Introduction
5,8,10 - - 이전 핵산 자기 조립 작업 1-25는 DNA의 2를 포함하여 복잡한 구조의 다양한의 성공적인 건설을 주도하고있다 13,17,23 또는 RNA 7,22주기 3,4,7, (22)와 알고리즘 5 개의 차원 격자, 리본 (10, 12) 및 튜브 4,12,13, 3D 크리스탈 (17), 다면체 (11)과 유한은, 2D는 7,8 모양. 16, 18 - - 21, 25 하나의 발판 가닥이 복잡한 형상 9,14를 형성하기 위해 많은 짧은 보조 스테이플 가닥으로 접어된다 특히 효과적인 방법은 DNA 종이 접기를 스캐 폴딩된다.
최근 우리는 단일 가닥 타일 (SST)를 사용하여 소정 형상으로 2D 이산 나노 구조체를 구성하기위한 방법을보고하고, DNA 접기 (26)에 필적하는 복잡성과 구조를 보여 주었다. 이 articl전자는 우리의 초기 작업 (26)의 적응하고 정확하게 규정 된 크기 (폭과 길이) 및 형태학 정교한 유한 2D 형태로 개별적으로 어드레스 해수면 온도를 배치하기위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. SST 방법의 하나의 중요한 장점은 모듈 방식입니다. 구조물의 각 성분은 SST 어셈블리 모듈 공법 유닛으로서 기능하고,이 해수면 온도의 상이한 서브 세트들은 별개의 형상을 생성한다. 따라서, 우리는 짧은, 합성 DNA 가닥에서 규정 된 크기와 모양을 가진 나노 구조를 구성하는 일반적인 플랫폼을 설립했다.
해수면 온도는 네 가지 영역, 각 10 또는 11 뉴클레오티드 (그림 1A)를 포함한다. 해수면 온도는 병렬 나선이 교차 결합에 의해 함께 개최하는 DNA 격자를 생성하도록 결합한다. 각각의 크로스 오버 영역 (2) 및 (3) 인산 시각적 명확성을 위해 도면에 인위적으로 연신 사이 포스페이트이다. 크로스 오버는 <(떨어져 두 개의 나선형 회전 (21 기지)를 이격되어있다강한> 그림 1b). 복합 직사각형은 나선 및 코일 권수 그들의 치수로 지칭된다. 예를 들어, 직사각형 여섯 나선 넓고 여덟 헬리컬는 8T 구형 × 6H로서 참조되는 긴 변있다. 해수면 온도가 탈락 추가하거나 임의의 형상 및 크기 (도 1C)의 구조를 만들 재 배열 될 수있다. 예를 들면, 직사각형의 설계는 원하는 길이 및 반경 (도 1D)와 튜브로 압연 될 수있다.
또한, 직사각형 SST 격자는 SST 픽셀로 구성된 분자 캔버스, 7 내지하여 각 3 나노 미터로 볼 수 있습니다. 본 연구에서 우리는 (310)는 전체 길이 내부 해수면 온도의 분자 캔버스를 사용하여, 좌우의 경계를 구성하는 24 전장 해수면 온도, 및 상부 및 하부 경계를 형성하는 28 반장 해수면 온도. 캔버스 크로스 오버로 연결된 24 번 나선을 가지고 있으며, 각각의 나선 (28) 나선형 회전 (294 기지)를 포함하므로이라고28T 직사각형 캔버스 × 24H. 28T 캔버스 × 24H는 M13 파지 지지체에서 만든 DNA 접기 구조와 유사한 분자량을 갖는다.
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Protocol
1. DNA 시퀀스 디자인
- 28T 캔버스 × 24H를 만들 이중 나선, 각각의 이중 나선을위한 상하 나선의 길이의 수, 교차 패턴을 지정하여 SST-한정된 구조를 설계 UNIQUIMER 소프트웨어 (27)를 사용한다. 이러한 매개 변수를 정의한 후, 전체 구조 (스트랜드 조성물 및 상보성 배열)은 그래픽 프로그램에서 도시된다.
- 보완 장치 및 추가 요구 사항 (있는 경우)를 충족시킬 수있는 특정 구조의 가닥을위한 시퀀스를 생성합니다. (구조체의 대부분) 서열 28 대칭성을 최소화하여 DNA 서열을 디자인.
- 뉴클레오티드 (A, C, G 및 T)에 의해 하나 하나를 랜덤하게 생성한다.
- T와 반대로; 것과 상보 일치 뉴클레오티드 염기쌍 규칙 다음 생성 C G와 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
- 8-9 뉴클레오티드 이상 반복 세그먼트를 사용하지 마십시오. 때와 같은 대표반복 세그먼트 요건이 만족 될 때까지 세그먼트를 설계 중에 등장 먹고, 가장 최근에 생성 된 뉴클레오티드 돌연변이.
- 4 개의 연속적인 A, C, G, 또는 T 염기를 사용하지 마십시오.
