la progettazione di sostituzione dominio, in cui il dominio spaiato è sostituito da un dominio poli-T (mostrato in rosso e dicitura "T"). Design 2 è il design protettore dei bordi, che consiste nel coprire il dominio spaiato con un filo di protezione bordo (visualizzato in rosso ed etichettati "T-4 *"). Il filamento paraspigolo è composto da una sezione di poli-T e un complemento al dominio esposta. (B) Le varie configurazioni possibili contorno associate alla sostituzione del dominio (disegno 1).Ci sono 14 modi diversi di SST interna (in blu) possono lasciare un dominio o di domini esposti. Le opportune sostituzioni strand sono mostrati in rosso per ogni situazione. (C) Il disegno di protezione bordo (disegno 2). Una SST interno (blu) richiede solo quattro filoni protezione bordo (rossi) per coprire i domini esposti utilizzando questo disegno. Questo dato è stato modificato da una figura in precedenza pubblicato 26. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Due disegni per il Triangolo SST. (A) e (B) rappresentano schemi su disegno 1 (sostituzione dominio) e disegno 2 (protettore bordo) in Figura 8, rispettivamente. Una regione poli-T (T10 o T11 in figura) è raffigurata comeun angolo arrotondato nello schema a blocchi. L'inserto mostra una vista ingrandita della struttura indicata con la casella tratteggiata. Bar Scala, 100 nm. (C) e (D) sono le immagini AFM. Questo dato è stato modificato da una figura in precedenza pubblicato 26.
Figura 8. Diagrammi e AFM immagini di 100 diverse forme. Disegni Struttura vengono visualizzate nei pannelli superiori. Luce colorazione blu indica i fili di tela lasciati fuori della mischia, mentre la colorazione blu scuro indica i fili inclusi. Per chiarezza, filamenti protezione bordo sono state omesse. Un'immagine corrispondente AFM di ogni struttura è indicata sotto il suo design. Ogni immagine è di 150 nm × 150 nm in zona. Ci sono 100 forme uniche. Sono incluse 10 cifre arabe, le 26 lettere maiuscole dell'alfabeto latino, 23 segni di punteggiatura e keyboaSimboli rd, 10 emoticons, 9 simboli astrologici, 6 caratteri cinesi, e diversi simboli vari. Questo dato è stato modificato da una figura in precedenza pubblicato 26. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9. Robot Automation diagramma di flusso. Questo schema rappresenta il flusso di lavoro utilizzato per automatizzare il processo di miscelazione. In primo luogo, un programma MATLAB personalizzato è utilizzato per progettare la forma desiderata. Ancora una volta, rettangoli blu indicano i fili da inserire nella miscela. Dopo il disegno è completato, il programma emette una serie di istruzioni di pipettaggio per il gestore liquido robotico. Il robot pipette le corrette concentrazioni dei trefoli appropriati per una particolare forma in una piattaformauna e bene. La miscela subisce quindi una ricottura pot, seguita da immagini AFM delle forme risultanti. (Questa cifra è stata modificata da un personaggio pubblicato in precedenza 26). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 10. auto-assemblaggio di rettangoli e tubi Across diverse scale. (A) le immagini AFM di rettangoli SST con le seguenti progettato dimensioni (da sinistra a destra):. 4H × 4T, 6H × 7T, 10H × 10T, 14T × 12H, 18H × 20T, 28T × 24H e 36H × 34T ( B) I pesi molecolari delle strutture sono su una scala logaritmica. L'asterisco indica il peso di una tipica struttura di origami di DNA M13 come riferimento. (C) immagini TEMdi tubi SST con le seguenti dimensioni progettate (da sinistra a destra): 8H × 28T, 8H × 55T, 8H × 84T, 28T × 24H e 12H × 177T. Tutte le barre di scala indicano 100 nm. Questo dato è stato modificato da una figura in precedenza pubblicato 26. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nella fase formazione della struttura, è importante mantenere un'adeguata concentrazione di cationi magnesio (ad es., 15 mm) nella miscela filamento di DNA di nanostrutture di DNA di auto-assemblaggio. Analogamente, nella fase di caratterizzazione gel di agarosio / purificazione, è importante mantenere un adeguato concentrazione di cationi di magnesio (ad es., 10 mM) nel gel e il buffer gel running mantenere le nanostrutture di DNA durante l'elettroforesi. Per la 24H × struttura 28T rettangolo, abbiamo testato ricottura in diverse concentrazioni di Mg ++ e trovato che la struttura tipicamente formata nella gamma di 10 - 30 mM Mg ++ (con il miglior rendimento formazione con circa 20 mM Mg ++).
