Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Zelf-assemblage van Complex Tweedimensionaal Vormen van enkelstrengs DNA Tiles

Published: May 8, 2015 doi: 10.3791/52486
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 3Department of Systems Biology, Harvard Medical School

Introduction

Vorige nucleïnezuur zelf-assemblage 1-25 heeft geresulteerd in de bouw van een verscheidenheid aan complexe structuren, met inbegrip van DNA 2 - 5,8,10 - 13,17,23 of RNA 7,22 periodieke 3,4,7, 22 en algoritmische 5 tweedimensionale roosters, linten 10,12 en buizen 4,12,13, 3D kristallen 17, veelvlakken 11 en eindige, 2D-vormen 7,8. Een bijzonder effectieve methode is de steigers DNA-origami, waarbij een enkele steiger streng wordt gevouwen door vele korte extra nietje strengen om een complexe vorm 9,14 vormen - 16,18 - 21,25.

We hebben onlangs melding van een methode voor het construeren van discrete nanostructuren met voorgeschreven 2D-vormen met behulp van enkelstrengs tegels (SST), en toonde structuren met complexiteit vergelijkbaar met DNA-origami 26. Dit article is een aanpassing van onze eerdere werk 26 en beschrijft gedetailleerd protocollen voor het regelen van individueel adresseerbare SST in geavanceerde eindige 2D vormen met precies voorgeschreven afmetingen (breedte en lengte) en morfologie. Een belangrijk voordeel van de SST-methode is de modulariteit. Elk onderdeel SST van een structuur dient als een modulaire constructie-eenheid in de gemeente, en de verschillende subgroepen van deze SST produceren verschillende vormen. Zo hebben we een algemeen platform om nanostructuren met voorgeschreven maten en vormen van korte, synthetische DNA-strengen te bouwen.

SST bevatten vier domeinen, elk 10 of 11 nucleotiden lang (Figuur 1A). De SST binden zodanig dat hun parallelle spiralen creëren van een DNA-rooster bij elkaar gehouden door crossover verbanden. Elk crossover fosfaat tussen domeinen 2 en 3. De fosfaat kunstmatig gestrekt in de diagrammen voor visuele helderheid. De viaducten zijn verdeeld twee spiraalvormige bochten (21 basen) uit elkaar (<strong> Figuur 1B). De samengestelde rechthoeken worden door de afmetingen van het aantal helices en schroeflijnvormige windingen bedoeld. Bijvoorbeeld, een rechthoek die zes helices breed en acht spiraalvormige blijkt lang wordt genoemd een 6H x 8T rechthoek. SST kan worden weggelaten, toegevoegd of anderszins herschikt om structuren van willekeurige vormen en maten (figuur 1C) te creëren. Zo kan een rechthoekig ontwerp in een buis worden gerold met een gewenste lengte en radius (figuur 1D).

Alternatief kan de rechthoekige SST rooster worden beschouwd als een moleculaire canvas uit SST pixels, elk 3 nm van 7 nm. In dit onderzoek gebruiken we een moleculaire doek van 310 full-length interne SST, 24 full-length SSTs waaruit de linker en rechter grenzen en 28 halflange SSTs die de bovenste en onderste grenzen. Het doek heeft 24 dubbele helices verbonden door viaducten en elke helix bevat 28 spiraalvormige bochten (294 basen) en wordt daarom aangeduid alseen 24U × 28T rechthoekige canvas. De 24H x 28T canvas een molecuulgewicht vergelijkbaar met die van een DNA origami structuur samengesteld uit een M13-faag scaffold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA Sequence ontwerp