- 두 경우에, 즉 (결합 지점 주위 염기 슬라이딩 피하기 위해 (가닥의 대부분을, 각각 제 21 및 스물두번째 뉴클레오티드 예 T 및 G에 대한) 단일 가닥 결합 지점에서 미리 - 특정 뉴클레오티드를 사용 스물한번째 및 스물두번째 뉴클레오티드는 제 22 뉴클레오티드가)에 결합하도록되어 있음 21 뉴클레오티드는 염기에 결합하는 것이 가능했다, T이었다.
- 스트렙 라벨, 튜브에 사각형 변형, 다른 직사각형 및 다른 비늘에 걸쳐 튜브의 형성을 위해 수동 DNA 서열을 수정 SST에 노출 된 영역에 의한 응집을 방지 할 수있다.
- 폴리-T의 TRA와 분자 캔버스의 경계에 노출 된 도메인을 교체CTS.
- 스트렙 라벨링, 그들은 3 '비오틴이 수정 된 안티 핸들 스트랜드를 수용 할 수 있도록 손잡이 부분 (예컨대 안티 핸들 가닥으로 상보 상대방에 결합 할 수있는 성분 가닥 추가 엑스트라 세그먼트) 설계.
- 튜브에 사각형의 변환의 경우, 사각형에서 상단과 하단 행을 제거하고 누구의 해수면 온도 맨 윗줄에 두 번째와 맨 아래 행에 두 번째에 해당 타일에 특정 보완이 새 행을 삽입합니다.
- 다른 모양의 노출 된 단일 가닥 도메인의 경우, 10 ~ 11 뉴클레오티드 길이의 폴리-T 세그먼트로 교체, 또는 노출 된 도메인을 보완하고 10 ~ 11 뉴클레오티드 긴 폴리-T 세그먼트와 종료 가장자리 보호 장치에 의해 커버한다.
분자 캔버스 2. 준비
- oligonucleoti로부터의 RNase가없는 물에 용해 지정된 서열의 DNA 가닥 성분을 구하는표준 탈염와 10 nmol의 규모에 합성 올리고 뉴클레오티드와 V 바닥 96 웰 플레이트에 드 제조 업체. 원심 분리기 600 × g에서 약 10 초 동안 DNA 가닥과 함께 96 웰 플레이트.
- 피펫 2ml를 시험관에 가닥 당 100 μM (제조업체 사양)에서 28T 사각형 (그림 3A) × 24H에 대한 DNA 가닥과 362 우물에서 각각 1 μL. 가닥 당 200nm의 농도 가닥 혼합물의 스톡 용액을 만들기 위해 2 mL를 시험관에 증류수 탈 H 2 O의 138 μl를 추가.
- 스트랜드 혼합물, 10X 어닐링 버퍼 (50 mM 트리스, 산도 7.9, 10 mM의 EDTA, 250 mM의의 MgCl 2), 및 증류수 탈 H의 40 μL 2 O 0.2에 10 μL의 200 nm의 주식 솔루션의 50 μl를 추가 ㎖의 PCR 튜브. 이것은 1X 어닐링 버퍼 내의 분자 캔버스 100 μL 샘플을 만든다 (5 mM 트리스, pH가 7.9, 1 mM의 EDTA, 25 mM의의 MgCl 2).
- SAMPL을 어닐링25 ° C ~ 90 ° C에서 냉각 열 자전거 타는 17 시간 동안 전자. 다음 프로그램 서열 증폭기는 : C ° 당 5 분의 일정 속도로 61 ° C로 90 ° C에서 램프 다운; C °마다 20 분의 일정 속도로 25 ° C로 60 ° C에서 램프 다운; 샘플을 열 순환기 취출 될 수있을 때까지 4 ℃에서 배양한다.
- 기본 2 % 아가 로스 젤을 준비합니다.
- 600 ml의 비이커에 아가로 오스의 2.4 G를 측정한다. 비커 0.5X TBE 완충액 (44.5 mM 트리스 - 보레이트, pH가 8.3, 1 mM의 EDTA) 및 증류수, 탈 이온수 30㎖를 120 ml에 추가.
- 3 분 (- 끓는 후 60 초 이상 또는 40)에 대한 마이크로 웨이브. 2 %의 아가 로스 겔에서의 농도를 유지하는 데 도움이 물 30 mL를 첨가하여 증발 중에 손실을 보충 물.
- 냉수 조에서 1 분 동안 비커의 내용물을 소용돌이. 1.2 M의 MgCl 2의 1 ml의 (겔 10 mM의의 MgCl 2 농도를 만들기 위해) 추가 겔 재치를 미리 얼룩SYBR 안전 염료 H 6 μL (1 : 20,000).
- 건조 겔 상자에 겔 용액을 붓고 1.5 mm의 두께를 12도 겔 전기 빗를 삽입합니다. 심지어 플랫폼에서 30 분 - 솔루션은 15 공고히하자.
