Introduction
Anterior ácido nucleico de auto-montagem 1-25 trabalho levou à bem sucedida da construção de uma variedade de estruturas complexas, incluindo ADN 2 - 5,8,10 - 13,17,23 ou RNA 7,22 3,4,7 periódica, 22 e algorítmica 5 bidimensionais treliças, fitas 10,12 e tubos de 4,12,13, cristais 3D 17, poliedros 11 e finitos, 2D formas 7,8. Um método particularmente eficaz é o scaffold origami de DNA, em que uma cadeia simples de andaime é dobrado por muitos fios auxiliares curtas descontínuas, para formar uma forma complexa 9,14 - 16,18 - 21,25.
Recentemente, relatou um método para a construção de nanoestruturas discretos com formas 2D prescritas utilizando azulejos de cadeia simples (SST), e demonstraram as estruturas com complexidade comparável à origami de ADN 26. Este article é uma adaptação do nosso trabalho anterior 26 e descreve os protocolos detalhados para organizar SSTs individualmente endereçáveis em formas 2D finitos sofisticados, com dimensões precisamente prescritos (larguras e comprimentos) e morfologias. Uma das principais vantagens do método de SST é a sua modularidade. Cada componente SST de uma estrutura serve como uma unidade de construção modular na assembléia, e diferentes subconjuntos destes SSTs produzir formas distintas. Assim, estabelecemos uma plataforma geral para construir nanoestruturas com tamanhos e formas prescritas, de filamentos de DNA sintéticas curtas.
TSMs conter quatro domínios, cada um de 10 ou 11 nucleótidos de comprimento (Figura 1A). As SSTs vincular tal que as suas hélices paralelas criar uma estrutura de DNA realizada em conjunto por ligações de crossover. Cada passagem é o fosfato entre os domínios 2 e 3. O fosfato é esticado artificialmente nos diagramas para claridade visual. Os crossovers são espaçados duas voltas helicoidais (21 bases) de distância (<forte> Figura 1B). Os retângulos compostos são referidos por suas dimensões do número de hélices e voltas helicoidais. Por exemplo, um rectângulo que é de seis hélices de largura e oito helicoidal gira tempo é referida como um 6H × T8 rectângulo. SSTs pode ser deixado de fora, adicionado, ou de outra forma reorganizados para criar estruturas de formas e tamanhos (Figura 1C) arbitrárias. Por exemplo, um formato rectangular pode ser enrolada em forma de tubo com um comprimento desejado e um raio (Figura 1D).
Alternativamente, a estrutura rectangular SST pode ser visto como uma tela molecular constituído por SST pixels, cada um de 3 nm de 7 nm. Neste estudo, utilizamos uma lona molecular de 310 full-length SSTs internos, 24 SSTs-metragens que compõem os limites esquerdo e direito, e 28 SSTs metade do comprimento, formando os limites superior e inferior. A tela tem 24 hélices duplas ligações por cruzamentos e cada hélice contém 28 voltas helicoidais (294 bases) e, por conseguinte, é designado porum 24H × 28T lona retangular. O 24H × tela 28T tem um peso molecular semelhante ao de uma estrutura origami de DNA criado a partir de um fago M13 andaime.
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Protocol
1. DNA Sequence projeto
- Use software UNIQUIMER 27 para projetar uma estrutura SST-finito, especificando o número de hélices duplas, comprimentos de hélice superior e inferior para cada dupla hélice, eo padrão cruzado para criar um 24H × lona 28T. Depois de definir estes parâmetros, a arquitetura geral (vertente composição eo arranjo complementaridade) é ilustrado graficamente no programa.
- Gerar sequências para os fios da estrutura especificada para atender o arranjo complementaridade e requisitos adicionais (se houver). Conceber sequências de ADN, minimizando a sequência de simetria 28 (para a maioria das estruturas).
- Gerar nucleótidos (A, C, G e T) aleatoriamente um por um.
- Nucleotídeos Igualar complementares aos gerados seguindo a regra de emparelhamento de bases de A a T e vice-versa; C a G e vice-versa.
- Não use segmentos de repetição além oito ou nove nucleotídeos. Quando tal repcomer segmentos surgir durante o projeto, mutar os nucleotídeos gerados mais recentemente até que a exigência de repetição do segmento está satisfeito.
- Não utilizar quatro bases A, C, G ou T consecutivos.