  1. Gebruik UNIQUIMER software 27 van een SST-eindige structuur te ontwerpen onder vermelding van het aantal dubbele helices, lengtes van boven- en onderkant helix voor elke dubbele helix, en de crossover patroon naar een 24U × 28T canvas te creëren. Na het definiëren van deze parameters, wordt de algemene architectuur (streng samenstelling en de complementariteit afspraak) grafisch geïllustreerd in het programma.
  2. Genereer sequenties van de strengen van de gespecificeerde structuur van de complementariteit inrichting en aanvullende eisen (indien aanwezig) te voldoen. Ontwerp van DNA-sequenties door het minimaliseren van de sequentie symmetrie 28 (voor de meeste constructies).
    1. Genereer nucleotiden (A, C, G en T) willekeurig één voor één.
    2. Match nucleotiden die complementair zijn aan die gegenereerd na de base-pairing regel: A naar T en vice versa; C naar G en vice versa.
    3. Laat herhalen segmenten niet gebruiken na acht of negen nucleotiden. Wanneer dergelijke rephet eten van segmenten ontstaan ​​tijdens het ontwerp, muteren de meest recent gegenereerd nucleotiden tot de eis herhalen-segment is voldaan.
    4. Gebruik geen vier opeenvolgende A, C, G of T bases.
    5. Met vooraf bepaalde nucleotiden aan het enkelstrengs verbindingspunten (bijvoorbeeld T en G als de eenentwintigste en tweeëntwintigste nucleotiden, respectievelijk voor de meeste van de draden) te voorkomen schuiven bases over de hefarmen (bijv indien beide eenentwintigste en tweeëntwintigste nucleotiden werden T, was het voor de eenentwintigste nucleotide te binden aan het nucleotide dat de tweeëntwintigste nucleotide wordt verondersteld te binden).
  3. Wijzigen DNA-sequenties hand gedurende streptavidine labeling, de omzetting van rechthoeken in buizen, de vorming van verschillende rechthoeken en pijpen in verschillende schalen en aggregatie veroorzaakt door blootstelling domeinen SST voorkomen.
    1. Vervang de blootgestelde gebieden op de grens van de moleculaire doek met poly-T tracts.
    2. Voor streptavidine labeling, het ontwerp van de hendel segmenten (de extra segment toegevoegd aan de component streng die kan binden aan een complementaire tegenhanger zoals een anti-handle streng) zodat zij kan een anti-handle streng met 3 'biotine modificatie.
    3. Voor de omzetting van een rechthoek in een buis, verwijdert de bovenste en onderste rijen van de rechthoek een land toevoegen waarvan SST specifieke complementair aan de overeenkomstige tegels op de tweede tot bovenste rij en de tweede rij naar beneden.
    4. Voor een blootgestelde enkelstrengs domein van verschillende vormen, te vervangen door poly-T segmenten van 10-11 nucleotiden lengte, of dekken door randbeschermers die complementair zijn aan de blootgestelde domein en eindigen met een 10-11 nucleotide lange poly-T segmenten.

2. Voorbereiding van de Molecular Canvas

  1. Verkrijgen van DNA-strengen onderdeel van bepaalde sequenties opgelost in RNase-vrij water uit een oligonucleotide fabrikant in V bodem platen met 96 putjes met oligonucleotiden gesynthetiseerd op een 10 nmol schaal met standaard ontzouting. Centrifugeer de 96 putjesplaten met de DNA-strengen voor ongeveer 10 seconden bij 600 x g.
    1. Pipetteer 1 pi van elk van de 362 putjes met DNA-strengen voor 24H x 28T rechthoek (figuur 3A) en 100 uM per streng (fabrikantspecificatie) in een 2 ml reageerbuis. Voeg 138 ul gedestilleerd gedeioniseerd H 2 O naar 2 ml reageerbuis tot een voorraadoplossing van de streng mengsel bij een concentratie van 200 nM per streng te maken.
  2. Voeg 50 ul van 200 nM voorraadoplossing van streng mengsel, 10 ui 10X annealing buffer A (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 250 mM MgCl2), en 40 pl gedestilleerd gedeioniseerd H 2 O een 0,2 ml PCR-buis. Dit maakt een 100 pi monster van de moleculaire doek in 1X annealing buffer A (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCl2).
  3. Gloeien de sample gedurende 17 uur in een thermische cycler koeling met 90 ° C tot 25 ° C. Programmeer de thermal cycler als volgt: uitloop van 90 ° C tot 61 ° C bij een constante snelheid van 5 ° C per min; uitloop van 60 ° C tot 25 ° C bij een constante snelheid van 20 ° C per min; en incuberen bij 4 ° C totdat het monster kan worden genomen van de thermische cycler.
  4. Bereid een inheemse 2% agarosegel.
    1. Meet 2,4 g agarose in een bekerglas van 600 ml. Voeg 120 ml 0,5X TBE buffer (44,5 mM Tris-boraat, pH 8,3, 1 mM EDTA) en 30 ml gedestilleerd gedeioniseerd water aan de beker.
    2. Magnetron 3 min (of 40-60 sec meer na het koken). Vullen de waterverlies tijdens verdamping door toevoeging van 30 ml water, dat helpt om de concentratie van agarose in de gel te handhaven op 2%.
    3. Zwenk de inhoud van het bekerglas gedurende 1 minuut in een koud waterbad. Voeg 1 ml 1,2 M MgCl2 (een 10 mM MgCl2-concentratie in de gel te maken) en pre-vlekken op de gel with 6 pi SYBR Safe kleurstof (1: 20.000).
    4. Giet de gel oplossing in een droge gel doos en plaats een 1,5 mm dik 12 goed gelelektroforese kam. Laat de oplossing stollen gedurende 15-30 minuten op een vlakke platform.
    5. Giet gel running buffer (44,5 mM Tris-boraat, pH 8,3, 1 mM EDTA en 10 mM MgCl2) in de doos gel. Load 2-3 pl 1 kb DNA ladder in een putje van de agarose gel. Meng 4 ui 6X broomfenolblauw kleurstof (0,25% broomfenolblauw, 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 en 30% glycerol) met 20 gl van het monster van de moleculaire doek en plaats de oplossing in een putje van de agarose gel.
  5. Voer de inheemse 2% agarose gedurende 2 uur bij 100 V in een ijswaterbad (broomfenolblauw, weergegeven in blauw, loopt sneller dan component strengen, zodat het kan dienen als een indicator dat als 2 uur looptijd is van toepassing).
  6. Afbeelding de gel onder toepassing van een gel scanner met een geschikt filter voor de SYBR veilige vlek (Figuur 2B
  7. Op een blauw licht transilluminator, accijnzen de dominante band met dezelfde mobiliteit om de band van 1500 basenparen van het 1 kb DNA-ladder met een scherp schone scheermesje. Plaats het gewenste gel stuk (s) in een spin kolom gaan plet de gel in kleine stukjes met een microbuis stamper. Centrifugeer bij 438 xg gedurende 3 min bij 4 ° C.
  8. Meet de concentratie van het DNA onder toepassing van een UV spectrofotometer bij 260 nm.
    1. Gebruik 2 pl ultrapuur DNase / RNase-vrij gedestilleerd water als het leeg om de machine te kalibreren.
    2. Gebruik een equivalent volume van het verzamelde monster uit de spin kolom een ​​schatting van de DNA-concentratie te krijgen. De gemeten concentratiewaarde ("a" = ng / ul), verkregen met een UV-absorptie van 260 nm zal helpen de verdunningsfactor van AFM en TEM beeldvorming.
    3. Zet de gemeten concentratie van "a" (ng / pl) met "b" (nM) na b = a x 10 6 / (330 &# 215; aantal nucleotiden).
      Opmerking: Het molecuulgewicht van een nucleotide is 330 g / mol. De berekende molaire concentratie waarde zal de verdunningsfactor voor de AFM en TEM beeldvorming te bepalen. Zoals in het geval van een 24H x 28T rechthoek, een gemeenschappelijke meting van het gezuiverde monster ongeveer 10-60 ng / ul. Naarmate het aantal nucleotiden van een dergelijke structuur is 14.616 Da, de molaire concentratie van ongeveer 2-12 nM. De uiteindelijke concentratie wordt bepaald door het ophalen opbrengst (~ 20-50%) van centrifugatie en het volume van de gel uitgesneden band uit (hoe hoger het volume, des te verdunnen gezuiverd monster).

