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Chemistry

Die Selbstorganisation von Complex zweidimensionale Formen von Einzelstrang-DNA-Fliesen

Published: May 8, 2015 doi: 10.3791/52486
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 3Department of Systems Biology, Harvard Medical School

Introduction

5,8,10 - - vorherige Nukleinsäureselbstmontagearbeiten 1-25 hat zur erfolgreichen Aufbau einer Vielzahl von komplexen Strukturen, einschließlich DNA 2 geführt 13,17,23 oder RNA 7,22 periodischen 3,4,7, 22 und algorithmische 5 zweidimensionalen Gittern, Bänder 10,12 und Röhren 4,12,13, 3D-Kristalle 17, 11 Polyeder und endlich, 2D-Formen 7,8. Ein besonders wirksames Verfahren ist eingerüstet DNA-Origami, wobei eine einzelne Gerüststrang wird durch viele kleine Hilfsklammer Stränge gefaltet, um eine komplexe Form zu bilden 9,14 - 16,18 - 21,25.

Vor kurzem berichteten wir ein Verfahren zum Konstruieren diskrete Nanostrukturen mit vorgegebenen 2D-Formen unter Verwendung von Einzelstrang-Fliesen (SST), und zeigte Strukturen Komplexität vergleichbar Origami 26. Diese article ist eine Anpassung unserer früheren Arbeit 26 und enthält detaillierte Protokolle für die Anordnung einzeln adressierbaren SSTs in anspruchsvolle Finite 2D-Formen mit genau vorgeschriebenen Abmessungen (Breite und Länge) und Morphologien. Ein entscheidender Vorteil des SST-Methode ist seine Modularität. Jede Komponente SST einer Struktur dient als modulares Bauteil in der Baugruppe, und unterschiedliche Untergruppen von diesen SSTs produzieren unterschiedliche Formen. Daher haben wir eine allgemeine Plattform, um Nanostrukturen mit vorgegebenen Größen und Formen von kurzen, synthetischen DNA-Stränge zu konstruieren.

SSTs enthält vier Domänen, die jeweils 10 oder 11 Nukleotide lang ist (Figur 1A). Die SSTs binden, so dass ihre parallelen Helices schaffen eine DNA Gitter von Crossover-Bindungen zusammengehalten werden. Jede Überkreuzung der Phosphat zwischen den Domänen 2 und 3. Das Phosphat wird künstlich in den Diagrammen für klare gestreckt. Die Frequenzweichen sind beabstandet zwei Helixwindungen (21 Basen) auseinander (<strong> 1B). Die Verbundrechtecke werden durch ihre Abmessungen der Anzahl der Helices und Wendelgänge bezeichnet. Zum Beispiel, die ein Rechteck sechs Helices breit und acht Schrauben dreht lange als 6H × 8T Rechteck verwiesen. SSTs kann weggelassen werden, hinzugefügt, oder auf andere Weise neu angeordnet, um Strukturen von beliebigen Formen und Größen (1C) zu erstellen. Beispielsweise kann eine rechteckige Gestaltung zu einem Rohr mit gewünschter Länge und Radius (1D) gerollt werden.

Alternativ dazu kann die rechteckige Gitter SST als Molekular Leinwand aus SST Pixeln, jeweils 3 nm von 7 nm betrachtet werden. In dieser Studie verwenden wir ein Molekular Leinwand von 310 in voller Länge internen SSTs, 24 voller Länge SSTs, aus denen die linken und rechten Grenzen, und 28 halbe Länge SSTs Bildung der oberen und unteren Grenzen. Die Leinwand hat 24 Doppelhelix durch Frequenzweichen verbunden und jede Helix enthält 28 Helixwindungen (294 Basen) und wird daher bezeichnet alsa 24H × 28T rechteckigen Leinwand. Die 24H × 28T Leinwand hat ein Molekulargewicht ähnlich der von einer DNA-Origami-Struktur aus einem M13-Phagen Gerüst erstellt.