- Use nucleótidos pré-especificados nos pontos de ligação de cadeia simples (por exemplo T e G como o vigésimo primeiro e vigésimo segundo nucleótidos, respectivamente, para a maioria dos fios) para evitar o deslizamento bases em torno dos pontos de ligação (por exemplo, se ambos vigésimo primeiro e vigésimo segundo nucleotídeos foram T, foi possível para o vigésimo primeiro nucleótido que se ligam ao nucleótido que o vigésimo segundo nucleótido é suposto vincular a).
- Modificar as sequências de ADN manualmente para rotulagem de estreptavidina, a transformação de rectângulos dentro de tubos, a formação de diferentes rectângulos e tubos em diferentes escalas, e para evitar a agregação causada pelos domínios expostas sobre SST.
- Substitua os domínios expostos no limite da tela molecular com tra poli-Tcts.
- Para a marcação de estreptavidina, desenhar os segmentos de pega (o segmento adicional acrescentada ao componente de fio que se pode ligar a um homólogo complementar, como uma cadeia anti-handle) tais que pode acomodar uma cadeia anti-pega com 3 'modificação biotina.
- Para a conversão de um rectângulo em um tubo, remover as linhas superior e inferior do rectângulo e inserir uma nova linha cuja TSMs tem complementaridade específicas para as peças correspondentes no segundo a linha superior e a segunda a linha inferior.
- Para um domínio único exposta cadeia de diferentes formas, substituir com segmentos poli-T de 10-11 nucleótidos de comprimento, ou cobrir por protetores de borda que são complementares ao domínio expostos e terminam com um 10-11 nucleotídeos longos segmentos de poli-T.
2. Preparação dos Canvas Molecular
- Obter fios de componentes de ADN de sequências especificadas dissolvidos em água isenta de ARNase de uma oligonucleotide fabricante em V fundo placas de 96 poços com oligonucleotídeos sintetizados em uma escala de 10 nmol com dessalinização padrão. Centrífuga as placas de 96 poços com as fitas de DNA para cerca de 10 s a 600 x g.
- Pipetar 1 mL de cada uma das cavidades 362 com as cadeias de ADN para a 24H × 28T rectângulo (Figura 3A), a 100 uM por cordão (especificação do fabricante) para um tubo de ensaio de 2 ml. Adicionar 138 uL de água destilada desionizada H 2 O para o tubo 2 ml de ensaio para fazer uma solução estoque da mistura Strand a uma concentração de 200 nM por cordão.
- Adicionar 50 ul da solução estoque 200 nM de mistura vertente, 10 ul de tampão 10X de recozimento A (50 mM de Tris, pH 7,9, EDTA 10 mM, 250 mM MgCl2), e 40 ul de água destilada desionizada H 2 O para uma solução a 0,2 ml tubo de PCR. Isto faz com que uma amostra de 100 ul da tela molecular em 1X tampão de emparelhamento A (5 mM de Tris, pH 7,9, 1 mM de EDTA, 25 mM de MgCl2).
- Emparelhar o sample durante 17 horas num aparelho de ciclos térmicos de arrefecimento de 90 ° C a 25 ° C. Programa do termociclador como se segue: a rampa para baixo a partir de 90 ° C a 61 ° C a uma velocidade constante de 5 ° C por min; rampa para baixo a partir de 60 ° C a 25 ° C a uma velocidade constante de 20 min por ° C; e incubar a 4 ° C até que a amostra pode ser retirado do termociclador.
- Preparar um 2% de gel de agarose nativa.
- Medir 2,4 g de agarose em um copo de 600 ml. Adicionar 120 ml de tampão TBE 0,5x (44,5 mM Tris-borato, pH 8,3, EDTA 1 mM) e 30 ml de água desionizada destilada no copo.
- Microondas durante 3 minutos (ou 40 - 60 segundos mais depois da fervura). Repor a água perdida durante a evaporação através da adição de 30 ml de água, o que ajuda a manter a concentração de agarose, o gel a 2%.
- Agitar o conteúdo do copo durante 1 min num banho de água fria. Adicionar 1 ml de 1,2 M de MgCl2 (para fazer uma de 10 mM de MgCl 2 concentração no gel) e pré-manchar o engenho gelh 6 ul de corante SYBR Seguro (1: 20.000).
- Despeje a solução de gel em uma caixa de gel seco e inserir um 1,5 mm de espessura de 12 poços pente eletroforese em gel. Deixar a solução solidificar para 15 - 30 min em uma plataforma ainda.
