Introduction
Ácido nucleico anterior trabajo de auto-ensamblaje 1-25 ha llevado a la construcción exitosa de una variedad de estructuras complejas, incluyendo el ADN 2 - 5,8,10 - 13,17,23 o ARN 7,22 3,4,7 periódica, 22 y algorítmica 5 bidimensionales enrejados, cintas 10,12 y tubos 4,12,13, cristales 3D 17, 11 y poliedros finitos, 2D shapes 7,8. Un método particularmente eficaz es andamiaje origami de ADN, por lo que una sola hebra andamio se pliega por muchas hebras cortas discontinuas auxiliares para formar una forma compleja 9,14 - 16,18 - 21,25.
Recientemente hemos informado de un método para construir nanoestructuras discretos con formas 2D prescritos utilizando baldosas de cadena sencilla (SST), y demostramos estructuras con una complejidad comparable al origami de ADN 26. Esta article es una adaptación de nuestro trabajo anterior 26 y describe los protocolos detallados para la organización de TSM direccionables individualmente en sofisticadas formas 2D finitos con dimensiones precisamente prescritos (anchos y largos) y morfologías. Una ventaja clave del método de SST es su modularidad. Cada componente SST de una estructura sirve como unidad de construcción modular en la asamblea, y diferentes subconjuntos de estos TSM producir formas distintas. Por lo tanto, hemos establecido una plataforma general para la construcción de nanoestructuras con tamaños y formas prescritas de cortos, hebras de ADN sintético.
TSM contienen cuatro dominios, cada 10 o 11 nucleótidos de largo (Figura 1A). Las TSM se unen de tal manera que sus hélices paralelas crean un entramado de ADN se mantienen unidos por enlaces cruzados. Cada cruce es el fosfato entre los dominios 2 y 3. El fosfato se estira artificialmente en los diagramas para mayor claridad visual. Las cruces están espaciados dos vueltas helicoidales (21 bases) aparte (<strong> Figura 1B). Los rectángulos compuestos se denominan por sus dimensiones en el número de hélices y vueltas helicoidales. Por ejemplo, un rectángulo que es de seis hélices de ancho y ocho helicoidal convierte tiempo es el referenciado como un 6H × 8T rectángulo. TSM se pueden dejar fuera, añadió, o de lo contrario reorganizado para crear estructuras de formas y tamaños (Figura 1C) arbitrarias. Por ejemplo, un diseño rectangular puede ser enrollado en un tubo con una longitud y radio deseado (Figura 1D).
Alternativamente, el enrejado rectangular SST puede ser visto como un lienzo molecular compuestos de SST pixeles, cada 3 nm por 7 nm. En este estudio, utilizamos un lienzo molecular de 310 TSM internos de larga duración, 24 TSM de larga duración que constituyen los límites izquierdo y derecho, y 28 TSM medio de longitud que forman los límites superior e inferior. La lona tiene 24 hélices dobles enlaces por cruces y cada hélice contiene 28 vueltas helicoidales (294 bases) y por lo tanto se conoce comoun 24H × lienzo rectangular 28T. El 24H × lona 28T tiene un peso molecular similar a la de una estructura de origami de ADN creado a partir de un fago M13 andamio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Secuencia de ADN Diseño
- Utilice el software UNIQUIMER 27 de diseñar una estructura SST-finito, especificando el número de hélices dobles, longitudes de hélice superior e inferior para cada doble hélice, y el patrón cruzado para crear un lienzo 24H × 28T. Después de definir estos parámetros, la arquitectura general (capítulo composición y el arreglo complementariedad) se ilustra gráficamente en el programa.
- Generar secuencias para las hebras de la estructura especificada para satisfacer la disposición de la complementariedad y los requisitos adicionales (si los hay). Diseño de secuencias de ADN, reduciendo al mínimo la simetría secuencia de 28 (para la mayoría de las estructuras).
- Generar nucleótidos (A, C, G y T) al azar, uno por uno.
- Nucleótidos partido complementarias a las generadas siguiendo la regla de apareamiento de bases: de A a T y viceversa; C y G, y viceversa.
- No utilice segmentos que se repiten más de ocho o nueve nucleótidos. Cuando tal representantecomer segmentos surgen durante el diseño, mutar los nucleótidos más recientemente generados hasta el requisito de repetir segmentos está satisfecho.
- No utilice cuatro bases consecutivas A, C, G o T.
- Utilice nucleótidos pre-especificados en los puntos de enlace de cadena sencilla (por ejemplo, T y G como el vigésimo primer y vigésimo segundo nucleótidos, respectivamente, para la mayoría de las cadenas) para evitar deslizamiento bases alrededor de los puntos de enlace (por ejemplo, si ambos XXI y vigésimo segundo nucleótidos fueron T, fue posible para el vigésimo primer nucleótido se una al de nucleótidos que el vigésimo segundo nucleótido se supone que se unen a).
- Modificar secuencias de ADN manualmente para el etiquetado de estreptavidina, la transformación de los rectángulos en tubos, la formación de diferentes rectángulos y tubos a través de diferentes escalas, y para evitar la agregación causada por los dominios expuestos en SST.
- Reemplace los dominios expuestos en el límite del lienzo molecular con poli-T tracts.
- Para el etiquetado de estreptavidina, el diseño de los segmentos de la manija (el segmento adicional añadido a la cadena componente que puede unirse a un homólogo complementario tal como una hebra anti-mango) tales que puedan acomodar una hebra anti-mango con 3 'modificación biotina.
- Para la conversión de un rectángulo en un tubo, quite las filas superior e inferior del rectángulo y insertar una nueva fila cuya TSM tienen complementariedad específica a las baldosas correspondientes en la segunda fila superior de la segunda a la fila inferior.
- Para un dominio de una sola hebra expuesta de diferentes formas, reemplace con segmentos de poli-T de 10 a 11 nucleótidos de longitud, o cubrir por protectores de bordes que son complementarias al dominio expuesto y terminan con unos 10-11 nucleótidos largos segmentos de poli-T.
2. Preparación de las Lienzo Molecular
- Obtener hebras de componentes de ADN de secuencias especificados disueltos en agua libre de RNasa de una oligonucleotide fabricante en V de fondo placas de 96 pocillos con oligonucleótidos sintetizados en una escala de 10 nmol con desalado estándar. Centrifugar las placas de 96 pocillos con las hebras de ADN de aproximadamente 10 s a 600 x g.
- Pipetear 1 l de cada uno de los 362 pozos con hebras de ADN para la 24H × 28T rectángulo (Figura 3A) a 100 mM por filamento (especificación del fabricante) en un tubo de ensayo 2 ml. Añadir 138 l de H destilada desionizada 2 O al tubo de 2 ml de prueba para hacer una disolución madre de la mezcla de hebra a una concentración de 200 nM por filamento.
- Añadir 50 l de la solución 200 nM de stock de mezcla hebra, 10 l de tampón 10X de recocido A (50 mM Tris, pH 7,9, EDTA 10 mM, 250 mM de MgCl 2), y 40 l de H destilada desionizada 2 O a un 0,2 tubo ml PCR. Esto hace que una muestra de 100 l de la lona molecular en tampón de hibridación 1X A (5 mM Tris, pH 7,9, EDTA 1 mM, 25 mM de MgCl 2).
- Recocer el sample durante 17 horas en un termociclador de enfriamiento de 90 ° C a 25 ° C. Programa el termociclador de la siguiente manera: la rampa hacia abajo desde 90 ° C a 61 ° C a una velocidad constante de 5 min por ° C; la rampa hacia abajo desde 60 ° C a 25 ° C a una velocidad constante de 20 min por ° C; y se incuba a 4 ° C hasta que la muestra se puede sacar del ciclador térmico.
- Preparar un 2% gel de agarosa nativo.
- Mida 2,4 g de agarosa en un vaso de precipitados de 600 ml. Añadir 120 ml de tampón TBE 0,5X (44,5 mM Tris-Borato, pH 8,3, EDTA 1 mM) y 30 ml de agua desionizada destilada al vaso de precipitados.
- Microondas durante 3 minutos (o 40 - 60 seg más después de la ebullición). Reponer el agua perdida durante la evaporación mediante la adición de 30 ml de agua, lo que ayuda a mantener la concentración de agarosa en el gel a 2%.
- Agitar el contenido del vaso de precipitados durante 1 min en un baño de agua fría. Añadir 1 ml de 1,2 M de MgCl2 (para hacer una concentración 2 mM MgCl 10 en el gel) y pre-manchan el ingenio de gelh 6 l de tinte SYBR Seguro (1: 20.000).
- Vierta la solución de gel en una caja de gel seco e inserte un 1,5 mm de espesor 12 y peine de electroforesis en gel. Dejar solidificar el gel de 15 a 30 minutos sobre una plataforma aún.
- Verter tampón de gel de rodadura (44,5 mM Tris-Borato, pH 8,3, EDTA 1 mM, y 10 mM de MgCl 2) en el cuadro de gel. Cargar 2-3 l de escalera de ADN de 1 kb en un pozo del gel de agarosa. Mezclar 4 l de 6X colorante azul de bromofenol (0,25% azul de bromofenol, 5 mM Tris, EDTA 1 mM, 10 mM de MgCl 2 y 30% de glicerol) con 20 l de la muestra de la tela molecular y cargar la solución en otro pozo de la gel de agarosa.
- Ejecute el nativo de agarosa al 2% durante 2 horas a 100 V en un baño de agua con hielo (azul de bromofenol, se muestra en azul, corre más rápido que hebras de componentes para que pueda servir como un indicador de que si el tiempo de 2 horas de funcionamiento es apropiado).
- Image gel usando un escáner de gel con un filtro apropiado para la tinción de seguro SYBR (Figura 2B
- En un transiluminador de luz azul, extirpar la banda dominante con movilidad similar a la banda de 1500 pares de bases de la escalera de ADN de 1 kb utilizando una hoja de afeitar limpia agudo. Coloque la pieza de gel deseada (s) en una columna de centrifugación y luego aplastar el gel en trozos finos utilizando un mortero microtubo. Centrifugar a 438 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Medir la concentración del ADN utilizando un espectrofotómetro de ultravioleta a 260 nm.
- Utilice 2 l de DNasa ultrapura / agua destilada RNasa libre como blanco para calibrar la máquina.
- Use un volumen equivalente de la muestra obtenida de la columna de centrifugación para obtener una estimación de la concentración de ADN. El valor medido de concentración ("a" = ng / l) obtenido en una absorción UV de 260 nm ayudará a determinar el factor de dilución para AFM e imágenes TEM.
- Convertir la concentración medida de "a" (ng / l) a "b" (nM) siguiendo b = a × 10 6 / (330 y# 215; número de nucleótidos).
NOTA: El peso molecular de un nucleótido es 330 g / mol. El valor de la concentración molar calculada determinará el factor de dilución para el AFM y TEM de imágenes. Como para el caso de un 24H × 28T rectángulo, la medición común para la muestra purificada es de alrededor de 10 a 60 ng / l. Como el número de nucleótidos para una estructura de este tipo es 14.616 Da, la concentración molar es de aproximadamente de 2 - 12 nM. La concentración final se determina por el rendimiento de recogida (~ 20 - 50%) a partir de la centrifugación y el volumen de la banda de gel escindió a cabo (cuanto mayor sea el volumen, más diluir la muestra purificada).
3. Microscopía de Fuerza Atómica Imaging
- Despegar mica unida a un disco metálico muestra usando cinta adhesiva para obtener una superficie plana y coloque la platina en el escenario de imágenes.
- Añadir 40 l de tampón de hibridación 1X A seguido de 5 l (2 - 5 nM) de la muestra purificada de la 24H × 28Trectángulo a la superficie de mica recién escindida. Dejar que la mezcla se asiente durante aproximadamente 2 min.
- Instalar AFM chip de voladizo de nitruro de silicio sobre un soporte en voladizo. Utilice una punta triangular C (frecuencia de resonancia, f 0 = 40 a 75 kHz; primavera constante, k = 0,24 Nm -1) para obtener imágenes.
- Imagen de una muestra en el modo de líquidos penetrantes. Utilice los siguientes parámetros de imagen para el escaneado: escanear tamaño de 2 m, 1.024 líneas de resolución, y una velocidad de barrido de 0,5 - 1 Hz (Figura 2C).
- Si es necesario, añadir 10 l mM o solución más de 10 NiCl 2 para aumentar la fuerza de unión a ADN 29-mica.
4. Preparación de muestras para Estreptovidina etiquetado
- Diseñar manualmente el 24H × rectángulo 28T tal que hebras de mango en lugares específicos se incorporan a ser complementarias a las hebras anti-mango con la modificación biotina, que a su vez son capaces de unirse a streptaviden concreto.
- Modificar el lienzo molecular uniendo un "segmento de 17 nucleótidos 3 que consiste en una secuencia de dos nucleótidos (TT) como un espaciador y un mango 15-nucleótidos (GGAAGGGATGGAGGA) a los 14 azulejos en la fila superior y 14 azulejos en la parte inferior fila del rectángulo (Figura 3A) para etiquetar el límite. Esta secuencia es complementaria a una 3 'biotina modificada hebra anti-mango (TCCTCCATCCCTTCC-biotina).
- Para el etiquetado interno, conecte el segmento 3 'de nucleótidos 17 a 8 azulejos internos y 6 azulejos de contorno del rectángulo (Figura 4A).
- Mezclar las 28 hebras con asas (etiquetado límite) con el resto de las hebras de componentes de la 24H × rectángulo 28T (334 hebras) para hacer una solución madre de 200 nM. Mezclar las 14 hebras con asas de etiquetado (interna) con el resto de las hebras de componentes de la 24H × rectángulo 28T (348 hebras) para obtener una solución madre de 200 nM.
- Para boetiquetado undary, añadir 50 l de la solución madre de 200 nM de las hebras, 6 l de los 100 M biotina modificada anti-asa hebras, 10 l de la 10X recocido tampón A, y 34 l de agua desionizada destilada a un 0,1 a 0,2 tubo de ensayo ml PCR. La concentración final de la hebra componente es 100 nM y la concentración final de la hebra modificada anti-biotina mango es 6000 nM. Tenga en cuenta que 28 moléculas de la anti-biotina manejan modificado hebra se unen a un 24H × 28T rectángulo para la hebra anti-biotina manejar modificado es en exceso de 100% para hacer la unión favorable.
- Para el etiquetado interno, añadir 50 l de la solución madre de 200 nM de los hilos, 3 l de la manija contra biotina cadena interna modificada en 100 M, 10 l de la memoria intermedia de recocido 10X A, 37 l de agua desionizada destilada a un 0,1 - tubo de ensayo de PCR de 0,2 ml. La concentración final de la hebra componente es 100 nM y la concentración final de la biotina anti-modifi mango ed hebra es 3000 nM. Tenga en cuenta que 14 moléculas de la anti-biotina mango modificado hebra se unen a un 24H × 28T rectángulo de forma anti-biotina manejar hebra modificado es en exceso de 100% para hacer la unión favorable.
- Recocer ambas muestras en un termociclador durante 17 horas siguiendo los pasos descritos en 2.3.
- Preparar un 2% gel de agarosa nativo como se describe en los pasos 2.4.
- Purificar ambas muestras como se describe en los pasos 2.5.
- Medir las concentraciones de las estructuras de ADN deseadas como se describe en los pasos 2.6.
5. Microscopía de Fuerza Atómica para el etiquetado de estreptavidina
- Image cada muestra utilizando un AFM como se describe en el paso 3 (Figuras 3B y 4B).
- Después de la primera ronda de formación de imágenes, añadir 40 l de tampón de hibridación 1X A seguido de 1 l de estreptavidina a 10 mg / ml a la muestra. Dejar que la mezcla se asiente durante aproximadamente 2 minutos antes de volver a generar imágenes (Figuras 3C y 4C).
- Con el fin de diseñar un tubo basado en el rectángulo, mantenga todas las TSM componentes en lugar excepto las filas superior e inferior. Introducir una nueva fila cuya TSM están diseñados mediante la concatenación de los superiores e inferiores medias tejas de sus respectivas columnas para ciclar el rectángulo original en una conformación de tubo (Figura 5A).
- Mezclar la nueva fila de hilos (14 hebras) con las hebras de componentes de la 24H x 28T rectángulo con exclusión de las filas superior e inferior (336 hebras) para obtener una solución madre de 200 nM.
- Siga la purificación de gel pasos 2.2 a 2.7 (Figura 5B).
7. Microscopio Electrónico de Transmisión de Imágenes
- Pesar 0,06 g de formiato de uranilo en 3 ml de agua destilada para preparar una solución de formiato de mancha de uranilo acuoso al 2%. Filtrar la solución mancha formato de uranilo acuoso al 2% utilizando un filtro de 0,2 micras unida a una jeringa.
- Añadir 5 l de5 N NaOH a las 1 ml de solución de tinción se filtró. En resumen vórtice la solución y se centrifuga a 20.000 x g.
- Glow descargue las rejillas revestidas de carbono (frente a lado recubierto hacia arriba) con los siguientes valores: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar, y negativo polaridad de alta tensión.
- Utilice unas pinzas de cierre automático para tomar una rejilla tratado descargador resplandor del borde.
- Pipetear 3,5 l de muestra sobre la rejilla durante 4 min. Use un pedazo de papel de filtro para absorber de la muestra por lo que el papel de filtro en contacto con la rejilla desde el lado.
- Inmediatamente añadir 3,5 l de la solución de tinción sobre la rejilla durante 1 min.
- Wick fuera de la mancha como en 7.4 y mantenga el papel de filtro contra la rejilla de 1 - 2 min.
- La transferencia de la cuadrícula a un portamuestras TEM y la imagen utilizando un JEOL JEM-1400 operado a 80 kV con aumento que oscila entre 10 K y 80 K (Figura 5C).
8. La construcción de formas arbitrarias Uso del Molecular Lienzo
- Identificar una forma y seleccionar las hebras que corresponden a la forma en el lienzo molecular. Para una forma de triángulo por ejemplo, seleccione 206 out 362 hebras de la tela molecular.
- Reemplazar el dominio expuesta (es decir, a lo largo de la hipotenusa del triángulo) con un segmento de poli-T 10 - 11 nucleótidos de largo (diseño 1 en la Figura 6A), o añadir un protector de borde que es complementaria a la de dominio expuesto y terminar con 10 - segmento de larga poli-T 11 nucleótidos (diseño 2 en la Figura 6A) para evitar la agregación.
NOTA: Simplemente recocer las SST que corresponden a los píxeles del triángulo (sin utilizar hebras protector) dará lugar a la agregación y sin formación de banda de producto distinto en un gel. Utilice el diseño de protector de borde de diversas formas, ya que es más eficiente de los recursos; se requiere sólo cuatro conjuntos adicionales de hebras (Figura 6C) en comparación con 14 conjuntos adicionales en el diseño de reemplazo (Figure 6B). - Crear una biblioteca de cadena para el lienzo molecular 310 píxeles, que incluye el conjunto básico (el lienzo 362 SST), Set 1 * (protectores de bordes que se unen al dominio 1 de un SST), Set 2 * (protectores de bordes que se unen al dominio 2 de un SST), Set 3 * (protectores de bordes que se unen al dominio 3 de un SST) y Set 4 * (protectores de bordes que se unen al dominio 4 de un SST) para dar un total de 1.344 protectores de bordes.
- Centrifugar las placas de 96 pocillos para los diferentes conjuntos de aproximadamente 10 s. Pipetear a cabo las hebras deseadas a partir de las placas con el fin de hacer una solución de stock para una cierta forma.
- Por la forma de un triángulo con protectores de bordes, pipeta 1 l de 206 hilos de la colección básica, 0 de conjunto 1 *, 0 de conjunto 2 *, 0 del conjunto 3 * y 24 hebras de conjunto 4 * en una centrífuga de 2 ml tubo. Añadir 20 l de agua desionizada destilada al tubo para hacer una solución de 400 nM de las hebras de ADN.
- Añadir 50 l de la solución 400 nM balance de stra ADN nds, 10 l de la 10X tampón de reasociación B (50 mM Tris, pH 7,9, EDTA 10 mM, 125 mM de MgCl 2) stock solución y 40 l destilada desionizada H 2 O a un tubo de PCR de 0,2 ml. Esto hace que una muestra de 100 l del triángulo en 1X tampón de reasociación B (5 mM Tris, pH 7,9, EDTA 1 mM, 12,5 mM de MgCl 2) con los filamentos a una concentración de aproximadamente 200 nM por filamento.
- Recocer la mezcla en un termociclador durante 17 horas como se describe en el paso 2.3.
- Preparar un 2% en gel de agarosa nativa como se describe en el paso 2.4.
- Se purifica la muestra como se describe en el paso 2.5.
- Medir la concentración del ADN como se describe en el paso 2.6.
- Image la muestra bajo AFM como se describe en el paso 3 (Figura 7C y 7D).
- Recogida y mezclar hilos de diferentes formas utilizando la misma biblioteca hebra. Recocer las diferentes soluciones y combinar muestras purificadas de diferentes formas para ahorrar tiempo durante la exploración AFM.
- Utilice un programa de MATLAB personalizado para ayudar al diseño de formas complejas.
- Utilice el software para entregar instrucciones en la forma de una secuencia de pipeteado a un robot manipulador de líquidos. Utilice el controlador de líquido robot para seleccionar y mezclar las hebras que constituyen la forma de destino.
NOTA: diseño de la forma y el capítulo de mezcla fue automatizado para reducir los errores humanos y hacer uso intensivo de la construcción menos mano de obra.
10. Los rectángulos y Tubos través de diferentes escalas
- Construir diferentes rectángulos de tamaño (Figura 10), simplemente alterando el número de hélices paralelas (H) y el número de vueltas helicoidales (t).
- Siga el paso 3 para un rectángulo de tamaño específico.
- Siga el paso 6 para un tubo de tamaño específico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El autoensamblaje de TSM (Figura 1) dará lugar a una 24H × 28T rectángulo, como se ilustra en la Figura 2. Secuencias de ADN para los diferentes TSM pueden ser modificados / optimizado para permitir el etiquetado de estreptavidina (Figura 3 y 4), la transformación de una rectángulo en un tubo (Figura 5), el autoensamblaje programable de TSM para formar tubos y rectángulos de diferentes tamaños (Figura 10), y la construcción de formas arbitrarias 2D utilizando el lienzo molecular (Figura 8). Dos diseños (diseño de sustitución de dominio y diseño protector de borde) se probaron como soluciones a la agregación a lo largo de los dominios expuestas de formas arbitrarias (Figura 7). Ambos diseños tienen un rendimiento comparable gel y la integridad estructural, pero el diseño protector de borde es más rentable, ya que requiere un menor número de especies auxiliares (Figura 6).Picking Strand y mezcla pueden ser automatizados, como se muestra en las Figuras 9 a reducir el error humano y ahorrar tiempo.
Figura 1. Auto-ensamblaje de formas moleculares Usando Azulejos de cadena simple. (A) El motivo SST canónica, una adaptación de 12 (B) Izquierda y centro:. Dos representaciones de TSM reunidos. TSM interiores tienen una longitud total de 42 bases y están etiquetados "U", mientras que las TSM de frontera tienen 21 bases y se etiquetan de "L". En el diagrama de la izquierda, los colores distinguen diferentes dominios. En el diagrama de media, colores distinguen diferentes hebras. Derecha: Un esquema de la vista de la pared de ladrillo de las estructuras de la TSM. Ladrillos gruesos son TSM completos y ladrillos delgados son TSM de contorno. Los bordes redondeados indican que no hay emparejamiento complementario. Al igual que en la cifra media, colores distinguen azulejos individuales. En todo diagcarneros, cada baldosa tiene una secuencia única. (C) la retención de una selección apropiada de las hebras de la colección SST que componen el diseño de rectángulo en la Figura B los resultados en la formación de una forma deseada diferente, tal como un triángulo (izquierda) o un anillo rectangular (a la derecha). (D) El diseño de un tubo con una anchura y una longitud predeterminada. (E) Dada una piscina pre-sintetizado de secuencias de SST (arriba), formas arbitrarias (abajo) puede ser diseñado por la elección de un subconjunto de las cadenas de utilizar en la mezcla de hebra (oscuros píxeles azules) y eliminar el resto (luz píxeles azules). Esta cifra ha sido modificado desde una cifra publicada previamente 26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Límites de etiquetado de 24H x 28T Rectángulo. (A) Esquema de la bi específica24H × 28T rectángulo Otín marcado. Las hebras resaltados en azul son las hebras de la manija. Las hebras resaltados en rojo son las cadenas anti-asa marcadas con 3 'de biotina (puntos negros). Estreptavidina se representa como una bola naranja de imagen (B) AFM antes de añadir (tamaño de escaneo: 1 m × 1 m) estreptavidina.. (C) AFM imagen después de la adición de estreptavidina (tamaño de escaneo: 1 m × 1 m). Inserción, una vista zoom en la que muestra etiquetado éxito. Tenga en cuenta que estreptavidina apareció ya sea como puntos blancos o rayas debido a sus alturas elevadas. Esta cifra ha sido modificado desde una cifra publicada previamente 26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 4. Eninterna Etiquetado de 24H × 28T Rectángulo. (A) Esquema de la biotina 24H marcado específico × 28T rectángulo. Las hebras resaltados en azul son las hebras de la manija. Las hebras resaltados en rojo son las cadenas anti-asa marcadas con 3 'de biotina (puntos negros). Estreptavidina se representa como una bola naranja de imagen (B) AFM antes de añadir (tamaño de escaneo: 1 m × 1 m) estreptavidina.. (C) AFM imagen después de la adición de estreptavidina (tamaño de escaneo: 1 m × 1 m). Inserción, una vista zoom en la que muestra etiquetado éxito. Tenga en cuenta que estreptavidina apareció ya sea como puntos blancos o rayas debido a las alturas elevadas. Esta cifra ha sido modificado desde una cifra publicada previamente 26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
dentro-page = "always"> 
Figura 5. Diseño y TEM Imagen de la 24H × tubo 28T. (A) Esquema de la 24H × barril 28T. Dos vistas ampliadas en en la parte superior y el espectáculo final identidades detalladas segmento. Tenga en cuenta que los segmentos a24.x * (por ejemplo, a24.13 *) y * b24.x (por ejemplo, b24.12 *) de la fila superior son complementarios a los segmentos a24.x (por ejemplo, a24.13) y b24.x (por ejemplo, b24.12) de la fila inferior; Se espera que tal complementariedad a resultar en la formación de la estructura tubular. (B) 2% electroforesis en gel de agarosa nativo. U, no purificada; Imagen TEM de la estructura de barril P, purificado (por extracción de gel de carril U) (C) (barra de escala: 100 nm).. Esta cifra ha sido modificado desde una cifra publicada previamente 26.ighres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Dos diseños para evitar la agregación causadas por Expuesto Sticky Dominios. (A) Una demostración de lado a lado de dos métodos para cubrir dominios expuestos. El dominio pegajosa no apareado (dominio 4) se indica con un cuadro de líneas discontinuas de color rojo. Diseño 1 es el diseño sustitución de dominio, en el que el dominio desapareado está sustituido por un dominio de poli-T (que se muestra en rojo y la etiqueta "T"). Diseño 2 es el diseño protector de borde, que consiste en cubrir el dominio no apareado con un cordón protector de borde (que se muestra en rojo y la etiqueta "T-4 *"). La hebra protector de borde se compone de una sección de poli-T y un complemento para el dominio expuesto. (B) Las diferentes configuraciones de contorno posibles asociados con la sustitución de dominio (diseño 1).Hay 14 maneras diferentes de un SST interna (en azul) pueden salir de un dominio o dominios expuestos. Las sustituciones de cadena adecuados se muestran en rojo para cada situación. (C) El diseño protector de borde (diseño 2). Uno SST interna (azul) requiere sólo cuatro protector borde hebras (rojo) para cubrir los dominios expuestos usando este diseño. Esta cifra ha sido modificado desde una cifra publicada previamente 26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Dos diseños para el Triángulo de SST. (A) y (B) representan esquemas basados en el diseño 1 (sustitución de dominio) y diseño 2 (protector de borde) en la Figura 8, respectivamente. Una región poli-T (T10 o T11 en la figura) se representa comouna esquina redondeada en el diagrama de bloques. El recuadro muestra una vista ampliada de la estructura indicada con la caja de trazos. Las barras de escala, 100 nm. (C) y (D) son las imágenes de AFM. Esta cifra ha sido modificado desde una cifra publicada previamente 26.
Figura 8. Diagramas y AFM Imágenes de 100 diferentes formas. Estructura diseños se muestran en los paneles superiores. Coloración azul claro indica las hebras de lona dejado fuera de la mezcla, mientras que la coloración azul oscuro indica las hebras incluidos. Para mayor claridad, hebras protector de borde se omiten. Una imagen AFM correspondiente de cada estructura por debajo de su diseño se muestra. Cada imagen es de 150 nm × 150 nm en el área. Hay 100 formas únicas. Se incluyen 10 números arábigos, las 26 letras mayúsculas del alfabeto latino, 23 signos de puntuación y keyboasímbolos rd, 10 emoticons, 9 símbolos astrológicos, de 6 caracteres chinos, y varios símbolos diversos. Esta cifra ha sido modificado desde una cifra publicada previamente 26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9. Diagrama de flujo Robot Automation. Este diagrama representa el flujo de trabajo utilizado para automatizar el proceso de mezcla. En primer lugar, un programa MATLAB personalizada se utiliza para diseñar la forma deseada. Una vez más, rectángulos azules oscuras indican las hebras que deben incluirse en la mezcla. Después de que se completó el diseño, el programa da salida a un conjunto de instrucciones de pipeteado para el manipulador de líquidos robótico. El robot pipetas las concentraciones correctas de los hilos adecuados para una forma particular en un plate también. La mezcla luego se somete a una olla de recocido, seguido por AFM de imágenes de las formas resultantes. (Esta cifra se ha modificado de una figura previamente publicado 26). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10. Auto-Asamblea de rectángulos y tubos a través de diferentes escalas. (A) las imágenes de AFM de rectángulos SST con los siguientes diseñada dimensiones (de izquierda a derecha):. 4H × 4T, 6H × 7T, 10H × 10T, 12H × 14T, 18H × 20T, 24H × 28T y 36H × 34T ( B) Los pesos moleculares de las estructuras están en una escala logarítmica. El asterisco indica el peso de una estructura de origami de ADN M13 típica como referencia. (C) imágenes de TEMde tubos SST con las siguientes dimensiones diseñados (de izquierda a derecha): 8H × 28T, 8H × 55T, 8H × 84T, 24H × 28T y 12H × 177T. Todas las barras de escala muestran 100 nm. Esta cifra ha sido modificado desde una cifra publicada previamente 26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En la etapa de formación de la estructura, es importante mantener una concentración apropiada de cationes de magnesio (por ejemplo., 15 mM) en la mezcla de cadena de ADN a nanoestructuras de ADN se auto-ensamblan. Del mismo modo, en la etapa de caracterización del gel de agarosa / purificación, es importante para mantener una concentración de catión magnesio apropiado (por ejemplo., 10 mM) en el gel y el tampón de gel de funcionamiento para retener las nanoestructuras de ADN durante la electroforesis. Para la 24H × estructura 28T rectángulo, hemos probado de recocido en diferentes concentraciones de Mg ++ y encontramos que la estructura formada típicamente en el rango de 10 - 30 mM Mg ++ (con el mejor rendimiento con la formación de alrededor de 20 mM Mg ++).
A diferencia de la estructura de origami andamiaje, la estructura SST tiene una arquitectura modular. Diferentes formas pueden ser diseñados de la misma tela, seleccionando el subconjunto apropiado de azulejos SST. Además, la estructura de SST se ensambla from hebras de ADN sintéticos cortos solamente y no implica un largo andamio que se utiliza en el enfoque origami. Por lo tanto, el tamaño de la estructura de SST no está limitado por la longitud del andamio disponible. Sin embargo, mientras que el enfoque origami de ADN a menudo se puede optimizar para producir cualquiera de estructuras plegadas o no plegadas monómeros, SST puede dar lugar a estructuras formadas parcialmente y por lo tanto puede requerir purificación en gel para su uso posterior. Además, debido a la falta de una hebra de andamio, una estructura SST puede ser más "frágil" que su contraparte origami de ADN. Tanto el enfoque de SST y el enfoque de origami de ADN están evolucionando rápidamente, y se aconseja al usuario elegir un enfoque que mejor se adapte a sus necesidades funcionales particulares.
Llama la atención que cientos de pequeños monómeros mediada únicamente por interacciones de unión locales pueden auto-ensamblarse en una forma prescrita mundial, como lo demuestra el enfoque de SST. Los principios fundamentales que se muestran en el enfoque sho SSTULD ser generalizables a los materiales junto a las cadenas de ADN y el método básico descrito en este artículo, después de la modificación apropiada, debería permitir a las construcciones de estructuras complejas auto-ensamblados de diversos materiales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Oficina del Premio Programa Investigador Naval de Investigación Joven N000141110914 de la Oficina de Investigación Naval de Grant N000141010827, NSF CARRERA Premio CCF1054898, Nueva Innovator Award 1DP2OD007292 del Director NIH y un Instituto Wyss de inspiración biológica Ingeniería Fondo inicio Facultad (PY) y Centro de Ciencias de la Vida Fondo de inicio (para PC) Tsinghua-Pekín.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Strands | Integrated DNA Technology | Section 3.1 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | Section 3.4.2 |
| Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | BIO-RAD | 731-6166 | Section 3.6 |
| Bruker's Sharp Nitride Lever Probes | Bruker AFM Probes | SNL10 | Section 4.3 |
| Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator | Invitrogen | G6600 | Section 3.6 |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428 000.414 | Section 3.6 |
| Transmission Electron Microscope | Jeol | Jem 1400 | Section 7.4 |
| Multimode 8 | Veeco | Section 4 | |
| Typhoon FLA 9000 Laser Scanner | GE Heathcare Life Sciences | 28-9558-08 | Section 3.5 |
| Ultrapure Distilled water | Invitrogen | 10977-023 | Section 3.7.1 |
| Mica disk | SPI Supplies | 12001-26-2 | Section 4.1 |
| Steel mounting disk | Ted Pella, Inc. | 16218 | Section 4.1 |
| carbon coated copper grid for TEM | Electron Microscopy Sciences | FCF400-Cu | Section 7.2 |
| tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 7.31 |
| glow discharge system | Quorum Technologies | K100X | Section 7.2 |
| DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler | BIO-RAD | PTC–0240G | Section 3.3 |
| Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | ThermoScientific | B2 | Section 3.4.3 |
| Seekam LE Agarose 500G | Lonza | 50004 | Section 3.4.1 |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp | ThermoScientific | SM1333 | Section 3.4.4 |
| Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer | ThermoScientific | Section 3.7 | |
| 0.2 um filter | Corning Inc. | 431219 | Section 7.1.2 |
References
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
- Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2 (12), e424 (2004).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
- Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
- Park, S. H., et al. Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures. Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Schulman, R., Winfree, E. Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Sharma, J., et al. Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles. Science. 323 (5910), 112-116 (2009).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Zheng, J. P., et al. From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D. DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).
- Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
- Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline two-dimensional DNA origami arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).
- Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames. Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).
- Woo, S., Rothemund, P. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).
- Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
- Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures. ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).
- Seeman, N. C. Nanomaterials based on DNA. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).
- Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures. Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly. J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).
- Seeman, N. C. De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering. J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).
- Hansma, H. G., Laney, D. E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy. Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).
- Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. Enzyme-free nucleic acid logic circuits. Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).
- Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. Programming biomolecular self-assembly pathways. Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).