3. Atomic Force Microscopy Imaging

  1. Afpellen mica bevestigd aan een monster metalen schijf met plakband op een vlakke ondergrond te krijgen en leg het monster schijf op de imaging podium.
  2. Voeg 40 ul 1X annealing buffer A gevolgd door 5 pl (2-5 nM) van het gezuiverde monster van het 24H x 28Trechthoek om de vers gesplitst mica ondergrond. Laat het mengsel te regelen voor ongeveer 2 min.
  3. Installeer AFM siliciumnitride cantilever chip op een cantilever houder. Gebruik een C driehoekige tip (resonantiefrequentie, f 0 = 40-75 kHz; veerconstante, k = 0,24 Nm -1) voor de beeldvorming.
  4. Afbeelding van een monster in de vloeistof tapping mode. Gebruik de volgende imaging parameters voor het scannen: scan grootte van 2 micrometer, 1024 lijnen voor de resolutie, en een scansnelheid van 0,5-1 Hz (figuur 2C).
  5. Indien nodig, voeg 10 ul of meer van 10 mM NiCl2 oplossing voor de sterkte van het DNA-bindende mica 29 verhogen.

4. Monstervoorbereiding voor Streptavidine Labeling

  1. Handmatig ontwerp 24H x 28T rechthoek zodat handgreep strengen op specifieke locaties worden opgenomen complementair aan het anti-handle strengen met biotine modificatie, die op hun beurt kunnen binden aan streptavid tein het bijzonder.
    1. Wijzig de moleculaire doek door het aanbrengen van een 3 '17 nucleotide segment dat bestaat uit een twee-nucleotidensequentie (TT) als een afstandhouder en een 15-nucleotide handgreep (GGAAGGGATGGAGGA) naar de 14 tegels op de bovenste rij dakpannen 14 op de bodem rij van de rechthoek (figuur 3A) de rand labelen. Deze sequentie is complementair aan een 3'-biotine-gemodificeerde anti-handle streng (TCCTCCATCCCTTCC-biotine).
  2. Voor interne labeling, bevestig de 3 '17 nucleotide segment tot 8 interne tegels en 6 grens tegels van de rechthoek (Figuur 4A).
    1. Meng de 28 strengen met handvatten (boundary labeling) met de rest van de component onderdelen van het 24H x 28T rechthoek (334 draden) om 200 nM voorraadoplossing te maken. Meng de 14 strengen met handvatten (interne labeling) met de rest van de component onderdelen van het 24H x 28T rechthoek (348 draden) om 200 nM voorraadoplossing te verkrijgen.
  3. Voor boundary labeling, voeg 50 ul van 200 nM voorraadoplossing van de strengen, 6 ul van 100 uM biotine gemodificeerde anti-handle strengen, 10 ui 10X de annealing buffer A, en 34 pl gedestilleerd gedeïoniseerd water om een ​​0,1-0,2 ml PCR reageerbuis. De uiteindelijke concentratie van de component streng 100 nM en de uiteindelijke concentratie van het anti-handle biotine gemodificeerde streng 6.000 nM. Merk op dat de 28 moleculen van het anti-biotine-gemodificeerde streng handgreep binden aan een 24H x 28T rechthoek, zodat de anti-handgreep biotine gemodificeerde streng dan 100% met de binding gunstige maken.
  4. Bij interne labeling, voeg 50 ul van 200 nM voorraadoplossing van de strengen, 3 ul van de interne anti-handgreep biotine gemodificeerde streng van 100 uM, 10 ui 10X de annealing buffer A, 37 pl gedestilleerd gedeïoniseerd water om een ​​0,1 - 0,2 ml PCR reageerbuis. De uiteindelijke concentratie van de component streng 100 nM en de uiteindelijke concentratie van het anti-handle biotine wijzi ed streng is 3000 nM. Merk op dat 14 moleculen van de anti-handle biotine-gemodificeerde streng binden aan een 24H x 28T rechthoek geplaatst anti-biotine-gemodificeerde handgreep streng dan 100% met de binding gunstige maken.
  5. Hybridiseren beide monsters in een thermische cycler voor 17 uur met de stappen in 2.3 beschreven.
  6. Bereid een natieve 2% agarosegel zoals beschreven in stap 2.4.
  7. Zuiver beide monsters zoals beschreven in de stappen 2.5.
  8. Meet de concentratie van de gewenste DNA structuren zoals beschreven in stap 2.6.