- 젤 실행 버퍼 (44.5 mM 트리스 - 보레이트, pH가 8.3, 1 mM의 EDTA, 10 mM의의 MgCl 2) 겔 상자에 부어. 로드 2 - 아가 로스 겔의 웰에 1킬로바이트의 DNA 사다리 3 μL. (파란색 0.25 % 브로 모 페놀, 5 mM 트리스, 1 mM의 EDTA, 10 mM의의 MgCl 2, 30 % 글리세롤) 6X 브로 모 페놀 블루 염료의 4 μL 분자 캔버스의 샘플 20 μL와 혼합하고, 또 다른 우물에 솔루션을로드 아가 로스 젤.
- 빙수 조에서 100 V로 2 시간 동안 기본 2 % 아가로 오스를 실행 (이것은 지표로서 역할을 할 수 있도록 청색에 도시 브로 모 페놀 블루, 빠른 성분 가닥보다 실행되도록 2 시간 실행 시간은 적절한 경우).
- 이미지 SYBR 안전한 염색을위한 적절한 필터 (도 2B와 겔 스캐너를 사용하여 젤
- 청색광 transilluminator가에서 날카로운 깨끗한 면도날을 사용 1킬로바이트의 DNA 래더 1,500 염기쌍 밴드 유사한 이동성 지배적 대역을 절제. 스핀 열에서 원하는 젤 조각 (들)을 배치 한 후 마이크로 튜브 유봉을 사용하여 미세 조각으로 젤을 분쇄. 4 ℃에서 3 분 동안 438 XG에 원심 분리기.
- 260 nm에서 자외선 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다.
- 기계를 교정하기 위해 빈으로 고순도의 DNase /의 RNase-무료 증류수 2 μL를 사용합니다.
- DNA 농도의 추정치를 얻기 위해 스핀 열에서 수집 된 샘플의 동등한 볼륨을 사용합니다. 260 nm의 UV 흡수로 얻어진 측정 농도 값 ( ""= NG / μL)는 AFM 및 TEM 이미징 희석 팩터를 결정하는데 도움이 될 것이다.
- ""(NG / μL)에 "B"(㎚) 다음 B = × 106 / (330에서 측정 된 농도 변환# 215; 뉴클레오티드의 수).
참고 : 염기의 분자량은 330g / 몰이다. 계산 된 몰 농도 값 및 AFM TEM 이미징 희석 계수를 결정한다. 60 NG / μL - 28T 구형 × 24H의 케이스에 관해서는, 정제 된 샘플에 대한 일반적인 측정은 약 10이다. 12 nM의 - 같은 구조의 뉴클레오티드 번호 14616 다이기 때문에, 몰 농도는 약 2이다. 최종 농도가 수집 수율에 의해 결정된다 -에서 원심 분리 (20 ~ 50 %) 및 겔 밴드의 체적은 (높은 용적은 더 정제 된 시료를 희석) 밖으로 절제.
3. 원자 힘 현미경 영상
- 평탄면을 얻을 촬상 스테이지 상 시험편 디스크를 배치 스카치 테이프를 이용하여 시편의 금속 디스크에 부착 된 운모를 벗겨.
- 28T × 24H의 정제 된 샘플 - (5 nM 내지 2) 5 μL이어서 1X 어닐링 완충액 40 μl를 추가갓 절단 운모 표면에 사각형입니다. 혼합물을 약 2 분 동안 정착하도록 허용합니다.
- 캔틸레버 홀더에 AFM 질화 실리콘 캔틸레버 칩을 설치합니다. 이미징을위한 - (상수 봄, K = 0.24 Nm의 -1 75 kHz에서 0 = 40 F 공진 주파수) C 삼각형의 팁을 사용합니다.
- 이미지 유체 태핑 모드에서 샘플. 검색을 위해 다음과 같은 이미지 파라미터를 사용하여 2 μm의 크기, 해상도 1024 라인, 0.5의 스캔 속도 스캔 - 1 Hz에서 (그림 2C)를.
- 필요한 경우, 29-DNA 결합 운모의 강도를 증가시키기 위해 10 μL 이상의 NiCl 2 10mM의 용액을 첨가.
스트렙 타비 딘 라벨 4. 샘플 준비
- 수동으로 특정 위치에서 핸들 가닥이 차례로 streptavid에 결합 할 수있는 비오틴 변형 방지 핸들 가닥, 보완으로 통합되도록 28T 사각형 × 24H를 디자인특히있다.
- 하단 윗줄 14 타일 14 타일 스페이서로서 두 뉴클레오티드 서열 (TT)로 구성되어 3 '17 뉴클레오티드 세그먼트와 15 뉴클레오티드 핸들 (GGAAGGGATGGAGGA)를 부착함으로써 분자 캔버스 수정 사각형 (그림 3A)의 행은 경계 레이블을. 이 시퀀스는 3 '비오틴 변성 방지 손잡이 스트랜드 (TCCTCCATCCCTTCC 비오틴)에 상보 적이다.