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Protocol

1. DNA Reihenfolgen-Entwurf

  1. Verwenden UNIQUIMER Software 27 einen SST-finite Struktur durch die Angabe der Anzahl der Doppelhelix, Längen von oben und unten Helix für jede Doppelhelix und die Crossover-Muster, um ein 24H × 28T Leinwand erstellen zu entwerfen. Nach der Definition dieser Parameter wird die Gesamtarchitektur (Strang-Zusammensetzung und die Komplementarität Anordnung) graphisch im Programm veranschaulicht.
  2. Erzeugen eine Folge für die Stränge der angegebenen Struktur, um die Komplementarität Anordnung und zusätzliche Anforderungen (falls vorhanden) zu erfüllen. Design-DNA-Sequenzen durch die Minimierung der Sequenzsymmetrie 28 (für die meisten Strukturen).
    1. Erzeugen Nukleotide (A, C, G und T) nach dem Zufallsprinzip einer nach dem anderen.
    2. Spiel Nukleotide komplementär zu denen erzeugt nach dem Basenpaarungsregel: von A bis T und umgekehrt; C bis G und umgekehrt.
    3. Verwenden Sie keine sich wiederholenden Segmenten über acht oder neun Nukleotiden. Wenn solche repEssen Segmente bei der Konstruktion entstehen, mutieren die zuletzt erzeugten Nukleotide, bis der sich wiederholenden Segmenten Anforderung erfüllt ist.
    4. Verwenden Sie keine vier aufeinander folgenden A, C, G oder T-Basen.
    5. Verwenden vorgegebenen Nukleotide an den einzelsträngigen Anlenkpunkte (zum Beispiel T und G wie die einundzwanzigsten und zweiundzwanzigsten Nukleotiden, jeweils für die meisten der Stränge), um zu vermeiden Gleitunterlagen um die Anlenkpunkte (beispielsweise, wenn sowohl einundzwanzigste und zweiundzwanzigste Nukleotide T, es möglich war, das einundzwanzigste Nucleotid an das Nukleotid bindet, dass der zweiundzwanzigsten Nukleotid soll, zu binden).
  3. DNA-Sequenzen zu modifizieren manuell Streptavidin Kennzeichnung, die Transformation von Rechtecken in Röhrchen, die Bildung von verschiedenen Rechtecken und Röhren in verschiedenen Maßstäben und die Aggregation durch freiliegende Bereiche auf SST verhindern.
    1. Ersetzen Sie die freiliegenden Bereiche auf der Grenze des Molekular Leinwand mit Poly-T-tracts.
    2. Für Streptavidin Kennzeichnung, entwerfen die Griffsegmente (das zusätzliche Segment mit dem Bauteil-Strang, der mit einem komplementären Gegenstück wie einem Anti-handle Stranges binden können angehängt), so dass sie eine Anti-handle Strang mit 3'-Biotin-Modifikation unterzubringen.
    3. Für die Umwandlung von einem Rechteck in ein Rohr, entfernen Sie die oberen und unteren Zeilen aus dem Rechteck und setzen Sie eine neue Zeile, deren SSTs haben spezifische Ergänzung zu den entsprechenden Fliesen auf der zweiten bis oberen Reihe und der zweiten Reihe nach unten.
    4. Für eine freiliegende Einzelstrang-Domäne von verschiedenen Formen, ersetzen mit Poly-T-Segmente von 10-11 Nukleotiden Länge, oder Abdeckung mit Kantenschutz, die komplementär zu der freiliegenden Domäne sind und mit 10-11 Nukleotide lange Poly-T-Segmente zu kündigen.

2. Herstellung der Molecular Canvas

  1. DNA-Komponente erhalten Stränge in RNase-freiem Wasser von einem oligonucleoti gelöst angegebenen Sequenzende-Hersteller in V Boden 96-Well-Platten mit Oligonukleotiden bei einer 10 nmol Maßstab mit Standard Entsalzung synthetisiert. Zentrifugation der 96-Well-Platten mit der DNA-Stränge zu etwa 10 s lang bei 600 x g.
    1. Pipette 1 ul von jeder der 362 Vertiefungen, die mit DNA-Strängen zur 24H × 28T Rechteck (3A) bei 100 & mgr; M pro Strang (Herstellerangabe) in eine 2-ml-Röhrchen. Add 138 ul destilliertem entionisiertem H 2 O, um das 2-ml-Röhrchen, um eine Stammlösung des Stranges Mischung bei einer Konzentration von 200 nM pro Strang bilden.
  2. Dann werden 50 ul der 200 nM Stammlösung von Strang Mischung wurden 10 ul 10x Annealing-Puffer A (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 250 mM MgCl 2), 40 ul destilliertes entionisiertes H 2 O, um eine 0,2 ml PCR-Röhrchen. Dies ermöglicht eine 100 ul-Probe des molekularen Leinwand in 1X Glühen Puffer A (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCl 2).
  3. Glühen die sample für 17 h in einem Thermocycler Abkühlen von 90 ° C bis 25 ° C. Den Thermocycler wie folgt: Lauframpe von 90 ° C bis 61 ° C bei einer konstanten Geschwindigkeit von 5 min pro ° C; Lauframpe von 60 ° C bis 25 ° C bei einer konstanten Geschwindigkeit von 20 min pro ° C; und Inkubieren bei 4 ° C, bis die Probe aus dem Thermocycler genommen werden.
  4. Bereiten Sie eine native 2% Agarose-Gel.
    1. Messen von 2,4 g Agarose in einen 600 ml Becher. Zugabe von 120 ml 0,5 × TBE-Puffer (44,5 mM Tris-Borat, pH 8,3, 1 mM EDTA) und 30 ml destilliertem entionisiertem Wasser in den Becher.
    2. Mikrowelle für 3 Minuten (oder 40 - 60 sec mehr nach dem Kochen). Füllt die Wasser während der Verdampfung durch Zugabe von 30 ml Wasser, die zu der Konzentration von Agarose in dem Gel bei 2% zu halten hilft, verloren.
    3. Schwenken Sie den Inhalt des Becherglases für 1 min in ein kaltes Wasserbad. 1 ml 1,2 M MgCl 2 (um eine 10 mM MgCl 2 -Konzentration in dem Gel zu machen) und Pre-Fleck das Gel with 6 ul Farbstoff SYBR Tresor (1: 20.000).
    4. Gießen Sie das Gel-Lösung in ein trockenes Gel Box und legen Sie eine 1,5 mm dick und 12 Gelelektrophorese Kamm. Die Lösung erstarren lassen für 15 - 30 min auf einer ebenen Plattform.
    5. Pour Gel-Laufpuffer (44,5 mM Tris-Borat, pH 8,3, 1 mM EDTA und 10 mM MgCl 2) in das Gel ein. Last 2-3 ul 1 kb DNA-Leiter in eine Vertiefung des Agarosegels. Mischungs 4 ul 6X Bromphenolblau-Farbstoff (0,25% Bromphenolblau, 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl 2 und 30% Glycerin) mit 20 ul der Probe des molekularen Leinwand und laden die Lösung in einen anderen Napf der Agarose-Gel.
  5. Führen Sie den nativen 2% igen für 2 Stunden bei 100 V in einem Eiswasserbad (Bromphenolblau blau dargestellt, läuft schneller als Komponentenstränge, damit es als Indikator dienen kann, dass, wenn 2 Stunden Laufzeit angemessen ist).
  6. Bild des Gels mit einem Gel-Scanner mit einem geeigneten Filter für die SYBR Safe Fleck (2B
  7. Auf einem blauen Licht Transilluminator, Verbrauchs die dominante Bande mit ähnlichen Mobilität der Band von 1500 Basenpaare des 1 kb DNA-Leiter mit einer scharfen Rasierklinge. Legen Sie die gewünschte Gel Einheit (en) in einer Spin-Säule und dann quetschen Sie das Gel in feine Stücke mit Hilfe eines Mikroröhrchen Stößel. Zentrifuge bei 438 × g für 3 min bei 4 ° C.
  8. Messen der Konzentration der DNA unter Verwendung eines Ultraviolett-Spektrophotometer bei 260 nm.
    1. Verwenden Sie 2 ul ultrareinem DNase / RNase-Free destilliertem Wasser als leer, um die Maschine zu kalibrieren.
    2. Verwenden ein äquivalentes Volumen der gesammelten Probe von der Spinsäule, um eine Schätzung der DNA-Konzentration zu erhalten. Die Konzentrationsmesswert ("a" = ng / & mgr; l) bei einer UV-Absorption von 260 nm erhalten wird helfen, den Verdünnungsfaktor für AFM und TEM-Bildgebung.
    3. Wandeln die gemessene Konzentration von "a" (ng / & mgr; l), um "b" (nM) nach b = a × 10 6 / (330 &# 215; Anzahl der Nukleotide).
      ANMERKUNG: Das Molekulargewicht eines Nukleotid 330 g / mol. Die berechnete molare Konzentration Wert des Verdünnungsfaktors für AFM und TEM-Aufnahmen zu bestimmen. Wie für den Fall eines 24H × 28T Rechtecks ​​die gemeinsame Messung für die gereinigte Probe liegt bei etwa 10 bis 60 ng / & mgr; l. Da die Anzahl der Nukleotide, die für eine solche Struktur ist 14616 Da, die molare Konzentration etwa 2-12 nM. Die Endkonzentration wird durch die Sammelausbeute bestimmt (~ 20 bis 50%) aus der Zentrifugation und dem Volumen des Gels Bande ausgeschnitten aus (je höher das Volumen, je verdünnter die gereinigte Probe).