5. Atomic Force Microscopy Voor Streptavidine Labeling

  1. Afbeelding elk monster met behulp van een AFM, zoals beschreven in stap 3 (Figuren 3B en 4B).
  2. Na de eerste ronde van beeldvorming, voeg 40 ul 1X annealing buffer A gevolgd door 1 ul streptavidine bij 10 mg / ml aan het monster. Laat het mengsel te regelen voor ongeveer 2 minuten voordat reimaging (Figuren 3C en 4C).
_title "> 6. Het omzetten van een rechthoek in een buis

  1. Om een ​​buis op basis van rechthoekig ontwerp, houdt alle bestanddelen SST plaats behalve de bovenste en onderste rijen. Invoering van een nieuwe rij waarvan SST ontworpen door aaneenschakeling van de bovenste en onderste halve tegels hun respectievelijke kolommen oorspronkelijke rechthoek in een buis conformatie (figuur 5A) cycliseren.
  2. Meng de nieuwe rij strengen (14 draden) met de component onderdelen van het 24H x 28T rechthoek zonder de bovenste en onderste rijen (336 draden) om 200 nM voorraadoplossing te verkrijgen.
  3. Volg de gel zuivering stappen 2,2-2,7 (Figuur 5B).

7. Transmission Electron Microscope Imaging

  1. Weeg 0,06 g uranyl formate in 3 ml gedestilleerd water om een ​​2% waterige uranyl formate kleuroplossing bereiden. Filter de 2% waterige uranyl formate kleuroplossing met een 0,2 pm filter bevestigd aan een injectiespuit.
    1. Voeg 5 gl5 N NaOH tot 1 ml gefiltreerde kleuroplossing. Kort vortex de oplossing en centrifugeer bij 20.000 x g.
  2. Glimontlading de koolstof beklede roosters (gecoate zijde naar boven) met de volgende instellingen: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar, en negatieve High Tension polariteit.
  3. Gebruik zelfsluitende tang om een ​​gloed lozer behandeld rooster van de rand te grijpen.
  4. Pipet 3,5 ul van het monster op de grid voor 4 min. Gebruik een stuk filtreerpapier lont uit het monster waardoor het filtreerpapier in contact met het rooster van de zijkant.
  5. Voeg onmiddellijk 3,5 ul van de kleuroplossing op het rooster gedurende 1 min.
  6. Lont uit de vlek zoals in 7.4 en houd de filter papier tegen de grid voor 1-2 min.
  7. Breng de grid naar een TEM monster houder en beeld met behulp van een JEOL JEM-1400 werkt bij 80 kV met een vergroting van 10 K tot 80 K (figuur 5C).