- Pour tampão de gel de corrida (44,5 mM Tris-borato, pH 8,3, EDTA 1 mM e MgCl2 10 mM) na caixa de gel. Carga 2 - 3 mL de 1 kb escada de DNA em um poço de gel de agarose. Misturar 4 ul de corante azul de bromofenol a 6X (0,25% azul de bromofenol, Tris 5 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 10 mM e glicerol a 30%) com 20 ul da amostra da tela molecular e carregar a solução em outro poço do em gel de agarose.
- Execute o nativo 2% de agarose durante 2 horas a 100 V num banho de água gelada (azul de bromofenol, mostrado em azul, corre mais rápido do que fios de componentes para que ele possa servir como um indicador de que se o tempo de 2 horas de corrida é o caso).
- Imagem do gel utilizando um scanner de gel com um filtro adequado para o SYBR mancha segura (Figura 2B
- Em uma luz azul transilluminator, extirpar a banda dominante com mobilidade similar à faixa de 1.500 pares de bases do DNA escada 1 kb usando uma lâmina de barbear limpa afiada. Coloque a peça de gel desejada (s) em uma coluna de rotação e, em seguida, triturar o gel em pedaços finos utilizando um pilão microtubo. Centrifuga-se a 438 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Medir a concentração do ADN utilizando um espectrofotómetro de ultra-violeta a 260 nm.
- Utilizar 2 ul de ADNase ultrapura / água destilada-RNase livre como o branco para calibrar a máquina.
- Utilizar um volume equivalente de a amostra recolhida a partir da coluna de centrifugação para obter uma estimativa da concentração de ADN. O valor medido de concentração ("um" = ng / ul) obtida a uma absorção de UV de 260 nm vai ajudar a determinar o factor de diluição para a AFM e de imagem TEM.
- Converter a concentração medida a partir de "um" (ng / mL) com "b" (nM) seguinte b = a x 10 6 / (330 &# 215; número de nucleótidos).
NOTA: O peso molecular de um nucleótido é de 330 g / mol. O valor da concentração molar calculada irá determinar o fator de diluição para a AFM e TEM de imagem. Como para o caso de um 24H × 28T rectângulo, a medição comum para a amostra purificada é de cerca de 10-60 ng / mL. À medida que o número de nucleótidos de uma tal estrutura é 14,616 Da, a concentração molar é de cerca de 2-12 nM. A concentração final é determinada pela recolha de rendimento (cerca de 20 - 50%) a partir da centrifugação e o volume da banda de gel excisada para fora (quanto maior o volume, o mais diluir a amostra purificada).
3. Microscopia de Força Atômica Imagem
- Descasca mica ligado a um disco de amostra metálica usando fita adesiva para obter uma superfície plana e coloque o disco de amostra para o palco de imagem.
- Adicionar 40 ul de tampão de emparelhamento 1X A seguido por 5 ul (2-5 nM) da amostra purificada do 24H × 28Tretângulo para a superfície recém-mica clivada. Deixe a mistura de se contentar com cerca de 2 min.
- Instale AFM chip de cantilever nitreto de silício em um suporte cantilever. Use uma ponta triangular C (freqüência de ressonância, f 0 = 40-75 kHz; mola constante, k = 0,24 Nm -1) para a imagem latente.
- Uma imagem de amostra no modo de tocar fluido. Utilize os seguintes parâmetros de imagem para digitalização: digitalização tamanho de 2 mm, 1.024 linhas de resolução e velocidade de varredura de 0,5-1 Hz (Figura 2C).
- Se necessário, adicionam-se 10 ul ou mais de 10 mM de NiCl2 solução para aumentar a resistência de ligação de ADN 29-mica.
4. Preparação de Amostras para Streptavidin Labeling
- Criar manualmente o rectângulo 24H × 28T tal que fios de pega em locais específicos são incorporados para serem complementares às cadeias anti-pega com modificação biotina, que por sua vez são capazes de se ligar a streptavidem especificamente.
- Modificar a tela molecular, anexando um 'segmento de 3 17 nucleótidos, que consiste de uma sequência de duas sequências de nucleótidos (TT) como um espaçador e um identificador de 15 nucleótidos (GGAAGGGATGGAGGA) para os azulejos 14 na fila superior 14 e na parte inferior telhas linha do rectângulo (Figura 3A) para rotular o limite. Esta sequência é complementar de uma 3 'biotina modificada cadeia anti-pega (TCCTCCATCCCTTCC-biotina).