3. Atomic Force Microscopy Imaging

  1. Schälen Glimmer auf eine Probe Metallscheibe mit Klebeband, um eine ebene Fläche zu erhalten und setzen Sie den Probenteller auf die Abbildungsstufe befestigt.
  2. Dann werden 40 & mgr; l 1X Anelierungspuffer A, gefolgt von 5 ul (2-5 nM) der gereinigten Probe der 24H × 28TRechteck, um die frisch gespaltenen Glimmeroberfläche. Lassen Sie die Mischung für ca. 2 min zu begleichen.
  3. Installieren Siliziumnitrid AFM Cantilever-Chips auf einem freitragenden Halterung. Benutzen Sie einen C Dreiecksspitze (Resonanzfrequenz f 0 = 40 bis 75 kHz; Federkonstante, k = 0,24 Nm -1) für die Bildgebung.
  4. Ein Musterbild in dem Fluid-Tapping-Modus. Verwenden Sie die folgenden Abbildungsparameter für das Scannen: Scannen Größe von 2 & mgr; m, 1024 Zeilen für die Auflösung und einer Abtastrate von 0,5 bis 1 Hz (2C).
  5. Falls erforderlich, werden 10 & mgr; l oder mehr der 10 mM NiCl 2 -Lösung, die Stärke der DNA-Bindung Glimmer 29 zu erhöhen.