Diversamente dalla struttura origami ponteggi, la struttura SST ha un'architettura modulare. Diverse forme possono essere progettati dalla stessa tela selezionando l'appropriato sottoinsieme di piastrelle SST. Inoltre, la struttura SST è assemblata from solo brevi filamenti di DNA sintetici e non comporta un lungo scaffold utilizzato nell'approccio origami. Pertanto, la dimensione della struttura SST non è limitata dalla lunghezza del ponteggio disponibili. Tuttavia, mentre l'approccio Origami DNA può spesso essere ottimizzato per produrre sia strutture ripiegate o monomeri non piegati, SST può causare strutture parzialmente formate e quindi può essere purificato gel per uso successivo. Inoltre, a causa della mancanza di un filamento scaffold, una struttura SST può essere più "fragili" rispetto al suo omologo origami DNA. Sia l'approccio SST e l'approccio origami di DNA sono in rapida evoluzione, e un utente si consiglia di scegliere un approccio che meglio si adatta alle sue particolari esigenze funzionali.
Colpisce il fatto che centinaia di piccoli monomeri mediata solo da interazioni di legame locali possono auto-assemblano in una forma globale prescritta, come dimostra l'approccio SST. I principi fondamentali indicati nell'approccio sho SSTULD essere generalizzabili ai materiali accanto i filamenti di DNA, e il metodo di base descritto in questo articolo, dopo la modifica del caso, dovrebbe consentire le costruzioni di strutture complesse auto-assemblate con materiali diversi.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Office of Naval Research giovane Programma Investigator Award N000141110914, Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF CARRIERA Premio CCF1054898, di direttore NIH Nuova Innovator Award 1DP2OD007292 e un Istituto Wyss per biologicamente Ispirato Facoltà di Ingegneria Fondo di avvio (a PY) e Tsinghua-Pechino Center for Life Sciences Fund avvio (BW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Strands | Integrated DNA Technology | Section 3.1 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | Section 3.4.2 |
| Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | BIO-RAD | 731-6166 | Section 3.6 |
| Bruker's Sharp Nitride Lever Probes | Bruker AFM Probes | SNL10 | Section 4.3 |
| Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator | Invitrogen | G6600 | Section 3.6 |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428 000.414 | Section 3.6 |
| Transmission Electron Microscope | Jeol | Jem 1400 | Section 7.4 |
| Multimode 8 | Veeco | Section 4 | |
| Typhoon FLA 9000 Laser Scanner | GE Heathcare Life Sciences | 28-9558-08 | Section 3.5 |
| Ultrapure Distilled water | Invitrogen | 10977-023 | Section 3.7.1 |
| Mica disk | SPI Supplies | 12001-26-2 | Section 4.1 |
| Steel mounting disk | Ted Pella, Inc. | 16218 | Section 4.1 |
| carbon coated copper grid for TEM | Electron Microscopy Sciences | FCF400-Cu | Section 7.2 |
| tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 7.31 |
| glow discharge system | Quorum Technologies | K100X | Section 7.2 |
| DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler | BIO-RAD | PTC–0240G | Section 3.3 |
| Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | ThermoScientific | B2 | Section 3.4.3 |
| Seekam LE Agarose 500G | Lonza | 50004 | Section 3.4.1 |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp | ThermoScientific | SM1333 | Section 3.4.4 |
| Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer | ThermoScientific | Section 3.7 | |
| 0.2 um filter | Corning Inc. | 431219 | Section 7.1.2 |
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