- 내부 라벨의 경우, 8 내부 타일과 사각형 (그림 4A)의 6 경계 타일 3 '17 뉴클레오티드 세그먼트를 연결합니다.
- 200 nm의 주식 솔루션을 만드는 28T 사각형 (334 가닥) × 24H의 구성 요소 가닥의 나머지 부분과 핸들 (경계 라벨링)와 28 가닥을 섞는다. 200 nm의 주식 솔루션을 얻기 28T 사각형 (348 가닥) × 24H의 구성 요소 가닥의 나머지 부분과 핸들 14 가닥 (내부 라벨)을 섞는다.
- 보의 경우0.2 - undary 라벨링, 100 μM 바이오틴 변형 방지 손잡이 가닥 6 μL, 10X 어닐링 완충액 10 μL와 증류수, 탈 이온수 34 ㎕를 0.1 가닥이 200nm 스톡 용액 50 μL를 추가 PCR 용액 시험관. 성분 가닥의 최종 농도는 100 ㎚이다과 안티 비오틴 변성 핸들 가닥의 최종 농도는 6000 ㎚이다. 방지 처리 비오틴 수정 가닥 바인딩 유리하게 100 %를 초과하므로 28 분자 28T 사각형 × 24H에 비오틴 수정 가닥 바인드를 안티 - 처리합니다.
- 내부 표지 용, 0.1 가닥이 200nm 스톡 용액 50 μL, 100 μM에서 내부 방지 처리 바이오틴 변형 된 가닥의 3 μL, 10X 어닐링 완충액 10 μL, 증류수, 탈 이온수의 37 μL를 추가 - 0.2 ㎖의 PCR 테스트 튜브. 성분 가닥의 최종 농도는 100 nM 내지 안티 핸들 비오틴 후 변형의 최종 농도 ED 스트랜드는 3000 ㎚이다. 28T 사각형 너무 방지 처리 비오틴 수정 가닥 × 24H에 방지 핸들 비오틴 수정 가닥 바인드 14 분자가 결합이 유리하게 100 %를 초과합니다.
- 2.3에 기재된 절차를 이용하여 17 시간 동안 열 사이 클러에 두 샘플을 어닐링.
- 단계 2.4에 설명 된대로 기본 2 % 아가 로스 젤을 준비합니다.
- 단계 2.5에 기재된 바와 같이 두 샘플을 정제.
- 단계 2.6에 기재된 바와 같이 원하는 DNA 구조물의 농도를 측정한다.
스트렙 타비 딘 라벨 5. 원자 힘 현미경
- 이미지 3 단계 (도 3b 및도 4b)에 기술 된 바와 같이 AFM을 이용하여 각각의 샘플.
- 촬상의 첫 번째 라운드 후에, 시료 용액에 10 mg의 스트렙 타비 딘의 1 μL /이어서 1X 어닐링 완충액의 40 μL를 추가한다. 혼합물 (도 3C와 4C)를 재 이미징하기 전에 약 2 분 동안 정착하도록 허용합니다.
- 직사각형에 기초 튜브를 설계하기 위해, 상단과 하단의 행을 제외 대신 성분 해수면 온도를 모두 유지한다. 누구의 해수면 온도 튜브 형태 (그림 5A)로 원래의 사각형을 고리 화하기 위해 각각의 컬럼의 상단과 하단 타일을 연결하여 설계에 새 행을 소개합니다.
- 상부 및 하부의 행 (336 가닥)이 200nm 스톡 용액을 얻었다 제외 28T 사각형 × 24H의 성분 가닥 가닥의 새로운 행 (14 가닥) 섞는다.
- 2.7 (그림 5B) - 겔 정제 2.2 단계를 따르십시오.
7. 투과 전자 현미경 영상
- 2 % 수성 포름산 우라 닐 염색 용액을 조제 증류수 3 ㎖에 우라 닐 포르 메이트 0.06 g을 단다. 주사기에 부착 된 0.2 μm의 필터를 사용하여 2 % 수성 포름산 우라 닐 염색 용액 필터.
- 5 μl를 추가5 N NaOH를 필터링 얼룩 용액 1ml를합니다. 간단히 20,000 X g에서 솔루션과 원심 분리기를 소용돌이.
- 25mA, 45 초, 0.1 밀리바, 음의 높은 인장 극성 : 글로우는 다음과 같은 설정으로 탄소 코팅 그리드 (코팅면이 위를 향하게) 방전.
- 가장자리에서 빛 배출기 처리 그리드를 잡기 위해 자동 폐쇄 집게를 사용합니다.
- 4 분의 그리드에 샘플의 3.5 μl를 피펫. 측면에서 그리드와 접촉 여과지를 가져옴으로써 샘플을 윅 여과지를 사용한다.
- 즉시 1 분 동안 그리드에 얼룩 솔루션의 3.5 μl를 추가합니다.