8. De bouw van willekeurige vormen die molecular Canvas

  1. Identificeer vorm en selecteer de strengen die overeenkomen met de vorm van de moleculaire doek. Voor een driehoek vorm bijvoorbeeld, selecteert u 206 uit 362 onderdelen voor de moleculaire doek.
  2. Vervang het blootgestelde gebied (dat wil zeggen, langs de schuine zijde) met een poly-T segment 10-11 nucleotiden lang (design 1 in figuur 6A), en voeg een randbeschermer die complementair is aan het blootgestelde gebied en eindigen met een 10 - 11 nucleotide lange poly-T segment (design 2 in figuur 6A) om aggregatie te voorkomen.
    OPMERKING: gewoon annealen SST die overeenkomen met de pixels van de driehoek (zonder protector draden) leidt tot aggregatie en geen duidelijke productband vorming op een gel. Gebruik de randbeschermer ontwerp voor verschillende vormen zoals het is efficiënter gebruik van hulpbronnen; het vereist slechts vier aanvullende sets strengen (figuur 6C) in vergelijking met 14 andere sets vervanging ontwerp (Figure 6B).
  3. Maak een streng bibliotheek voor de 310-pixel moleculaire doek waarop de kernset (de 362 SST canvas), Set 1 * (randbeschermers die zich binden aan domein 1 van een SST), Set 2 * (randbeschermers die zich binden aan domein 2 omvat van een SST), Set 3 * (randbeschermers die zich binden aan domein 3 van een SST) en Set 4 * (randbeschermers die zich binden aan domein 4 van een SST) tot een totaal van 1344 hoekprofielen geven.
  4. Centrifugeer de 96 well platen voor de verschillende reeksen van ongeveer 10 s. Pipet de gewenste onderdelen van de platen om een ​​voorraad oplossing voor een bepaalde vorm te maken.
    1. Voor de vorm van een driehoek met randbeschermers, pipet 1 pl van 206 strengen uit de kern set, 0 van set 1 *, 0 van set 2 *, 0 van set 3 * en 24 strengen van set 4 * in een 2 ml centrifuge buis. Voeg 20 ul gedestilleerd gedeioniseerd water aan de buis met een 400 nM voorraadoplossing van de DNA strengen te maken.
  5. Voeg 50 ul van 400 nM voorraadoplossing van DNA stra NDS, 10 ui 10X de annealing buffer B (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 125 mM MgCl2) voorraadoplossing en 40 pl gedestilleerd gedeioniseerd H 2 O een 0,2 ml PCR buis. Dit maakt een 100 pi monster van de driehoek in 1X annealing buffer B (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl2) met draden met een concentratie van ongeveer 200 nM per streng.
  6. Hybridiseren van het mengsel in een thermische cycler voor 17 uur zoals beschreven in stap 2.3.
  7. Bereid een natieve 2% agarosegel zoals beschreven in stap 2.4.
  8. Zuiver het monster zoals beschreven in stap 2.5.
  9. Meet de concentratie van het DNA zoals beschreven in stap 2.6.
  10. Afbeelding het monster onder AFM zoals beschreven in stap 3 (Figuur 7C en 7D).
  11. Pick en mix strengen voor verschillende vormen met dezelfde streng bibliotheek. Gloeien de verschillende oplossingen en combineer gezuiverde monsters van verschillende vormen om tijd te besparen tijdens de AFM beeldvorming.
jove_title "> 9 Optioneel:. Robot Automatisering van Shape Design en Liquid Mixing

  1. Een aangepaste MATLAB programma om het ontwerp van complexe vormen steun.
  2. Met de software instructies te leveren in de vorm van een sequentie pipetteren een robot vloeistofmanipulator. Gebruik de robot vloeistof handler te selecteren en meng de strengen die het doel vorm te vormen.
    OPMERKING: Vorm ontwerp en streng mengen werd geautomatiseerd om menselijke fouten te verminderen en de bouw minder arbeidsintensief.

10. rechthoeken en Tubes Across verschillende schalen

  1. Construct verschillende grootte rechthoeken (figuur 10) door eenvoudig veranderen van het aantal parallelle helices (H) en het aantal spiraalvormige windingen (T).
  2. Volg Stap 3 om een ​​bepaalde grootte rechthoek.
  3. Voer stap 6 voor een specifiek groottebuis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De zelf-assemblage van SST (figuur 1) een 24H x 28T rechthoek verkregen, zie figuur 2. DNA-sequenties voor de verschillende SST kan worden aangepast / geoptimaliseerd streptavidine labeling mogelijk (figuur 3 en 4), de transformatie van een rechthoek in een buis (figuur 5), de programmeerbare zelfassemblage van SSTs buizen en rechthoeken van verschillende afmetingen (figuur 10) te vormen en de constructie van 2D willekeurige vormen die moleculaire doek (figuur 8). Twee ontwerpen (domain substitutie ontwerp en randbescherming design) werden getest als oplossingen voor aggregatie langs blootgestelde gebieden van willekeurige vorm (figuur 7). Beide ontwerpen hebben vergelijkbare gel opbrengst en structurele integriteit, maar de randbeschermer ontwerp kosteneffectiever omdat daarvoor minder hulpstoffen species (Figuur 6).Strand picking en mengen kan worden geautomatiseerd, zoals getoond in figuren 9 menselijke fouten worden bespaard.