4. Probenvorbereitung für Streptavidin Labeling

  1. Manuell Design der 24H × 28T Rechtecks, so dass Griff Stränge an spezifischen Stellen eingebaut sind, die komplementär zu der anti-Griff-Stränge mit Biotin Modifikation, die ihrerseits in der Lage sind zu binden streptavid seinin speziell.
    1. Modifizieren des Molekular Leinwand durch Anbringen eines 3 '17-Nucleotid-Segment, das aus einem zwei Nukleotidsequenz (TT) als Abstandshalter besteht und eine 15-Nucleotid-Griff (GGAAGGGATGGAGGA) an die Fliesen 14 in der oberen Reihe und 14 Fliesen auf dem Boden Reihe des Rechtecks ​​(3A), um die Grenze zu beschriften. Diese Sequenz ist komplementär zu einem 3'-Biotin-modifizierten Antigriff Strang (TCCTCCATCCCTTCC-Biotin).
  2. Für die interne Kennzeichnung, bringen Sie die 3 '17 Nukleotid-Segment zu 8 interne Fliesen und 6 Randfliesen des Rechtecks ​​(4A).
    1. Mischen Sie die 28 Stränge mit Griffen (Grenzkennzeichnung) mit dem Rest der Komponenten-Stränge des 24H × 28T Rechteck (334 Fäden), eine 200 nM Stammlösung zu machen. Mischen Sie die 14 Stränge mit Griffen (interne Markierung) mit dem Rest der Komponenten-Stränge des 24H × 28T Rechteck (348 Fäden), eine 200 nM Stammlösung zu erhalten.
  3. Für boundary Kennzeichnung, werden 50 ul der 200 nM Stammlösung der Stränge, 6 & mgr; l der 100 & mgr; M Biotin-modifizierten Antigriff Stränge 10 ul der 10X Anelierungspuffer A und 34 ul destilliertem deionisiertem Wasser auf eine 0,1 bis 0,2 ml PCR Reagenzglas. Die Endkonzentration der Komponente Strang 100 nM und die Endkonzentration des Antigriff Biotin modifizierten Strang 6.000 nM. Man beachte, dass 28 Moleküle des Antihand Biotin modifiziert Strang bindet an eine 24H × 28T Rechteck so die Anti-Biotin-modifizierten Griff Strangs von mehr als 100% der Bindung günstig zu gestalten.
  4. Für interne Kennzeichnung, werden 50 ul der 200 nM Stammlösung der Stränge, 3 ul der internen Antihand Biotin modifizierten Strang bei 100 & mgr; M, 10 & mgr; l des 10X-Annealing-Puffer A, 37 ul destilliertem entionisiertem Wasser auf eine 0,1 - 0,2 ml PCR-Röhrchen. Die Endkonzentration der Komponente Strang 100 nM und die Endkonzentration des Antigriff Biotin modifi ed Strang 3.000 nM. Man beachte, dass 14 Moleküle des Antigriff Biotin modifiziert Strang bindet an eine 24H × 28T Rechteck so anti-Griff Biotin modifizierten Strangs von mehr als 100% der Bindung günstig zu gestalten.
  5. Glühen beide Proben in einem Thermocycler für 17 Stunden unter Verwendung der in 2.3 beschriebenen Schritte.
  6. Bereiten Sie eine native 2% Agarose-Gel, wie in Schritt 2.4 beschrieben.
  7. Reinigen Sie beide Proben wie in den Schritten 2.5 beschrieben.
  8. Messung der Konzentration der gewünschten DNA-Strukturen, wie in Schritt 2.6 beschrieben.

5. Rasterkraftmikroskopie für Streptavidin Labeling

  1. Bild jede Probe unter Verwendung eines AFM, wie in Schritt 3 (3B und 4B) beschrieben.
  2. Nach der ersten Runde der Bildgebung, 40 & mgr; l 1X Annealing-Puffer A, gefolgt von 1 & mgr; l Streptavidin bei 10 mg / ml zu der Probe. Lassen Sie die Mischung für ca. 2 min vor der Reimaging (3C und 4C) zu begleichen.
_title "> 6. Konvertieren Sie ein Rechteck in ein Rohr

  1. Um ein Rohr auf der Basis des Rechtecks ​​zu gestalten, halten alle Komponenten SSTs an Ort und Stelle mit Ausnahme der oberen und unteren Reihe. Einführung einer neuen Zeile, deren SSTs werden durch Verknüpfung der oberen und unteren Halb Fliesen der jeweiligen Spalten, um das ursprüngliche Rechteck in ein Rohr Konformation (5A) cyclisieren konzipiert.
  2. Mischen Sie die neue Reihe der Litzen (14 Stränge) mit den Komponentenstränge des 24H × 28T Rechteck mit Ausnahme der oberen und unteren Reihe (336 Fäden), eine 200 nM Stammlösung zu erhalten.
  3. Folgen Sie der Gelreinigung Schritte 2,2-2,7 (5B).

7. Die Transmission Electron Microscope Imaging

  1. Wiegen 0,06 g Uranyl Formiat in 3 ml destilliertem Wasser zu einer 2% igen wässrigen Uranyl Formiat Färbemittellösung herzustellen. Filtern der 2% igen wässrigen Uranyl Formiat Färbelösung wird mittels eines 0,2 um-Filter in eine Spritze befestigt.
    1. In 5 ul5 N NaOH auf die 1 ml des gefilterten Farblösung. Vortexen Sie die Lösung und Zentrifuge bei 20.000 x g.
  2. Glimmentladungs ​​die kohlenstoffbeschichteten Gitter (beschichtete Seite nach oben) mit den folgenden Einstellungen: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar und negativen Hochspannungspolarität.
  3. Verwenden Sie selbstschließenden Pinzette, um einen Schein-Entlader behandelt Gitter von der Kante greifen.
  4. Pipette 3,5 ul Probe auf das Gitter für 4 min. Mit einem Stück Filterpapier Docht von der Probe, indem das Filterpapier in Kontakt mit dem Gitter von der Seite.
  5. 3,5 & mgr; l der Färbelösung sofort hinzufügen auf das Gitter für 1 min.
  6. Wick Sie den Fleck wie in 7.4 und halten das Filterpapier gegen den Netz für 1-2 min.
  7. Übertragen Sie das Gitter auf eine TEM Probenhalter und Bild unter Verwendung eines JEOL JEM-1400 bei 80 kV mit einer Vergrößerung von 10 K bis 80 K (5C) betrieben.