- Para a rotulagem interna, anexar o segmento 3 '17 nucleotídeos para 8 azulejos internos e 6 azulejos de contorno do retângulo (Figura 4A).
- Misturar os fios 28 com alças (rotulagem limite) com o resto dos fios que compõem o rectângulo 24H × 28T (334 fios) para fazer uma solução estoque 200 nM. Misturar os fios 14 com alças (rotulagem interno) com o resto dos fios que compõem o rectângulo 24H × 28T (348 fios) para se obter uma solução estoque 200 nM.
- Para borotulagem undary, adicionar 50 ul da solução estoque 200 nM dos fios, 6 uL de 100 uM de biotina os fios modificado anti-pega, 10 ul de 10X o recozimento tampão A, e 34 ul de água destilada desionizada para um 0,1-0,2 tubo de ensaio ml PCR. A concentração final da cadeia componente é de 100 nM e a concentração final do fio modificado anti-biotina pega é de 6000 Nm. Note-se que 28 moléculas do anti-lidar com biotina modificada cadeia se ligam a um 24H × 28T retângulo para a cadeia anti-lidar com biotina modificada é superior a 100% para fazer a ligação favorável.
- Para a marcação interna, adicionar 50 ul da solução estoque 200 nM dos fios, 3 ul de anti-lidar com o fio interno biotina modificada a 100 uM, 10 ul de tampão de emparelhamento 10X a A, 37 ul de água destilada desionizada para um 0,1 - 0,2 ml de tubo de ensaio de PCR. A concentração final da cadeia componente é de 100 nM e a concentração final de biotina de anti-modifi punho ed vertente é de 3000 nM. Note-se que 14 moléculas do anti-handle biotina modificada cadeia se ligam a um 24H × 28T retângulo para lidar com anti-cadeia modificada biotina é superior a 100% para fazer a ligação favorável.
- Recozer ambas as amostras em um termociclador durante 17 horas utilizando os passos descritos em 2.3.
- Preparar um 2% de gel de agarose nativa como descrito nas etapas 2.4.
- Purifica-se ambas as amostras, tal como descrito nas etapas 2.5.
- Medem-se as concentrações das estruturas de ADN desejadas conforme descrito nas etapas 2.6.
5. Microscopia de Força Atômica para a rotulagem Streptavidin
- Imagem cada amostra utilizando um AFM tal como descrito no passo 3 (Figuras 3B e 4B).
- Depois da primeira ronda de imagem latente, adicionar 40 ul de tampão de emparelhamento 1X A seguido por 1 ul de estreptavidina a 10 mg / ml para a amostra. Deixe a mistura de se contentar com cerca de 2 min antes recriação de imagens (Figuras 3C e 4C).
- A fim de projetar um tubo com base no retângulo, manter todos os componentes em SSTs lugar, exceto as linhas superior e inferior. Introduzir uma nova linha cujo SSTs são projetados concatenando os superiores e inferiores meias-telhas de suas respectivas colunas para ciclizar o retângulo original em um tubo de conformação (Figura 5A).
- Misture a nova linha de fios (fios 14) com os fios que compõem o 24H × 28T rectângulo excluindo as linhas superior e inferior (336 cadeias) para se obter uma solução estoque 200 nM.
- Seguir a purificação em gel de passos 2,2 - 2,7 (Figura 5B).
7. Microscópio Eletrônico de Transmissão de imagem
- Pesar 0,06 g de formiato de uranilo em 3 ml de água destilada para preparar uma solução de formato de mancha de uranilo aquoso a 2%. Filtra-se a solução de formato de mancha de uranilo aquoso a 2%, utilizando um filtro de 0,2 um ligado a uma seringa.
- Adicionam-se 5 ul deNaOH 5 N para 1 mL de solução de coloração foi filtrada. Resumidamente vortex a solução e centrifugar a 20000 x g.
- Fulgor descarregar as grades revestidas de carbono (lado revestido virado para cima) com as seguintes configurações: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar e polaridade Alta Tensão negativa.
- Use uma pinça de fecho automático para agarrar uma grade tratados brilho descarregador da borda.
- Pipetar 3,5 mL de amostra para a grade para 4 min. Utilizar um pedaço de papel de filtro para pavio fora da amostra, levando o papel de filtro em contacto com a rede, a partir do lado.
- Imediatamente adicionar 3,5 ml da solução de coloração sobre a grelha durante 1 min.