Figuur 1
Figuur 1. Zelf-assemblage van Moleculaire Vormen behulp Enkelstrengs Tegels. (A) De canonieke SST motief, aangepast van 12 (B) links en midden:. Twee afbeeldingen van geassembleerde SST. Inner SST een volle lengte van 42 basen en zijn gelabeld met "U" terwijl boundary SST hebben 21 bases en zijn gelabeld met "L". In het linker diagram, kleuren onderscheiden verschillende domeinen. In het midden diagram, kleuren onderscheiden verschillende strengen. Rechts: Een schematische weergave van de muur gezien SST structuren. Dikke stenen zijn vol SST en dun bakstenen zijn grens SST. Afgeronde hoeken geven geen complementaire paring. Zoals in de middelste figuur, kleuren onderscheiden individuele tegels. In alle diagrammen, elke tegel een unieke sequentie. (C) het achterhouden van een passende selectie van strengen uit de SST collectie waaruit de rechthoekontwerp in figuur B resulteert in de vorming van een andere gewenste vorm zoals een driehoek (links) of een rechthoekige ring (rechts). (D) Het ontwerp van een buis met een vooraf bepaalde breedte en lengte. (E) Aangezien een vooraf gesynthetiseerde pool van SST sequenties (bovenste), willekeurige vorm (onder) kan worden gemaakt door het kiezen van een subset van strengen te gebruiken in de streng mengsel (donkerblauw pixels) en het elimineren van de rest (lichtblauw pixels). Dit cijfer is aangepast van een eerder gepubliceerde cijfer 26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Ontwerp en AFM afbeelding van de 24H × 28T rechthoek. (A) Schematische tekening van de 24H x 28T rechthoek. Een ingezoomde uitzicht wordt ook getoond voor de gedetailleerde lokale structuur. De individuele SST segment arrangement is ofwel 10 nt - 11 nt - 11 nt - 10 nt (bv A2.13-B2.13-a1.13 * -b1.12 *) of 11 nt - 10 nt- 10 nt - 11 nt (bv A3.12-b3.12-A2.13 * -b2.12 *). Driehoeken aan de linker kant van de rechthoek aan te geven rijen met een 10nt-11nt-11nt-10nt SST regeling; de andere interne SST hebben 11 nt - 10 nt -10 nt- 11 nt plaats (nt is een acroniem voor nucleotide). Aangezien 24H x 28T SST rechthoek heeft dezelfde afmetingen zijn die een DNA origami structuur criterium geïntroduceerd in de DNA origami werkzaamheden en overweeg een SST rechthoek "well-formed" als het geen defect in de verwachte omtrek groter dan 15 nm in diameter was aangenomen. Daarnaast is er een "goed gevormd" rechthoek structuur hais geen gaatjes in het interieur groter dan 10 nm in diameter was vereist. Gezien het bovenstaande criteria, een "well-formation" verhouding van 55% (N = 163) werd verkregen. Een rood sterretje (*) geeft de linkerbenedenhoek van de rechthoek hier. (B) 2% inheemse agarosegelelektroforese. U, ongezuiverd; P, gezuiverd (door gel-extractie uit lane U) (C) AFM beeld van het rooster structuur. (Scanning grootte: 2 micrometer × 2 micrometer). Dit cijfer is aangepast van een eerder gepubliceerde cijfer 26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Boundary Merken van 24H x 28T Rectangle. (A) Schematische tekening van de specifieke biOtin-gemerkte 24H x 28T rechthoek. De strengen in het blauw zijn de hendel strengen. De strengen gemarkeerd in het rood zijn de anti-handvat strengen gelabeld met 3 'biotine (zwarte stippen). Streptavidine wordt afbeelding (B) AFM afgeschilderd als een oranje bal voor het toevoegen van streptavidine (scanformaat: 1 micrometer × 1 micrometer).. (C) AFM image na toevoeging van streptavidine (scanformaat: 1 micrometer × 1 micrometer). Inzet, een ingezoomde aanzicht succesvolle etikettering. Merk op dat streptavidine verscheen als ofwel witte stippen of strepen als gevolg van hun verhoogde hoogten. Dit cijfer is aangepast van een eerder gepubliceerde cijfer 26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Inexterne Labeling van 24U × 28T rechthoek. (A) Schematische tekening van de specifieke biotine gemerkte 24H x 28T rechthoek. De strengen in het blauw zijn de hendel strengen. De strengen gemarkeerd in het rood zijn de anti-handvat strengen gelabeld met 3 'biotine (zwarte stippen). Streptavidine wordt afbeelding (B) AFM afgeschilderd als een oranje bal voor het toevoegen van streptavidine (scanformaat: 1 micrometer × 1 micrometer).. (C) AFM image na toevoeging van streptavidine (scanformaat: 1 micrometer × 1 micrometer). Inzet, een ingezoomde aanzicht succesvolle etikettering. Merk op dat streptavidine verscheen hetzij als witte stippen of strepen te wijten aan de verhoogde hoogten. Dit cijfer is aangepast van een eerder gepubliceerde cijfer 26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