- 7.4과 같이 얼룩을 윅과 1 그리드에 대해 필터 종이를 보유 - 2 분.
- 10 K에서 80 K (그림 5C)에 이르기까지 다양한 배율 80 kV의에서 작동 JEOL JEM-1400을 사용하여 TEM 시편 홀더와 이미지에 격자를 전송합니다.
8. Molecul를 사용하여 임의의 모양을 구성AR 캔버스
- 모양을 확인하고 분자 캔버스에 모양에 해당하는 가닥을 선택합니다. 예를 들어 삼각형 모양의 경우, 분자 캔버스 (206) (362) 밖으로 가닥을 선택합니다.
- 10 폴리-T 세그먼트에 (즉 삼각형의 빗변을 따라 인) 노출 영역을 교체 - 11 개의 뉴클레오티드 (도 6a에 디자인 1), 또는 노출 된 영역에 상보 에지 보호대를 추가로 종료 10-11 염기 긴 폴리-T 세그먼트 (그림 6A 디자인 2) 응집을 방지합니다.
참고 : 간단하게 (보호자 가닥을 사용하지 않고) 삼각형의 픽셀에 해당하는 해수면 온도를 어닐링 집계 및 젤에 전혀 별개의 제품 밴드의 형성으로 이어질 것입니다. 더 자원을 효율적으로 다양한 형태의 가장자리 보호 설계를 사용; 그것은 (Figur를 대체 설계 (14)의 추가 세트에 비해 가닥 (도 6C)의 네 개의 세트를 추가로 필요전자 6B). - 코어 세트 (362 SST 캔버스), 설정 (1) * (SST의 도메인 1에 결합 모서리 보호대) 도메인 2에 결합, 세트 2 * (에지 보호를 포함하는 310 픽셀 분자 캔버스에 대한 가닥 라이브러리 만들기 SST)의, SST의 도메인 3에 결합 3 * (모서리 보호대)를 설정하고, 설정은 4 * (SST의 도메인 4)에 결합 에지 프로텍터 1344 에지 보호의 총을주고.
- 약 10 초 동안 다른 세트의 96 웰 플레이트를 원심 분리기. 피펫 아웃 특정 모양 스톡 용액을하기 위해 플레이트로부터 원하는 가닥.
- 모서리 보호대, 피펫 2 ㎖의 원심 분리기에 1 코어 세트에서 206 가닥의 μL, 0 세트 1 *에서, 0 세트 2 *에서, 세트 3 * 0과 세트 4 * 24 가닥 삼각형의 모양 튜브. DNA 가닥의 400 nm의 주식 솔루션을 만들기 위해 튜브에 증류수 탈 이온수 20 μl를 추가합니다.
- DNA의 STRA의 400 nm의 주식 솔루션의 50 μl를 추가 NDS, 10X 어닐링 완충액 B 0.2 ㎖의 PCR 용 튜브 (50 mM 트리스, pH가 7.9, 10 mM의 EDTA, 125 mM의의 MgCl 2) 스톡 용액 및 40 ㎕의 증류수, 탈 H 2 O 10 μL. 이것은 1X 어닐링 완충액 B의 삼각형의 100 μL 샘플을 만든다 (5 mM 트리스, pH가 7.9, 1 mM의 EDTA, 12.5 mM의의 MgCl 2) 가닥 당 약 200 nm의 농도 가닥.
- 단계 2.3에 기재된 바와 같이 17 시간 동안 열 순환기 혼합물을 어닐링.
- 단계 2.4에 설명 된대로 기본 2 % 아가 로스 젤을 준비합니다.
- 단계 2.5에 기재된 바와 같이 샘플을 정제.
- 단계 2.6에 기재된 DNA의 농도를 측정한다.
- 이미지 3 단계 (그림 7C 및 7D)에 설명 된대로 AFM에서 샘플.
- 선택과 같은 가닥 라이브러리를 사용하여 다른 모양에 대한 가닥을 섞는다. 다른 솔루션을 어닐링 및 AFM 이미징 동안 시간을 절약하기 위해 다른 모양의 정제 된 샘플을 결합한다.
- 복잡한 형태의 디자인을 지원하기 위해 사용자 지정 MATLAB 프로그램을 사용하십시오.
- 로봇 액체 핸들러 피펫 시퀀스의 형태로 명령어를 제공하도록 소프트웨어를 사용한다. 선택 대상 형상을 구성하는 스트랜드를 혼합하는 로봇 액체 핸들러를 사용.
주 : 형상 설계와 스트랜드 혼합은 인간의 오류를 줄이고 건설 덜 노동 집약적하게 자동화되었다.
10. 사각형 및 다른 저울에 걸쳐 튜브
- 단순히 병렬 나선 (H) 및 나선 회전 (T)의 숫자의 개수를 변화시킴으로써 다른 크기의 사각형 (도 10)을 구축.