8. Konstruieren beliebiger Form Mit dem Molecular Leinwand

  1. Identifizieren Sie eine Form, und wählen Sie die Stränge, die an die Form auf der molekularen Leinwand entsprechen. Für eine Dreiecksform zum Beispiel, wählen Sie 206 aus 362 Stränge für die molekulare Leinwand.
  2. Ersetzen Sie die freiliegenden Domain (dh entlang der Hypotenuse des Dreiecks) mit einem Poly-T-Segment 10 - 11 Nukleotide lang (Design 1 in 6A), oder fügen Sie einen Kantenschutz, die komplementär zu der freiliegenden Domäne ist und beenden Sie es mit ein 10 - 11 Nukleotide lange poly-T-Segment (Design 2 in 6A), um die Aggregation zu verhindern.
    HINWEIS: Einfach Tempern der SSTs die an die Pixel des Dreiecks entsprechen (ohne Verwendung von Schutz Stränge) werden, um die Aggregation und keine gesonderten Produktbandbildung auf einem Gel führt. Verwenden Sie den Kantenschutz-Design für verschiedene Formen, wie es ist, ressourceneffizientere; nur vier zusätzliche Sätze von Strängen (6C) im Vergleich zu 14 zusätzliche Sätze in Einbauentwurf erfordert (Figure 6B).
  3. Erstellen Sie eine Strang-Bibliothek für die 310-Pixel-Molekular Leinwand, die den Kernsatz (der 362 SST Leinwand), Set 1 * (Kantenschutz, die Domäne 1 binden eines SST), Set 2 * (Kantenschutz, die Domäne 2 binden beinhaltet einer SST), Set 3 * (Kantenschutz, die Domäne 3 eines SST binden) und Set 4 * (Kantenschutz, die Domäne 4 eines SST) zu binden, um insgesamt 1344 Kantenschutz zu geben.
  4. Zentrifugieren Sie die Platten mit 96 Vertiefungen für die verschiedenen Sets für etwa 10 s. Pipettieren Sie die gewünschte Stränge von den Platten, um eine Stammlösung für eine bestimmte Form zu machen.
    1. Für die Form eines Dreiecks mit Kantenschutz, Pipette 1 ul 206 Stränge aus der Kernsatz, 0 von Satz 1 *, 0 aus der Serie 2 *, 0 von Satz 3 * und 24 Stränge von Satz 4 * in ein 2-ml-Zentrifugen Rohr. Mit 20 ul destilliertes entionisiertes Wasser zu dem Rohr, um eine 400 nM Stammlösung der DNA-Stränge bilden.
  5. In 50 ul der 400 nM Stammlösung von DNA stra NDS, 10 ul der 10X Glühen Puffer B (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 125 mM MgCl 2) Stammlösung und 40 ul destilliertes entionisiertes H 2 O, um eine 0,2 ml PCR-Röhrchen. Dies ermöglicht eine 100 ul-Probe des Dreiecks in 1X Glühen Puffer B (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl 2) mit Fäden in einer Konzentration von etwa 200 nM pro Strang.
  6. Tempern des Gemisches in einem Thermozykler für 17 Stunden, wie in Schritt 2.3 beschrieben.
  7. Bereiten Sie eine native 2% Agarose-Gel, wie in Schritt 2.4 beschrieben.
  8. Reinigen die Probe wie in Schritt 2.5 beschrieben.
  9. Messen der Konzentration der DNA, wie in Schritt 2.6 beschrieben.
  10. Bild die Probe unter AFM wie in Schritt 3 (7C und 7D) beschrieben.
  11. Pick and mix Stränge für verschiedene Formen unter Verwendung des gleichen Strang Bibliothek. Glühen die verschiedenen Lösungen und kombinieren gereinigten Proben von verschiedenen Formen zu Zeit während AFM zu speichern.
jove_title "> 9 Optional:. Robot Automation Of Shape Design und Liquid Mixing

  1. Verwenden Sie eine benutzerdefinierte MATLAB-Programm, um das Design von komplexen Formen zu unterstützen.
  2. Verwenden Sie die Software, um Anweisungen in Form eines Pipettierungssequenz an einen Roboter Liquid Handler liefern. Verwenden Sie den Roboter Liquid Handler auswählen und mischen Sie die Stränge, die die Zielform darstellen.
    HINWEIS: Shape Design und Strangmischung wurde automatisiert, um menschliche Fehler zu reduzieren und die Konstruktion weniger arbeitsintensiv.

10. Rechtecke und Tubes in verschiedenen Skalen

  1. Konstrukt unterschiedlich große Rechtecke (10), indem einfach die Anzahl der parallelen Helices (H) und die Anzahl der schraubenförmigen Windungen (T).
  2. Folgen Sie Schritt 3 für eine bestimmte Größe Rechteck.
  3. Folgen Sie Schritt 6 für eine bestimmte Größe Rohr.