- Pavio fora a mancha como em 7.4 e mantenha o papel de filtro contra a grade para 1 - 2 min.
- Transfira a grade para um suporte de amostra TEM e imagem usando um JEOL JEM-1400 operado a 80 kV com ampliação variando de 10 K para 80 K (Figura 5C).
8. A construção de formas arbitrárias usando a Molecular Canvas
- Identificar uma forma e seleccionar os fios que correspondem à forma sobre a tela molecular. Para uma forma de triângulo por exemplo, selecionar 206 362 fios para fora da tela molecular.
- Substituir o domínio expostos (isto é, ao longo da hipotenusa do triângulo) com um segmento de poli-T 10-11 nucleótidos de comprimento (desenho 1 na Figura 6A), ou adicionar um protector de arestas que é complementar ao domínio exposta e terminá-la com um 10-11 nucleótidos de comprimento do segmento de poli-T (desenho 2 na Figura 6A) para evitar a agregação.
NOTA: Simplesmente recozimento das TSM que correspondem aos pixels do triângulo (sem usar fios protector) vai levar a agregação e nenhuma formação de banda do produto distinto num gel. Use o projeto protetor de borda de várias formas, pois é mais eficiente dos recursos; ele requer apenas quatro conjuntos de fios adicionais (Figura 6c), em comparação com 14 conjuntos adicionais na concepção de substituição (Figure 6B). - Criar uma biblioteca de cadeia para a tela molecular 310-pixel que inclui o núcleo set (a tela 362 SST), grupo 1 (* protetores de borda que se ligam a um domínio de um SST), jogo 2 * (protetores de borda que se ligam ao domínio 2 de um SST), 3 Set * (protetores de borda que se ligam ao domínio 3 de um SST) e conjunto de 4 * (protetores de borda que se ligam ao domínio 4 de SST) para dar um total de 1.344 protetores de borda.
- Centrifugar as placas de 96 poços para os diferentes conjuntos de cerca de 10 s. Pipetar para fora os fios desejados a partir das placas, a fim de produzir uma solução stock de uma certa forma.
- Para a forma de um triângulo com protetores de borda, pipeta 1 ml de 206 fios do conjunto de núcleo, 0 conjunto de 1 *, 0 conjunto de 2 *, 0 conjunto de 3 * e 24 cordões de conjunto de 4 * em um 2 ml de centrífuga tubo. Adicionar 20 ul de água desionizada destilada ao tubo para fazer uma solução estoque 400 nM das cadeias de ADN.
- Adicionar 50 ul da solução estoque 400 nM de ADN stra nds, 10 ul de tampão de emparelhamento 10X a B (mM de Tris, pH 7,9, 10 mM de EDTA, 125 mM de MgCl 2 50) solução de estoque e 40 ul destilada H2O desionizada para um tubo de PCR de 0,2 ml. Isto faz com que uma amostra de 100 ul do triângulo em 1X tampão de emparelhamento B (5 mM de Tris, pH 7,9, EDTA 1 mM, MgCl2 12,5 mM) com fios a uma concentração de cerca de 200 nM por cordão.
- Recozer a mistura em um termociclador durante 17 horas como descrito no passo 2.3.
- Preparar um 2% de gel de agarose nativo tal como descrito no passo 2.4.
- Purifica-se a amostra, tal como descrito na etapa 2.5.
- Medir a concentração de ADN como descrito no passo 2.6.
- Imagem da amostra sob AFM tal como descrito no passo 3 (Figura 7C e 7D).
- Escolher e misturar fios para diferentes formas usando a mesma biblioteca vertente. Emparelhar as diferentes soluções e combinar amostras purificadas de diferentes formas para economizar tempo durante AFM imagem.
- Use um programa MATLAB personalizado para auxiliar no projeto de formas complexas.
- Usar o software para entregar instruções sob a forma de uma sequência de pipetagem a um manipulador de robô líquido. Use o manipulador de líquidos robô para selecionar e misturar os fios que constituem a forma de destino.
NOTA: Projeto Forma e vertente mistura foi automatizado para reduzir o erro humano e fazer a construção menos trabalho intensivo.
10. retângulos e tubos em diferentes escalas
- Construir diferentes rectângulos de tamanho (Figura 10), simplesmente alterando o número de hélices paralelas (H) e o número de voltas helicoidais (T).
- Siga o passo 3 para um retângulo de tamanho específico.
- Siga o passo 6 para um tubo de tamanho específico.
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Representative Results
A auto-montagem de SST (Figura 1) vai produzir uma 24H × 28T rectângulo, conforme ilustrado na Figura 2. As sequências de ADN para as diferentes SST pode ser modificada / optimizado para permitir rotulagem estreptavidina (Figura 3 e 4), a transformação de um retângulo para dentro de um tubo (Figura 5), a auto-montagem de SST programável para formar tubos e rectângulos de diversos tamanhos (Figura 10), e a construção de formatos arbitrários 2D utilizando a tela molecular (Figura 8). Dois projetos (projeto de substituição de domínio e design de protetor de borda) foram testados como soluções para agregação ao longo domínios expostas de formas arbitrárias (Figura 7). Ambos os projetos têm um rendimento comparável gel e integridade estrutural, mas o projeto protetor de borda é mais rentável, uma vez que requer menos espécies auxiliares (Figura 6).Strand e colheita de mistura pode ser automatizado, como mostrado nas Figuras 9 a reduzir o erro humano e economizar tempo.
Figura 1. A auto-montagem de formas moleculares usando telhas de cadeia simples. (A) O motivo SST canônica, adaptado a partir de 12 (B) Esquerda e meio:. Duas representações de SSTs montados. SSTs interiores tem um comprimento total de 42 bases e são rotulados de "U", enquanto SSTs de fronteira têm 21 bases e são rotulados como "L". No diagrama da esquerda, cores distinguir diferentes domínios. No diagrama do meio, cores distinguir diferentes vertentes. Direita: Um diagrama esquemático da vista da parede de tijolo de estruturas de TSM. Tijolos grossos são SSTs completos e tijolos finos são SSTs de fronteira. Bordas arredondadas não indicam emparelhamento complementar. Como na figura do meio, cores distinguir azulejos individuais. Em todos diagcarneiros, cada telha tem uma sequência única. (C) A omissão de uma selecção adequada dos fios da colecção SST que compõem o desenho rectângulo na figura b, resulta na formação de uma forma desejada diferente, tal como um triângulo (esquerda) ou um anel rectangular (à direita). (D) A concepção de um tubo com uma largura e comprimento predeterminado. (E) Dada uma piscina pré-sintetizado de sequências de TSM (parte superior), formas arbitrárias (inferior) pode ser projetado pela escolha de um subconjunto de fios de utilizar na mistura de vertente (escuros pixels azuis) e eliminar o resto (luz pixels azuis). Esta figura foi modificada a partir de um valor publicado anteriormente 26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Limite Rotulagem de 24H × 28T Retângulo. (A) Desenho esquemático do bi específica24H × 28T-Otin rectângulo etiquetado. As vertentes destacadas em azul são as vertentes do punho. Os fios destacados em vermelho são os fios anti-pega marcadas com 3 'biotina (pontos pretos). Streptavidin é retratado como uma bola laranja imagem (B) antes de adicionar AFM (tamanho de digitalização: 1 mm × 1 mm) estreptavidina.. (C) AFM imagem após a adição de estreptavidina (tamanho de digitalização: 1 mm × 1 mm). Inset, uma visão ampliada em mostrar rotulagem bem sucedido. Note que estreptavidina apareceu tanto como pontos ou listras brancas devido às suas alturas elevadas. Esta figura foi modificada a partir de um valor publicado anteriormente 26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Emternal Rotulagem de 24H × 28T Retângulo. (A) Desenho esquemático da biotina 24H específico marcado × 28T retângulo. As vertentes destacadas em azul são as vertentes do punho. Os fios destacados em vermelho são os fios anti-pega marcadas com 3 'biotina (pontos pretos). Streptavidin é retratado como uma bola laranja imagem (B) antes de adicionar AFM (tamanho de digitalização: 1 mm × 1 mm) estreptavidina.. (C) AFM imagem após a adição de estreptavidina (tamanho de digitalização: 1 mm × 1 mm). Inset, uma visão ampliada em mostrar rotulagem bem sucedido. Note que estreptavidina apareceu quer como pontos brancos ou listras devido às alturas elevadas. Esta figura foi modificada a partir de um valor publicado anteriormente 26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 5. Projeto e TEM Imagem do 24H × 28T Tube. (A) Desenho esquemático do barril 24H × 28T. Duas visões zoom-in na parte superior e as identidades segmento detalhados mostram inferior. Note-se que os segmentos a24.x * (por exemplo, a24.13 *) e b24.x * (por exemplo, b24.12 *) da linha superior são complementares a segmentos a24.x (por exemplo, a24.13) e b24.x (por exemplo, b24.12) da linha de fundo; tal complementaridade se espera que resulte na formação da estrutura tubular. (B) electroforese em gel de agarose a 2% nativa. L, não purificada; Imagem TEM da estrutura do tambor P, purificado (por extracção a partir de gel de pista L) (C) (barra de escala: 100 nm).. Esta figura foi modificada a partir de um valor publicado anteriormente 26."target =" _ blank ighres.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Dois projetos para prevenir a agregação Causados por Exposta Pegajoso domínios. (A) Uma demonstração lado-a-lado dos dois métodos para cobrir os domínios expostas. O domínio pegajosa não pareado (domínio 4) é indicado com uma caixa vermelha, frustradas. Desenho 1 é o desenho de domínio de substituição, em que o domínio desemparelhado está substituído por um domínio poli-T (mostrada em vermelho e rotulado como "T"). Projeto 2 é o projeto protetor de borda, que envolve cobrindo o domínio não pareado com um cordão protetor de borda (mostrada em vermelho e rotulados "T-4 *"). A cadeia protector de arestas é composto por uma secção de poli-T e um complemento para o domínio exposta. (B) Os diferentes configurações de contorno possíveis associados com a substituição de domínio (desenho 1).Há 14 maneiras diferentes um SST interno (mostrado em azul) podem deixar um domínio ou domínios expostos. As substituições filamentos apropriados são mostrados em vermelho para cada situação. (C) O projeto protetor de borda (projeto 2). Uma SST interna (azul) requer apenas quatro vertentes protetor de borda (vermelhos) para cobrir domínios expostos usando este projeto. Esta figura foi modificada a partir de um valor publicado anteriormente 26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Dois projetos para o Triângulo SST. (A) e (B) mostram esquemas baseados no design 1 (substituição de domínio) e design 2 (protector de arestas) da Figura 8, respectivamente. Uma região de poli-T (T10 ou T11 na figura) é descrito comoum canto arredondado no diagrama de blocos. A inserção mostra uma vista ampliada da estrutura indicada com a caixa a tracejado. As barras de escala, 100 nm. (C) e (D) são as imagens AFM. Esta figura foi modificada a partir de um valor publicado anteriormente 26.
Figura 8. Diagramas e AFM Imagens de 100 formas diferentes. Estrutura projetos são exibidos nos painéis superiores. Luz coloração azul indica os fios de lona deixados de fora da mistura, enquanto escuro coloração azul indica os fios incluído. Para maior clareza, fios protetor de borda são omitidos. Uma imagem AFM correspondente de cada estrutura é mostrada a seguir a sua concepção. Cada imagem é de 150 nm x 150 nm na área. Há 100 formas originais. Incluem-se 10 números arábicos, as 26 letras do alfabeto latino capital, 23 sinais de pontuação e keyboasímbolos rd, 10 emoticons, 9 símbolos astrológicos, 6 caracteres chineses, e vários símbolos diversos. Esta figura foi modificada a partir de um valor publicado anteriormente 26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9. Robot Automation Diagrama de Fluxo. Este diagrama mostra o fluxo de trabalho usado para automatizar o processo de mistura. Em primeiro lugar, um programa personalizado MATLAB é utilizado para desenhar a forma desejada. Mais uma vez, rectângulos azuis escuras indicam os fios para ser incluído na mistura. Depois de o desenho é completado, o programa gera um conjunto de instruções de pipetagem para o manipulador de líquidos robótico. O robô pipetas as concentrações corretas dos fios apropriados para uma forma particular em um platum e bem. A mistura é então submetida a um recozimento pote, seguido por AFM de imagem das formas resultantes. (Esta figura foi modificada a partir de um valor publicado anteriormente 26). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10. Auto-Assembléia de retângulos e tubos em diferentes escalas. (A) imagens de AFM de retângulos SST com as seguintes dimensões projetado (da esquerda para a direita):. 4H × 4T, 6H × 7T, 10H × 10T, 12H × 14T, 18H × 20T, 24H × 28T e 34T (36H × B) Os pesos moleculares das estruturas são numa escala logarítmica. O asterisco indica o peso de uma estrutura de ADN de M13 origami típica como referência. (C) imagens de TEMde tubos de SST com as seguintes dimensões projetadas (da esquerda para a direita): 8H × 28T, 8H × 55T, 8H × 84T, 24H × 28T, e 12H × 177T. Todas as barras de escala mostrar 100 nm. Esta figura foi modificada a partir de um valor publicado anteriormente 26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No passo de formação da estrutura, é importante manter uma concentração de catiões de magnésio apropriado (por exemplo., 15 mM) na mistura cadeia de ADN para nanoestruturas de DNA auto-montar. Do mesmo modo, no passo de caracterização em gel de agarose / purificação, é importante manter uma concentração de catiões de magnésio apropriado (por exemplo., 10 mM) em gel e o tampão de gel de corrida para reter as nanoestruturas de ADN durante a electroforese. Para a estrutura 24H × 28T rectângulo, testou-se o recozimento em diferentes concentrações de Mg ++ e descobriram que a estrutura formada tipicamente na gama de 10 - 30 mM de Mg ++ (com o melhor rendimento de formação com cerca de 20 mM de Mg ++).
Ao contrário da estrutura origami scaffolded, a estrutura SST tem uma arquitetura modular. As formas diferentes podem ser projetados a partir da mesma tela, selecionando o subconjunto adequado de telhas de TSM. Além disso, a estrutura é montada SST from cadeias de ADN sintéticas única curta e não envolve uma longa estrutura de suporte que é utilizado na abordagem origami. Por conseguinte, o tamanho da estrutura SST não é restrito pelo comprimento do andaime disponíveis. No entanto, enquanto a abordagem origami de DNA pode muitas vezes ser optimizados para produzir tanto estruturas dobradas ou não dobradas monómeros, SST pode resultar em estruturas parcialmente formados e, assim, podem necessitar de purificação em gel para utilização subsequente. Além disso, devido à falta de uma cadeia de andaime, uma estrutura SST pode ser mais "frágil" do que a sua contraparte origami de DNA. Tanto a abordagem SST ea abordagem origami de DNA estão evoluindo rápido, e um usuário é aconselhado a escolher uma abordagem que melhor se adapte às suas necessidades funcionais específicas.
É surpreendente que centenas de pequenas monómeros mediados apenas por interacções de ligação locais pode auto-montar em uma forma global, prescrita, tal como demonstrado pela abordagem SST. Os princípios fundamentais mostrados na abordagem sho SSTuld ser generalizados para materiais ao lado das cadeias de ADN e o método básico descrito neste artigo, após a modificação for caso disso, deve permitir a construção de estruturas complexas de auto-montadas a partir de materiais diversos.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Escritório do Programa de Pesquisa Naval Young Investigator Award N000141110914, o Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF Prémio Carreira CCF1054898, do NIH Director New Innovator Award 1DP2OD007292 e um Instituto Wyss para Biologicamente Inspirada Fundo Startup Faculdade de Engenharia (para PY) e Centro de Ciências da Vida Fundo de inicialização (para PC) Tsinghua-Pequim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Strands | Integrated DNA Technology | Section 3.1 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | Section 3.4.2 |
| Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | BIO-RAD | 731-6166 | Section 3.6 |
| Bruker's Sharp Nitride Lever Probes | Bruker AFM Probes | SNL10 | Section 4.3 |
| Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator | Invitrogen | G6600 | Section 3.6 |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428 000.414 | Section 3.6 |
| Transmission Electron Microscope | Jeol | Jem 1400 | Section 7.4 |
| Multimode 8 | Veeco | Section 4 | |
| Typhoon FLA 9000 Laser Scanner | GE Heathcare Life Sciences | 28-9558-08 | Section 3.5 |
| Ultrapure Distilled water | Invitrogen | 10977-023 | Section 3.7.1 |
| Mica disk | SPI Supplies | 12001-26-2 | Section 4.1 |
| Steel mounting disk | Ted Pella, Inc. | 16218 | Section 4.1 |
| carbon coated copper grid for TEM | Electron Microscopy Sciences | FCF400-Cu | Section 7.2 |
| tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 7.31 |
| glow discharge system | Quorum Technologies | K100X | Section 7.2 |
| DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler | BIO-RAD | PTC–0240G | Section 3.3 |
| Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | ThermoScientific | B2 | Section 3.4.3 |
| Seekam LE Agarose 500G | Lonza | 50004 | Section 3.4.1 |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp | ThermoScientific | SM1333 | Section 3.4.4 |
| Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer | ThermoScientific | Section 3.7 | |
| 0.2 um filter | Corning Inc. | 431219 | Section 7.1.2 |
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