in-page = "always"> Figuur 5
Figuur 5. Ontwerp en TEM afbeelding van de 24H × 28T Tube. (A) Schematische tekening van de 24H x 28T vat. Twee ingezoomde uitzicht op de top en de bodem toon details segment identiteiten. Merk op dat segmenten a24.x * (bijv a24.13 *) en b24.x * (bijv b24.12 *) van de bovenste rij zijn complementair aan segmenten a24.x (bijv a24.13) en b24.x (bv b24.12) van de onderste rij; deze complementariteit zal naar verwachting resulteren in de vorming van de buisvormige structuur. (B) 2% natief agarosegelelektroforese. U, ongezuiverd; P, gezuiverd (door gel-extractie uit lane U) (C) TEM beeld van het vat structuur (schaal bar: 100 nm).. Dit cijfer is aangepast van een eerder gepubliceerde cijfer 26.ighres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. twee ontwerpen te voorkomen Aggregation Veroorzaakt door Exposed Sticky Domeinen. (A) Een side-by-side demonstratie van twee methoden ook bij blootgestelde gebieden. De ongepaarde kleverige domein (domein 4) wordt aangegeven met een rode, gestippelde doos. Ontwerp 1 is het domein substitutie ontwerp, waarbij het ongepaarde domein wordt gesubstitueerd door een poly-T domein (getoond in rood en het label "T"). Ontwerp 2 is de rand beschermer ontwerp, wat inhoudt dat met betrekking tot de ongepaarde domein met een rand beschermer streng (in rood weergegeven en het label "T-4 *"). De randbeschermer streng bestaat uit een poly-T sectie en aanvulling van het blootgestelde gebied. (B) De verschillende mogelijke grens configuraties die bij domain substitutie (design 1).Er zijn 14 verschillende manieren om een ​​interne SST (weergegeven in blauw) kan een blootgesteld domein of domeinen vertrekken. De juiste streng substituties worden getoond in rood voor elke situatie. (C) De randbeschermer design (ontwerp 2). Een interne SST (blauw) vereist slechts vier randbeschermer strengen (rood) aan blootgesteld domeinen met dit ontwerp te dekken. Dit cijfer is aangepast van een eerder gepubliceerde cijfer 26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7
Figuur 7. Twee ontwerpen voor de SST Driehoek. (A) en (B) verbeelden schema's op basis van het ontwerp 1 (domein substitutie) en het ontwerp 2 (randbeschermer) in figuur 8, respectievelijk. Een poly-T regio (T10 of T11 in de figuur) wordt afgebeeld alseen afgeronde hoek in het blokschema. De inzet toont een vergroot aanzicht van de structuur weergegeven met de gestippelde rechthoek. Schaalbalken, 100 nm. (C) en (D) zijn de AFM afbeeldingen. Dit cijfer is aangepast van een eerder gepubliceerde cijfer 26.

Figuur 8
Figuur 8. Diagrams en AFM afbeeldingen van 100 verschillende vormen. Structuur ontwerpen worden getoond in de bovenste panelen. Lichtblauwe kleuren geeft het doek strengen weggelaten uit het mengsel, terwijl donkerblauw kleuren geeft de strengen inbegrepen. Voor de duidelijkheid zijn randbeschermer strengen weggelaten. Een bijbehorende AFM beeld van elke structuur is hieronder zijn ontwerp getoond. Elk beeld is 150 nm × 150 nm in het gebied. Er zijn 100 unieke vormen. Inbegrepen zijn 10 Arabische cijfers, de 26 hoofdletters van het Latijnse alfabet, 23 leestekens en keyboard symbolen, 10 emoticons, 9 astrologische symbolen, 6 Chinese karakters, en een aantal diverse symbolen. Dit cijfer is aangepast van een eerder gepubliceerde cijfer 26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9
Figuur 9. Robot Automation Flow Diagram. Dit schema toont de gebruikt om het mengen proces te automatiseren workflow. Eerst wordt een aangepaste MATLAB programma gebruikt om de gewenste vorm te ontwerpen. Nogmaals, donkerblauwe rechthoeken geven de strengen moeten worden opgenomen in het mengsel. Nadat het ontwerp is voltooid, het programma voert een reeks van pipetteren instructies voor de robot vloeistof handler. De robot pipetten de juiste concentraties van de juiste onderdelen voor een bepaalde vorm in een plate ook. Het mengsel ondergaat vervolgens een pot gloeien gevolgd door AFM afbeelding van het resulterende shapes. (Dit cijfer is aangepast van een eerder gepubliceerde cijfer 26). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10
Figuur 10. Self-Assembly van rechthoeken en Tubes Across verschillende schalen. (A) AFM afbeeldingen SST rechthoeken met de volgende ontworpen afmetingen (van links naar rechts):. 4H x 4T, 6H × 7T, 10H x 10T, 14T x 12H, 18H x 20T, 28T x 24H en 36H x 34T ( B) De molecuulgewichten van de structuur op een logaritmische schaal. De asterisk geeft het gewicht van een typische M13 DNA origami structuur als referentie. (C) TEM beeldenvan SST buizen met de volgende ontworpen afmetingen (van links naar rechts): 8H x 28T, 55T x 8H, 8H x 84T, 28T x 24H en 12H x 177T. Alle schaal bars tonen 100 nm. Dit cijfer is aangepast van een eerder gepubliceerde cijfer 26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In de structuurvorming stap is het belangrijk om de juiste concentratie van magnesium kationen houden (bijv., 15 mM) in de DNA-streng mengsel zelfassemblage DNA nanostructuren. Ook in het agarose gel karakterisatie / zuiveringsstap is het belangrijk een geschikte magnesium kation concentratie te houden (bijv., 10 mM) in de gel en de gel loopbuffer om het DNA nanostructuren tijdens elektroforese behouden. Voor 24H x 28T rechthoek structuur, testten we gloeien in verschillende concentraties Mg ++ en vond dat de structuur typisch gevormd in het traject van 10-30 mM Mg ++ (met alle formatie rendement met ongeveer 20 mM Mg ++).