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Representative Results

Die Selbstorganisation der SSTs (Figur 1) wird eine 24H × 28T Rechtecks ​​ergeben, wie in Abbildung 2 dargestellt. DNA-Sequenzen für die verschiedenen SSTs modifiziert / werden optimiert, um Streptavidin Kennzeichnung ermöglichen (Figur 3 und 4), die Transformation einer Rechteck in ein Rohr (5), die programmierbare Selbstorganisation von SSTs Rohre und Rechtecke unterschiedlicher Größen (10) bilden, und die Konstruktion von 2D beliebigen Formen unter Verwendung des Molekular Leinwand (Bild 8). Zwei Entwürfe (Domain Substitution Design und Kantenschutz-Design) wurden getestet, wie Lösungen entlang ausgesetzt Domänen von beliebigen Formen (Abbildung 7) Aggregation. Beide Ausführungen haben vergleichbare Gel Ausbeute und strukturelle Integrität, aber die Kantenschutz-Design ist kostengünstiger, da sie weniger Hilfsspezies (Abbildung 6) benötigt.Strand Kommissionierung und Mischen kann automatisiert werden, wie in den 9 gezeigt, dass menschliche Fehler und Zeit reduziert werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Selbstorganisation von molekularen Formen mit Einzelstrang-Fliesen. (A) Die kanonische SST-Motiv, 12 angepasst (B) links und Mitte:. Zwei Darstellungen montiert SSTs. Inner SSTs haben eine volle Länge von 42 Basen und sind mit "U", während Rand SSTs haben 21 Basen und sind "L" gekennzeichnet. Im linken Diagramm, Farben zu unterscheiden verschiedene Domänen. Im mittleren Diagramm, Farben zu unterscheiden verschiedene Stränge. Rechts: Eine schematische Darstellung der Mauer Blick auf SST-Strukturen. Dicke Steine ​​sind voller SSTs und dünnen Ziegel Grenze SSTs. Die abgerundeten Kanten zeigen keine komplementäre Paarung. Wie in der zweiten Figur, Farben zu unterscheiden einzelnen Kacheln. In allen diagWidder, hat jede Platte eine einzigartige Sequenz. (c) Zurückhalten eine geeignete Auswahl von Fäden aus dem SST Sammlung, aus denen das Rechteck-Design in Abbildung B resultiert in der Bildung einer anderen gewünschten Form, wie ein Dreieck (links) oder einem rechteckigen Ring (rechts). (d) die Konstruktion eines Rohrs mit einer vorbestimmten Breite und Länge. (E) Bei einer vorsynthetisierten Pool von SST-Sequenzen (oben), beliebige Formen (unten) kann durch die Auswahl einer Teilmenge von Fäden zu gestalten, Verwendung im Strang Mischung (dunkelblau Punkte) und die Beseitigung der Rest (hellblau Punkte). Diese Zahl hat sich von einem zuvor veröffentlichten Figur 26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Design und AFM-Bild des 24H × 28T Rectangle. (A) Schematische Darstellung des 24H × 28T Rechteck. Ein Zoom-In Ansicht wird auch für die detaillierte lokale Struktur gezeigt. Die individuelle SST Segmentanordnung ist entweder 10 nt - 11 nt - 11 nt - 10 nt (zB A2.13-B2.13-a1.13 * -b1.12 *) oder 11 nt - 10 NT 10 NT - 11 nt (zB a3.12-b3.12-A2.13 * -b2.12 *). Dreiecke auf der linken Seite des Rechtecks ​​anzuzeigen Zeilen mit einem 10nT-11nt-11nt-10nT SST Anordnung; die anderen internen SSTs haben 11 nt - 10 nt -10 nt- 11 nt statt (nt ist ein Akronym für Nukleotid). Da die 24H × 28T SST Rechteck hat ähnliche Abmessungen wie ein DNA-Origami-Struktur, das Kriterium in der DNA-Origami-Arbeiten eingeführt und betrachten ein SST Rechteck "wohlgeformt", wenn es keinen Defekt in der erwarteten Umriss größer als 15 nm im Durchmesser war hat angenommen. Zusätzlich wird ein "wohlgeformt" Rechteck-Struktur has keine Löcher in ihrem Inneren die größer als 10 nm Durchmesser, wurde erforderlich. Im Anschluss an die oben genannten Kriterien wurde eine "well-Formation" Verhältnis von 55% (N = 163) erhalten. Einem roten Stern (*) zeigt die linke untere Ecke des Rechtecks ​​hier. (B) 2% nativen Agarose-Gelelektrophorese. U, ungereinigt; P, (durch Gel-Extraktion aus lane U) (C) AFM-Bild der Gitterstruktur gereinigt. (Scangröße: 2 um x 2 um). Diese Zahl hat sich von einem zuvor veröffentlichten Figur 26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Boundary Kennzeichnung von 24H × 28T Rechteck. (A) Schematische Darstellung des spezifischen biotin markierten 24H × 28T Rechteck. Die blau markierten Stränge sind die Griff-Stränge. Die Stränge in Rot hervorgehoben sind die anti-handle Stränge mit 3'-Biotin (schwarze Punkte) markiert. Streptavidin ist als orangefarbenes Kugel (B) AFM abgebildet bevor Streptavidin (Scangröße: 1 & mgr; m × 1 & mgr; m).. (C) AFM-Bild nach der Zugabe von Streptavidin (Scangröße: 1 & mgr; m × 1 & mgr; m). Inset eine vergrößerten Ansicht, die erfolgreiche Kennzeichnung. Man beachte, dass Streptavidin erschienen entweder weißen Punkten oder Streifen aufgrund ihrer erhöhten Höhen. Diese Zahl hat sich von einem zuvor veröffentlichten Figur 26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Ininterne Kennzeichnung von 24H × 28T Rectangle. (A) Schematische Darstellung des spezifischen Biotin markiert 24H × 28T Rechteck. Die blau markierten Stränge sind die Griff-Stränge. Die Stränge in Rot hervorgehoben sind die anti-handle Stränge mit 3'-Biotin (schwarze Punkte) markiert. Streptavidin ist als orangefarbenes Kugel (B) AFM abgebildet bevor Streptavidin (Scangröße: 1 & mgr; m × 1 & mgr; m).. (C) AFM-Bild nach der Zugabe von Streptavidin (Scangröße: 1 & mgr; m × 1 & mgr; m). Inset eine vergrößerten Ansicht, die erfolgreiche Kennzeichnung. Beachten Sie, dass Streptavidin erschien entweder als weiße Punkte oder Streifen aufgrund der erhöhten Höhen. Diese Zahl hat sich von einem zuvor veröffentlichten Figur 26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

in-page = "always"> Figur 5
Abbildung 5. Entwurf und TEM-Bild der 24H × 28T Rohr. (A) Schematische Darstellung des 24H × 28T Barrel. Zwei vergrößerten Ansichten in der oberen und unteren zeigen detaillierte Segmentidentitäten. Beachten Sie, dass Segmente a24.x * (zB a24.13 *) und b24.x * (zB b24.12 *) der oberen Reihe, die zu Segmenten a24.x sind (zB a24.13) und b24.x (zB b24.12) der unteren Reihe; diese Komplementarität wird erwartet, um die Bildung der rohrförmigen Struktur ergeben. (b) 2% igen nativen Agarose-Gelelektrophorese. U, ungereinigt; P, (durch Gel-Extraktion aus lane U) gereinigt (C) TEM-Bild der Laufkonstruktion (Maßstab: 100 nm).. Diese Zahl hat sich von einem zuvor veröffentlichten Figur 26 modifiziert.ighres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Zwei Entwürfe, zum Verhindern von Aggregation Exposed Sticky Domains verursacht. (A) eine Seite-an-Seite-Demonstration von zwei Verfahren zu belichtenden Bereiche abzudecken. Die ungepaarten sticky Domain (Domäne 4) ist mit einem roten, gestrichelten Kasten dargestellt. Ausführung 1 ist die Domänen Substitution Design, in dem das ungepaarte Domäne durch einen poly-T-Domäne substituiert ist (in rot gezeigt und mit "T"). Design 2 ist der Kantenschutz-Design, das für den ungepaarten Domäne mit einem Kantenschutz Strang beinhaltet (in rot dargestellt und mit "T-4 *"). Der Kantenschutz-Strang ist aus einem Poly-T-Abschnitt und in Ergänzung zu dem freiliegenden Domäne zusammengesetzt ist. (B) die verschiedenen möglichen Grenzkonfigurationen mit Domain-Substitution (Entwurf 1) verbunden sind.Es gibt 14 verschiedene Möglichkeiten, eine interne SST (in blau dargestellt) einen freiliegenden Domäne oder Domänen zu verlassen. Die entsprechenden Strang Substitutionen sind rot für jede Situation gezeigt. (C) Der Kantenschutz-Design (Design 2). Eine interne SST (blau) erfordert nur vier Kantenschutzstränge (rot) an exponierten Domänen unter Verwendung dieses Entwurfs zu decken. Diese Zahl hat sich von einem zuvor veröffentlichten Figur 26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 7
Abbildung 7. Zwei Entwürfe für die SST-Dreieck. (A) und (B) zeigen schematische Darstellungen in Abbildung 8 auf Basis von Design 1 (Domain-Substitution) und Design-2 (Kantenschutz) sind. Ein Poly-T-Region (T10 oder T11 in der Figur), wie dargestellteine abgerundete Ecke in dem Blockdiagramm. Der Einschub zeigt eine vergrößerte Ansicht der mit der gestrichelten Kasten angegebenen Struktur. Maßstabsbalken 100 nm. (C) und (D) sind die AFM-Bilder. Diese Zahl hat sich von einem zuvor veröffentlichten Figur 26 modifiziert.

8
Abbildung 8. Diagramme und AFM-Bilder von 100 verschiedenen Formen. Structure Entwürfe sind in den oberen Feldern angezeigt. Hellblau Färbung zeigt die Leinwand Stränge aus der Mischung nach links, während dunkelblauen Färbung zeigt die Stränge enthalten. Zur Verdeutlichung sind Kantenschutz Stränge weggelassen. Eine entsprechende AFM-Bild der einzelnen Struktur ist unten sein Design gezeigt. Jedes Bild ist 150 nm 150 nm in Bereich ×. Es gibt 100 einzigartige Formen. Enthalten sind 10 arabischen Ziffern, die 26 Großbuchstaben des lateinischen Alphabets, 23 Satzzeichen und keyboard Symbole, 10 Emoticons, 9 astrologischen Symbole, 6 chinesischen Schriftzeichen, und mehrere verschiedene Symbole. Diese Zahl hat sich von einem zuvor veröffentlichten Figur 26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

9
Abbildung 9. Robot Automation Flussdiagramm. Dieses Diagramm zeigt den Workflow verwendet werden, um den Mischvorgang zu automatisieren. Zunächst wird eine kundenspezifische MATLAB-Programm verwendet werden, um die gewünschte Form zu gestalten. Erneut dunklen blauen Rechtecke zeigen die Stränge in der Mischung enthalten sein. Nachdem der Entwurf abgeschlossen ist, gibt das Programm einen Satz von Anweisungen zum Pipettieren der Roboterflüssigkeitshandhabungsgerät. Der Roboter pipettiert die richtigen Konzentrationen der entsprechenden Stränge für eine bestimmte Form in eine plate gut. Die Mischung durchläuft dann einen Topf Glühen, gefolgt von AFM der resultierenden Formen. (Diese Zahl hat sich von einem zuvor veröffentlichten Abbildung 26 geändert wurde). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

10
Abbildung 10. Selbstorganisation von Rectangles und Tubes in verschiedenen Skalen. (A) AFM-Aufnahmen von SST Rechtecke mit den folgenden Dimensionen ausgelegt (von links nach rechts):. 4 H × 4T, 6 H × 7T, 10 H × 10T, 12 H × 14T, 18 H × 20T, 24U × 28T und 34T 36H × ( B) Die Molekulargewichte der Strukturen sind auf einer logarithmischen Skala. Das Sternchen zeigt das Gewicht eines typischen M13 DNA origami Struktur als Referenz. (C) TEM-Bildervon SST Rohre mit folgenden Dimensionen ausgelegt (von links nach rechts): 8 H × 28T, 8H × 55T, 8H × 84T, 24U × 28T und 12H × 177T. Alle Skala Balken 100 nm. Diese Zahl hat sich von einem zuvor veröffentlichten Figur 26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

In der Strukturbildung Schritt ist es wichtig, eine geeignete Konzentration an Magnesiumkationen zu halten (z. B. 15 mM) in dem DNA-Strang-Mischung zur Selbstorganisation DNA-Nanostrukturen. Ähnlich wird in dem Agarosegel Charakterisierung / Reinigungsschritt ist es wichtig, eine geeignete Magnesium-Kationen-Konzentration zu halten (z. B. 10 mM) in dem Gel und dem Gel-Laufpuffer, um die DNA-Nanostrukturen während der Elektrophorese zu erhalten. Zur 24H × 28T Rechteck Struktur testeten wir Glühen in verschiedenen Mg ++ Konzentrationen und festgestellt, dass die Struktur in der Regel im Bereich von 10 gebildet - 30 mM Mg ++ (mit den besten Bildungsausbeute mit etwa 20 mM Mg ++).

Im Gegensatz zu den eingerüstet Origami-Struktur, hat der SST-Struktur eine modulare Architektur. Verschiedene Formen aus der gleichen Leinwand durch Auswahl der entsprechenden Teilmenge von SST Fliesen ausgelegt werden. Zusätzlich wird die SST-Struktur her zusammengebautbin nur kurze synthetische DNA-Stränge und keine lange Gerüst, das in der Origami-Ansatz verwendet wird, beinhalten. Daher wird die Größe der SST-Struktur nicht durch die Länge der zur Verfügung stehenden Gerüst beschränkt. Doch während DNA-Origami-Ansatz kann oft optimiert, um entweder gefaltet oder entfaltet Strukturen Monomere herzustellen, SST kann in teilweise gebildeten Strukturen führen und damit möglicherweise Gelreinigung für die spätere Verwendung erfordern. Darüber hinaus aufgrund des Fehlens eines Gerüsts Strang, ein SST-Struktur kann mehr "spröde" als seine DNA origami Pendant. Sowohl die SST-Ansatz und die DNA-Origami-Ansatz sind schnell weiterentwickelt, und der Benutzer wird empfohlen, einen Ansatz, der am besten aus seiner besonderen funktionalen Anforderungen zu wählen.

Auffällig ist, dass Hunderte von kleinen Monomere nur von lokalen Bindung Wechselwirkungen vermittelt kann Selbstorganisation zu einer vorgeschriebenen globalen Form, wie sie in der SST-Ansatz demonstriert. Die in der SST-Ansatz sho gezeigten GrundprinzipienULD generalizable Materialien neben der DNA-Stränge, und das in diesem Artikel beschriebene grundlegende Methode, nach entsprechender Modifizierung sollten die Konstruktionen von komplexen Strukturen, die aus verschiedenen Materialien selbstorganisierten aktivieren.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das Office of Naval Research Young Investigator Programm Auszeichnung N000141110914, Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF Career Award CCF1054898, NIH Direktor Neue Innovator Award 1DP2OD007292 und Wyss Institut für biologisch inspirierte Wesen Fakultät Gründerfonds (bis PY) finanziert und Tsinghua-Peking Center for Life Sciences Gründerfonds (BW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA Strands  Integrated DNA Technology Section 3.1
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen S33102 Section 3.4.2
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns BIO-RAD 731-6166 Section 3.6
Bruker's Sharp Nitride Lever Probes Bruker AFM Probes SNL10 Section 4.3
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator Invitrogen G6600 Section 3.6
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428 000.414 Section 3.6
Transmission Electron Microscope  Jeol Jem 1400 Section 7.4
Multimode 8 Veeco Section 4
Typhoon FLA 9000 Laser Scanner GE Heathcare Life Sciences 28-9558-08 Section 3.5
Ultrapure Distilled water Invitrogen 10977-023 Section 3.7.1
Mica disk SPI Supplies 12001-26-2 Section 4.1
Steel mounting disk Ted Pella, Inc. 16218 Section 4.1
carbon coated copper grid for TEM Electron Microscopy Sciences FCF400-Cu Section 7.2
tweezers Dumont 0203-N5AC-PO Section 7.31
glow discharge system Quorum Technologies K100X Section 7.2
DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler BIO-RAD PTC–0240G Section 3.3
Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems ThermoScientific B2 Section 3.4.3
Seekam LE Agarose 500G Lonza 50004 Section 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp ThermoScientific SM1333 Section 3.4.4
Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer ThermoScientific Section 3.7
0.2 um filter Corning Inc. 431219 Section 7.1.2

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References

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Die Selbstorganisation von Complex zweidimensionale Formen von Einzelstrang-DNA-Fliesen
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Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles. J. Vis. Exp. (99), e52486, doi:10.3791/52486 (2015).

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