- 특정 크기의 사각형을위한 3 단계를 따릅니다.
- 특정 크기의 튜브에 대한 6 단계를 따릅니다.
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Representative Results
해수면 온도 (도 1)의 자기 조립은도 2에 도시 된 바와 같이 다른 해수면 온도에 대한 DNA 서열은 스트렙 라벨링 있도록 최적화 / 변형 될 수있다., 28T 구형 × 24H을 얻었다 (도 3 및 4)의 변형 것 직사각형 튜브 (도 5), 튜브 및 다양한 크기의 사각형 (도 10)을 형성 해수면 온도의 프로그래머블 자기 조립 및 분자 캔버스 (도 8)를 이용하여, 임의의 2 차원 형상의 구조. 솔루션은 임의의 모양 (그림 7)의 노출 영역을 따라 응집으로 두 디자인 (도메인 대체 설계 및 에지 보호 설계) 시험 하였다. 두 가지 설계는 유사한 겔 수율 및 구조적 일체 성을 가지고 있지만, 더 적은 보조 종 (도 6)을 필요로하기 때문에 에지 보호 설계는 비용 효과적이다.인간의 에러를 줄이고, 시간을 절약하기 위해,도 9에 도시 한 바와 같이 스트랜드 피킹 및 혼합은 자동화 될 수있다.
단일 가닥 타일을 사용하여 분자 모양의 그림 1. 자기 조립 (self-assembly). (A) (12)에서 적응 표준 SST 모티브, (B) 왼쪽과 중간 :. 조립 해수면 온도의 두 묘사. 내부 해수면 온도는 42 기지의 전체 길이와 경계 해수면 온도가 21 기지를 가지고와 "L"을 표시하면서 "U"를 표시하고 있습니다. 왼쪽 그림에서 색상이 다른 도메인을 구분합니다. 중간 그림에서 색상이 다른 가닥을 구분합니다. 오른쪽 : SST 구조의 벽돌 벽보기의 개략도. 두꺼운 벽돌 전체 해수면 온도이며, 얇은 벽돌 경계 해수면 온도입니다. 둥근 모서리는 더 보완 페어링을 표시하지 않습니다. 중간 그림과 같이 색상이 개별 타일을 구분합니다. 모든 DIAG에서수양, 각 타일은 고유의 순서를 가지고있다. (C)를 다른 원하는 형상의 형성에 그림 B 결과에 사각형 디자인을 구성하는 SST의 컬렉션에서 가닥의 적절한 선택을 원천 징수 예 : 삼각형 (왼쪽) 또는 사각 링으로 (오른쪽). (D) 소정의 폭과 길이를 갖는 튜브의 설계. (E) SST 서열 (상부), 임의의 형상 (아래)의 전 합성 풀 감안할는에 가닥의 서브 세트를 선택하여 설계 될 수있다 스트랜드 혼합물 (진한 파란색 픽셀)과 나머지 (하늘색 픽셀) 제거에 사용합니다. 이 그림은 이전에 출판 그림 26에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
28T 사각형 × 24H 그림 3. 경계 표지. (A) 특정 BI의 개략도28T 사각형 × 24H를 otin 표지. 파란색으로 강조 가닥 핸들 가닥이다. 가닥 3 '비오틴 (검은 점)으로 표시 방지 핸들 가닥 있습니다 빨간색으로 강조. 스트렙 타비 딘 오렌지 볼로 묘사된다 (B) AFM 이미지를 스트렙 타비 딘 (스캔 크기 : 1 ㎛ × 1 ㎛) 추가하기 전에. 스트렙 타비 딘 추가 한 후 (C) AFM 이미지를. (스캔 크기 : 1 ㎛ × 1 ㎛). 삽입 된, 성공적인 라벨을 보여 줌 인보기. 그 스트렙 타비 딘 인해 제기 높이에 흰색 점 또는 줄무늬 중 하나로 등장합니다. 이 그림은 이전에 출판 그림 26에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4에28T 사각형 × 24H의 영원한 레이블. () 28T 사각형 × 특정 비오틴 표지 24H의 개략도. 파란색으로 강조 가닥 핸들 가닥이다. 가닥 3 '비오틴 (검은 점)으로 표시 방지 핸들 가닥 있습니다 빨간색으로 강조. 스트렙 타비 딘 오렌지 볼로 묘사된다 (B) AFM 이미지를 스트렙 타비 딘 (스캔 크기 : 1 ㎛ × 1 ㎛) 추가하기 전에. 스트렙 타비 딘 추가 한 후 (C) AFM 이미지를. (스캔 크기 : 1 ㎛ × 1 ㎛). 삽입 된, 성공적인 라벨을 보여 줌 인보기. 그 스트렙 타비 딘이 제기 높이로 인해 하얀 점 또는 줄무늬로 하나 등장합니다. 이 그림은 이전에 출판 그림 26에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
"항상"=> 페이지 내에서 
그림 5. 설계 및 28T 튜브 × 24H의 TEM 이미지. () 28T 배럴 × 24H의 개략도. 두 상단에 확대 된 뷰와 바닥 쇼 세부 세그먼트 정체성. 참고 세그먼트 a24.x * (예를 들어, a24.13 *) 및 b24.x * (예를 들어, b24.12 *) a24.x 세그먼트 보완 맨 위 행의 (예를 들어, a24.13) 및 b24.x (예를 들어, b24.12) 아래 행의; 이러한 상보성은 관형 구조체의 형성을 초래할 것으로 예상된다. (B) 2 % 아가 로스 네이티브 겔 전기 영동. U, 정제되지 않은; (레인 U에서 젤 추출) 정제 (P), (C) 배럴 구조의 TEM 이미지 (스케일 바 : 100 ㎚).. 이 수치는 이전에 출판 그림 26에서 수정되었습니다.ighres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 노출 스티커 도메인에 의해 발생 방지 집계에 두 디자인. (A)는 두 방법 중 나란히 데모 노출 영역을 커버한다. 짝이 끈적 도메인 (도메인 4) 빨간색, 점선 박스로 표시됩니다. 디자인 1 부대 도메인이 폴리 T 도메인 치환 된 도메인 교체 설계이다 (적색에 도시 및 "T"로 표시). 디자인 2 에지 보호 가닥과 짝 도메인을 커버 포함 가장자리 보호 디자인입니다 (빨간색으로 표시 및 "T-4 *"표시). 에지 보호대 가닥 노출 도메인 폴리 T 섹션 및 보수로 구성된다. 교체 영역 (디자인 1)와 연관된 (B) 다른 가능한 구성을 경계.노출 된 도메인이나 도메인을 남길 수 있습니다 14 가지 방법 (파란색으로 표시) 내부 SST가 있습니다. 적절한 가닥 치환은 각각의 상황에 빨간색으로 표시된다. (C) 에지 보호 설계 (디자인 2). (파란색) 하나의 내부 SST는이 디자인을 사용하여 노출 영역을 커버하는 네 개의 모서리 보호대 가닥 (빨간색)가 필요합니다. 이 그림은 이전에 출판 그림 26에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
SST 삼각형 7. 두 디자인 그림. (A) 및 (B)는 각각,도 8에 설계 한 (교체 영역) 및 디자인이 EDGE (보호)에 기초하여 회로도를 도시한다. 폴리 T 영역 (도면 T10 또는 T11)는 다음과 같이 도시된다블록도에 둥근 모서리. 인셋은 점선 박스로 표시된 구조의 확대도를 나타낸다. 스케일 바, 100 내지. (C)와 (D)의 AFM 이미지이다. 이 수치는 이전에 출판 그림 26에서 수정되었습니다.
(100) 다른 모양의 8 다이어그램 및 AFM 이미지를 그림. 구조 디자인은 상단 패널에 표시됩니다. 다크 블루 색상은 가닥이 포함 나타내는 반면 라이트 블루 색상의 혼합물에서 제외 캔버스 가닥을 나타냅니다. 명확화를 위해, 에지 보호대 가닥은 생략한다. 각 구조의 대응하는 AFM 이미지는 아래와 같이 설계된다. 각각의 이미지는 지역을 × 150 내지 150 nm 인 것이다. 100 독특한 모양이 있습니다. 10 아라비아 숫자, 라틴 알파벳의 26 대문자, 23 문장 부호와 keyboa이 포함되어RD 기호, 10 이모티콘, 9 점성술 기호 6 한자, 여러 기타 기호입니다. 이 그림은 이전에 출판 그림 26에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 9 로봇 자동화 흐름도.이 도면은 혼합 공정을 자동화 할 작업 흐름을 도시한다. 먼저, 사용자 MATLAB 프로그램 원하는 형상을 설계하는 데 사용된다. 다시 한번, 감색 사각형 스트랜드 혼합물에 포함되는 것으로 나타낸다. 설계가 완료되면, 프로그램은 로봇 액체 핸들러 피펫 명령들의 세트를 출력한다. 로봇 도면 되었음에 특정 형상에 적합한 가닥의 정확한 농도를 피펫잘 전자. 이어서, 혼합물을 생성 된 도형의 AFM 영상 뒤에 한 냄비 어닐링을 거친다. (이 그림은 이전에 출판 그림 26에서 수정되었습니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다른 저울의 맞은 편에 사각형 및 튜브 그림 10. 자기 조립 (self-assembly). (A) (왼쪽에서 오른쪽으로) 설계 치수는 다음과 SST 사각형의 AFM 이미지 :. 4H × 4T, 6H × 7T, 10T × 10H, 14T × 12H, 20T × 18H, 28T × 24H 및 34T × 36H ( B) 구조의 분자량은 대수 눈금에있다. 별표는 기준으로서 전형적인 M13 DNA 접기 구조의 중량을 나타낸다. (C) TEM 이미지177T × 8H × 28T, 55T × 8H, 8H 84T ×, 24H 28T × 및 12H : 해수면 온도 (왼쪽에서 오른쪽으로) 다음과 같은 설계 치수와 튜브. 모든 스케일 바는 100 nm의를 표시합니다. 이 그림은 이전에 출판 그림 26에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
구조 형성 공정에서, 자기 조립 DNA 나노 구조에 DNA 가닥 혼합물 (예., 15 mM)을 마그네슘 양이온의 적절한 농도를 유지하는 것이 중요하다. 유사하게, 아가로 오스 겔 특성화 / 정제 단계에서, 그것은 적절한 마그네슘 양이온 농도를 유지하는 것이 중요하다 (예., 10 mM)을 겔 전기 영동시 DNA 나노 구조를 유지하기 위해 겔 주행 버퍼. 28T 사각형 구조 × 24H를 들어, 우리는 다른 마그네슘 + + 농도 어닐링을 시험하고 구조가 일반적으로 10의 범위에서 형성되는 것을 발견 - (20 mM의 마그네슘 + +와 함께 최고의 형성 수율) 30 mM의 마그네슘 + +.
스캐 폴딩 종이 접기 구조와는 달리, SST 구조는 모듈 형 아키텍처를 가지고있다. 다른 모양은 SST 타일의 적절한 서브 세트를 선택함으로써 동일한 캔버스에서 설계 될 수있다. 또한 SST 구조 아프로 조립만 짧은 합성 DNA 가닥 미터 및 종이 접기 방법에 사용되는 긴 발판을 포함하지 않습니다. 따라서, SST 구조의 크기는 가능한 지지체의 길이에 의해 제한되지 않는다. DNA 종이 접기 방법이 종종 접힌 구조 나 펼쳐진 모노머를 생산하기 위해 최적화 할 수 있지만 그러나, SST는 부분적으로 형성된 구조 될 수 있으며, 따라서 이후의 사용을위한 젤 정화가 필요할 수 있습니다. 또한 인한 골격 가닥의 부족으로, SST 구조는 DNA 접기 대응 이상 "취성"일 수있다. SST 접근과 DNA 종이 접기 방식 모두 빠르게 진화하고 있으며, 사용자는 가장 자신의 특정 기능 요구에 맞는 방법을 선택하는 것이 좋습니다.
그것은 SST 방법에 의해 입증 된 바와 같이 로컬 바인딩의 상호 작용에 의해 매개 작은 단량체의 수백, 소정의 글로벌 형태로 자기 조립 할 수있는 타격이다. SST 접근 소에 표시된 기본 원칙DNA 가닥 옆 자료,이 문서에서 설명하는 기본적인 방법에 일반화 될 ULD, 적절한 수정 한 후, 다양한 재료로 자기 조립 복잡한 구조의 구조를 사용하도록 설정해야합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 해군 연구소 젊은 탐정 프로그램 상 N000141110914, 해군 연구비 N000141010827의 사무실, NSF 경력 상 CCF1054898, NIH 감독의 새로운 혁신 상 1DP2OD007292의 오피스와 (PY에) 생물학적 영감 공학 학부 시작 기금 위스 연구소에 의해 투자되었다 칭화 - 베이징 (BW에) 생명 과학의 시작 기금 센터.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Strands | Integrated DNA Technology | Section 3.1 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | Section 3.4.2 |
| Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | BIO-RAD | 731-6166 | Section 3.6 |
| Bruker's Sharp Nitride Lever Probes | Bruker AFM Probes | SNL10 | Section 4.3 |
| Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator | Invitrogen | G6600 | Section 3.6 |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428 000.414 | Section 3.6 |
| Transmission Electron Microscope | Jeol | Jem 1400 | Section 7.4 |
| Multimode 8 | Veeco | Section 4 | |
| Typhoon FLA 9000 Laser Scanner | GE Heathcare Life Sciences | 28-9558-08 | Section 3.5 |
| Ultrapure Distilled water | Invitrogen | 10977-023 | Section 3.7.1 |
| Mica disk | SPI Supplies | 12001-26-2 | Section 4.1 |
| Steel mounting disk | Ted Pella, Inc. | 16218 | Section 4.1 |
| carbon coated copper grid for TEM | Electron Microscopy Sciences | FCF400-Cu | Section 7.2 |
| tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 7.31 |
| glow discharge system | Quorum Technologies | K100X | Section 7.2 |
| DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler | BIO-RAD | PTC–0240G | Section 3.3 |
| Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | ThermoScientific | B2 | Section 3.4.3 |
| Seekam LE Agarose 500G | Lonza | 50004 | Section 3.4.1 |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp | ThermoScientific | SM1333 | Section 3.4.4 |
| Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer | ThermoScientific | Section 3.7 | |
| 0.2 um filter | Corning Inc. | 431219 | Section 7.1.2 |
References
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