In tegenstelling tot de steigers origami structuur, de SST structuur heeft een modulaire architectuur. Verschillende vormen kunnen worden gemaakt van dezelfde canvas door de juiste deelverzameling van SST tegels. Bovendien wordt het SST structuur weer gemonteerdm slechts korte synthetische DNA-strengen en geen lange scaffold die wordt gebruikt in de Origami aanpak omvatten. Daarom wordt de grootte van de SST structuur niet beperkt door de lengte van de beschikbare scaffold. Hoewel DNA Origami benadering vaak worden geoptimaliseerd om ofwel gevouwen of ongevouwen structuren monomeren produceren SST kan leiden tot gedeeltelijk gevormde structuren en kan dus gelzuivering voor later gebruik vereisen. Bovendien, door het ontbreken van een scaffold streng kan een SST structuur more 'broos' dan zijn tegenhanger DNA origami. Zowel de SST aanpak en de DNA-origami aanpak zijn snel evolueren, en een gebruiker wordt aangeraden om een ​​aanpak die het beste past bij zijn of haar specifieke functionele behoeften te kiezen.

Opvallend is dat honderden kleine monomeren gemedieerd alleen door lokale binding interacties kunnen zichzelf assembleren tot een voorgeschreven globale vorm, zoals aangetoond door de SST aanpak. De fundamentele principes in de SST aanpak should generaliseerbaar naar materialen naast de DNA-strengen, en de basis-methode beschreven in dit artikel worden, na een passende wijziging, moet de bouw van complexe structuren zichzelf samengesteld uit diverse materialen mogelijk te maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door het Office of Naval Research Young Investigator Program Award N000141110914, Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF LOOPBAAN Award CCF1054898, NIH directeur Nieuwe Innovator Award 1DP2OD007292 en een Wyss Instituut voor biologisch geïnspireerde Faculteit Startup Fund (tot PY) en Tsinghua-Peking Centrum voor Life Sciences Startup Fonds (BW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA Strands  Integrated DNA Technology Section 3.1
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen S33102 Section 3.4.2
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns BIO-RAD 731-6166 Section 3.6
Bruker's Sharp Nitride Lever Probes Bruker AFM Probes SNL10 Section 4.3
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator Invitrogen G6600 Section 3.6
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428 000.414 Section 3.6
Transmission Electron Microscope  Jeol Jem 1400 Section 7.4
Multimode 8 Veeco Section 4
Typhoon FLA 9000 Laser Scanner GE Heathcare Life Sciences 28-9558-08 Section 3.5
Ultrapure Distilled water Invitrogen 10977-023 Section 3.7.1
Mica disk SPI Supplies 12001-26-2 Section 4.1
Steel mounting disk Ted Pella, Inc. 16218 Section 4.1
carbon coated copper grid for TEM Electron Microscopy Sciences FCF400-Cu Section 7.2
tweezers Dumont 0203-N5AC-PO Section 7.31
glow discharge system Quorum Technologies K100X Section 7.2
DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler BIO-RAD PTC–0240G Section 3.3
Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems ThermoScientific B2 Section 3.4.3
Seekam LE Agarose 500G Lonza 50004 Section 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp ThermoScientific SM1333 Section 3.4.4
Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer ThermoScientific Section 3.7
0.2 um filter Corning Inc. 431219 Section 7.1.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
  2. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  3. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2 (12), e424 (2004).
  6. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
  7. Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
  8. Park, S. H., et al. Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures. Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).
  9. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  10. Schulman, R., Winfree, E. Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).
  11. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
  12. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  13. Sharma, J., et al. Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles. Science. 323 (5910), 112-116 (2009).
  14. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  15. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
  16. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  17. Zheng, J. P., et al. From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D. DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).
  18. Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
  19. Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline two-dimensional DNA origami arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).
  20. Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames. Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).
  21. Woo, S., Rothemund, P. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).
  22. Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
  23. Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures. ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).
  24. Seeman, N. C. Nanomaterials based on DNA. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).
  25. Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures. Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).
  26. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  27. Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly. J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).
  28. Seeman, N. C. De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering. J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).
  29. Hansma, H. G., Laney, D. E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy. Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).
  30. Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. Enzyme-free nucleic acid logic circuits. Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).
  31. Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. Programming biomolecular self-assembly pathways. Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).

Tags

Chemistry zelfassemblage DNA tegels enkelstrengs tegels moleculaire canvas moleculaire pixel programmeerbare nanostructuren DNA nanotechnologie
Zelf-assemblage van Complex Tweedimensionaal Vormen van enkelstrengs DNA Tiles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, B., Vhudzijena, M. K.,… More

Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles. J. Vis. Exp. (99), e52486, doi:10.3791/52486 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter