Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Själv montering av komplexa Tvådimensionella former från Single DNA Tiles

Published: May 8, 2015 doi: 10.3791/52486
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 3Department of Systems Biology, Harvard Medical School

Introduction

Föregående nukleinsyra självmonteringsarbete 1-25 har lett till den framgångsrika konstruktionen av en mängd olika komplexa strukturer, inkluderande DNA 2 - 5,8,10 - 13,17,23 eller RNA 7,22 periodisk 3,4,7, 22 och algoritmisk 5 tvådimensionella gitter, band 10,12 och rör 4,12,13, 3D-kristaller 17, Polyhedra 11 och ändliga, formar 2D 7,8. En särskilt effektiv metod är bygga ställning DNA origami, varigenom en enda byggnadsställning sträng viks med många korta hjälpstapel strängar för att bilda ett komplex form 9,14 - 16,18 - 21,25.

Vi rapporterade nyligen en metod för att konstruera diskreta nanostrukturer med föreskrivna 2D former med enkelsträngade plattor (SST), och visade strukturer med komplexitet jämförbar med DNA-origami 26. Denna article är en anpassning av vårt tidigare arbete 26 och beskriver i detalj protokoll för att ordna individuellt adresserbara specialverktygen till avancerade finita 2D former med exakt föreskrivna dimensioner (bredder och längder) och morfologier. En viktig fördel med SST-metoden är dess modularitet. Varje komponent SST av en struktur fungerar som en modulär konstruktion enhet i församlingen, och olika undergrupper av dessa specialverktygen producerar olika former. Därför har vi etablerat en allmän plattform för att bygga nanostrukturer med föreskrivna storlekar och former från korta, syntetiska DNA-strängar.

Specialverktygen innehåller fyra domäner, vardera 10 eller 11 nukleotider lång (Figur 1A). De specialverktygen binder så att deras parallella spiraler skapa en DNA-gitter hålls samman av crossover bindningar. Varje crossover är fosfat mellan domänerna 2 och 3. Fosfat sträckes artificiellt i diagrammen för visuell klarhet. De delning är placerade två spiralvarv (21 baser) från varandra (<stark> Figur 1B). Komposit rektanglarna betecknas med sina mått av antalet spiraler och spiralvarv. Till exempel, som är en rektangel sex spiraler bred och åtta spiral vänder lång refereras som en 6H × 8T rektangel. Specialverktygen kan lämnas ut, tillade eller på annat sätt om för att skapa strukturer för godtyckliga former och storlekar (Figur 1C). Exempelvis kan en rektangulär utformning rullas till ett rör med en önskad längd och radie (Figur 1D).

Alternativt kan den rektangulära SST gitter ses som en molekylär duk som består av SST pixlar, vardera 3 nm genom 7 nm. I denna studie använder vi en molekyl duk av 310 fullängds interna specialverktygen, 24 fullängdsspecialverktygen som utgör de vänstra och högra gränser och 28 halv längd specialverktygen som bildar de övre och nedre gränser. Duken har 24 dubbelspiraler kopplade genom delning och varje helix innehåller 28 spiralvarv (294 baser) och därför kallas24h × 28T rektangulär duk. 24H × 28T duk har en molekylvikt liknande den hos en DNA origami struktur skapas från en M13-fag byggnadsställning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA-sekvens design

  1. Använd UNIQUIMER programvara 27 att utforma en SST-ändlig struktur genom att ange antalet dubbelspiraler, längder av övre och nedre spiralen för varje dubbelspiral, och crossover mönster för att skapa en 24H × 28T duk. Efter att definiera dessa parametrar är den övergripande strukturen (sträng sammansättning och komplementaritet överenskommelse) illustreras grafiskt i programmet.
  2. Generera sekvenser för delar av den angivna strukturen för att möta kompletterar arrangemanget och ytterligare krav (i förekommande fall). Utforma DNA-sekvenser genom att minimera sekvenssymmetri 28 (för de flesta av de strukturer).
    1. Generera nukleotider (A, C, G och T) slumpmässigt en efter en.
    2. Match nukleotider komplementära till de som genereras till följd av basparning regel: A till T och vice versa; C till G och vice versa.
    3. Använd inte upprepade segment än åtta eller nio nukleotider. När ett sådant repäta segment fram under konstruktion, mutera de senast genererade nukleotider tills kravet upprepa etapper är nöjd.
    4. Använd inte fyra på varandra följande A, C, G eller T-baser.
    5. Använd pre-specificerade nukleotider vid de enkelsträngade kopplingspunkter (till exempel T och G som det tjugoförsta och tjugoandra nukleotider, respektive, för de flesta av strängarna) för att undvika glidning baser runt länkpunkter (t.ex. om både tjugoförsta och tjugoandra nukleotider var T, var det möjligt för det tjugoförsta nukleotid för att binda till den nukleotid som den tjugoandra nukleotid är tänkt att binda till).
  3. Ändra DNA-sekvenser manuellt för streptavidin märkning, omvandlingen av rektanglar i rör, bildandet av olika rektanglar och rör i olika skalor, och för att förhindra aggregation orsakad av exponerade domäner på SST.
    1. Ersätt de exponerade domäner på gränsen av den molekylära duk med poly-T-traCTS.
    2. För streptavidin märkning, utforma handtagssegment (extra segmentet bifogas komponent sträng som kan binda till en komplementär motsvarighet såsom en anti-handtag sträng) så att de kan rymma en anti-handtag sträng med 3 "biotin modifiering.
    3. För omvandling av en rektangel i ett rör, ta bort de övre och undre rader från rektangeln och sätta in en ny rad vars specialverktygen har särskilt komplement till motsvarande plattor på näst översta raden och den andra till nedersta raden.
    4. För en exponerad enkelsträngad domän olika former, ersätta med poly-T-segment av 10-11 nukleotider längd, eller täcka med kantskydd som kompletterar den exponerade domänen och slutar med en 10-11 nukleotider lång poly-T-segmenten.

2. Framställning av Molecular kanfas

  1. Skaffa DNA komponent delar av specificerade sekvenser lösta i RNas-fritt vatten från en oligonucleotide tillverkare i V botten plattor med 96 brunnar med oligonukleotider syntetiserade på en 10 nmol skala med standard avsaltning. Centrifugera 96 ​​brunnar med DNA-strängarna för ungefär 10 sekunder vid 600 x g.
    1. Pipettera 1 il från var och en av de 362 brunnar med DNA-strängar för 24H × 28T rektangel (figur 3A) vid 100 | iM per sträng (tillverkare specifikation) till en 2 ml provrör. Lägg 138 il destillerat avjoniserat H2O till 2 ml provrör till en stamlösning av strängen blandningen vid en koncentration av 200 nM per sträng.
  2. Lägg 50 pl av 200 nM förrådslösning av strängblandningen, 10 ^ il 10 x pamingsbuffert A (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 250 mM MgCl2), och 40 | j, l destillerat avjoniserat H2O till en 0,2 ml PCR-rör. Detta gör ett prov av den molekylära duk i 1X pamingsbuffert En 100 | il (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCl2).
  3. Glödga sample i 17 h i en termisk cykelanordning kylning från 90 ° C till 25 ° C. Programmera värmecykeln enligt följande: ramp ned från 90 ° C till 61 ° C vid en konstant hastighet av 5 min per ° C; ramp ner från 60 ° C till 25 ° C vid en konstant hastighet av 20 min per ° C; och inkubera vid 4 ° C tills provet kan tas ut ur termocyklern.
  4. Förbered en infödd 2% agarosgel.
    1. Mät 2,4 g agaros i en 600 ml bägare. Lägg 120 ml 0,5X TBE-buffert (44,5 mM Tris-borat, pH 8,3, 1 mM EDTA) och 30 ml destillerat avjoniserat vatten till bägaren.
    2. Mikrovågsugn under 3 min (eller 40-60 sekunder efter kokning). Fyll på vatten förloras under avdunstning genom tillsats av 30 ml vatten, vilket bidrar till att hålla koncentrationen av agaros i gelén vid 2%.
    3. Snurra innehållet i bägaren under 1 min i ett kallt vattenbad. Tillsätt 1 ml 1,2 M MgCl2 (för att göra en 10 mM MgCl2-koncentrationen i gelén) och pre-fläcka gelén with 6 il SYBR Säker färgämne (1: 20.000).
    4. Häll gellösningen till ett torrt gelboxen och infoga ett 1,5 mm tjockt 12 väl gelelektrofores kam. Låt lösningen stelna för 15-30 min på en jämn plattform.
    5. Häll gelén rinnande buffert (44,5 mM Tris-borat, pH 8,3, 1 mM EDTA och 10 mM MgCl2) i gelboxen. Belastning 2-3 pl av en kb DNA-stege i en brunn i agarosgel. Blanda 4 il 6X bromfenol blått färgämne (0,25% bromfenolblått, 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 och 30% glycerol) med 20 pl av provet av den molekylära arbetsytan och ladda lösningen in i en annan brunn av agarosgel.
  5. Kör den nativa 2% agaros under 2 timmar vid 100 V i ett isvattenbad (bromfenolblått, som visas i blått, går snabbare än komponentsträngarna så att den kan fungera som en indikator på att om 2 tim gångtid är lämpligt).
  6. Bild gelen med hjälp av en gel scanner med ett lämpligt filter för SYBR säker fläck (Figur 2B
  7. På ett blått ljus transilluminator, skära den dominerande band med liknande rörlighet bandet 1500 baspar av 1 kb DNA-stege med en skarp ren rakblad. Placera den önskade gelén stycket (er) i en spinnkolonn och sedan krossa gelén till fina bitar med hjälp av ett mikrorör mortelstöt. Centrifugera vid 438 xg under 3 min vid 4 ° C.
  8. Mäta koncentrationen av DNA: t med användning av en ultraviolett spektrofotometer vid 260 nm.
    1. Använd 2 pl ultraren DNas / RNas-Free destillerat vatten som ämnet att kalibrera maskinen.
    2. Använd en ekvivalent volym av det uppsamlade provet från spinnkolonn för att få en uppskattning av DNA-koncentrationen. Den koncentrationsvärde ("a" = ng / ul) uppmätt erhålls vid en UV-absorption av 260 nm kommer att avgöra utspädningsfaktorn för AFM och TEM avbildning.
    3. Konvertera den uppmätta koncentrationen från "a" (ng / ul) till "b" (nM) efter b = a × 10 6 / (330 &# 215; antal nukleotider).
      OBS: Molekylvikten av en nukleotid är 330 g / mol. Den beräknade molära koncentrationsvärdet avgör utspädningsfaktorn för AFM och TEM-avbildning. Såsom för fallet med en 24 H x 28T rektangel, är den gemensamma mätningen för det renade provet omkring 10-60 ng / ul. Eftersom antalet nukleotider för en sådan struktur är 14616 Da, är den molära koncentrationen cirka 2-12 nM. Den slutliga koncentrationen bestäms genom uppsamlings utbyte (~ 20-50%) från centrifugering och volymen av gelén bandet skars ut (ju högre volym, desto mer utspädd det renade provet).

3. Atomic Force Microscopy Imaging

  1. Lossnar glimmer bifogas ett exemplar metallisk skiva med tejp för att få en plan yta och placera preparatskivan på bild scenen.
  2. Tillsätt 40 pl 1X pamingsbuffert A följt av 5 pl (2-5 nM) av det renade prov av 24H × 28Trektangel till nyligen klyvs glimmer yta. Låt blandningen sedimentera under cirka 2 minuter.
  3. Installera AFM kiselnitrid fribärande chip på en fribärande hållare. Använd en C triangulär spets (resonansfrekvens, f 0 = 40-75 kHz, fjäderkonstant, k = 0,24 Nm -1) för avbildning.
  4. Bild ett prov i vätskeskärande läge. Använd följande imaging parametrar för skanning: skanna storlek 2 pm, 1024 linjer för resolutionen, och en svephastighet på 0,5 - 1 Hz (Figur 2C).
  5. Om det behövs, tillsätt 10 ul eller mer av 10 mM NiCl2 lösning för att öka styrkan i DNA-glimmer bindande 29.

4. Provberedning för streptavidin Märkning

  1. Manuellt utforma 24H × 28T rektangel så att hantera strängar på specifika platser ingår att vara ett komplement till anti-handtag strängarna med biotin modifiering, vilket i sin tur kan binda till streptavidi specifikt.
    1. Modifiera molekyl duk genom att fästa en 3 '17-nukleotidsegment som består av en två-nukleotidsekvens (TT) som ett distansorgan och en 15-nukleotid handtaget (GGAAGGGATGGAGGA) till de 14 plattor på översta raden och 14 plattor på botten raden av rektangeln (figur 3A) för att märka gränsen. Denna sekvens är komplementär till en 3 'biotin modifierat antihandtags strängen (TCCTCCATCCCTTCC-biotin).
  2. För intern märkning, bifoga 3 "17 nukleotidsegment till 8 interna plattor och 6 gräns brickor av rektangeln (Figur 4A).
    1. Blanda de 28 strängarna med handtag (gräns märkning) med resten av komponent strängarna i 24H × 28T rektangel (334 trådar) för att göra en 200 nM stamlösning. Blanda de 14 strängarna med handtag (intern märkning) med resten av komponent strängarna i 24H × 28T rektangel (348 trådar) för att få en 200 nM stamlösning.
  3. För boundary märkning, tillsätt 50 pl av den 200 nM stamlösning av strängarna, 6 | il av de 100 pM biotin modifierat antihandtags strängar, 10 pl av 10X glödgning buffert A, och 34 | j, l destillerat avjoniserat vatten till en 0,1-0,2 ml PCR provrör. Den slutliga koncentrationen av komponenten strängen är 100 nM och den slutliga koncentrationen av anti-handtaget biotin modifierade strängen är 6000 nM. Observera att 28 molekyler av den anti-handtag biotin modifierade strängen binder till en 24H × 28T rektangeln så anti-handtag biotin modifierade strängen är i överskott av 100% för att göra bindningen gynnsamma.
  4. För intern märkning, tillsätt 50 pl av den 200 nM stamlösning av strängarna, 3 | il av den interna anti handtag biotin modifierade strängen vid 100 pM, 10 | il av 10X glödgning buffert A, 37 | il destillerat avjoniserat vatten till en 0,1 - 0,2 ml PCR-provrör. Den slutliga koncentrationen av komponenten strängen är 100 nM och den slutliga koncentrationen av anti-handtaget biotin modifi Ed strängen är 3.000 nM. Lägg märke till att 14 molekyler av anti-handtag biotin modifierade strängen binder till en 24H × 28T rektangel så anti-handtag biotin modifierade strängen är över 100% att göra bindande gynnsamma.
  5. Glödga båda proverna i en värmecykeln för 17 timmar med hjälp av de steg som beskrivs i 2.3.
  6. Bered en nativ 2% agarosgel såsom beskrivits i steg 2.4.
  7. Rena båda proverna som beskrivs i steg 2,5.
  8. Mät koncentrationerna av de önskade DNA-strukturer som beskrivs i steg 2.6.

5. Atomic Force Microscopy För Streptavidin Märkning

  1. Bild varje prov med användning av ett AFM som beskrivs i steg 3 (figurerna 3B och 4B).
  2. Efter den första omgången av avbildning, tillsätt 40 ul av 1X glödgning buffert A följt av en il streptavidin vid 10 mg / ml till provet. Låt blandningen sedimentera under cirka 2 min innan reimaging (figurerna 3C och 4C).
_title "> 6. Konvertera en rektangel i ett rör

  1. För att utforma ett rör baserat på rektangeln, hålla alla komponentspecialverktygen på plats förutom de övre och undre rader. Införa en ny rad vars specialverktygen är designade av sammanfoga de övre och undre halva brickor av sina respektive kolumner för att cyklisera den ursprungliga rektangeln till ett rör konformation (Figur 5A).
  2. Blanda den nya raden av strängar (14 strängar) med komponent strängarna av 24H × 28T rektangel exklusive de övre och undre raderna (336 strängarna) för att erhålla en 200 nM förrådslösning.
  3. Följ gelrening steg 2,2-2,7 (figur 5B).

7. Transmission Electron Microscope Imaging

  1. Väg 0,06 g AUC formiat i 3 ml destillerat vatten för att framställa en 2% vattenlösning av AUC formiat färglösning. Filtrera vatten AUC formiat fläcken lösning 2% med en 0,2 ìm filter fäst vid en spruta.
    1. Lägg 5 pl av5 N NaOH till en ml av filtrerad färglösning. Virvel kort lösningen och centrifugera vid 20.000 x g.
  2. Glow uppfylla de kolbelagda galler (belagd sida uppåt) med följande inställningar: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar, och negativa High Tension polaritet.
  3. Använd självstängande pincett för att ta en glöd urladdare behandlad galler från kanten.
  4. Pipett 3,5 pl prov på nätet för 4 min. Använd en bit filterpapper för att suga bort provet genom att bringa filterpapper i kontakt med gallret från sidan.
  5. Omedelbart till 3,5 pl av fläcken lösningen på gallret under en minut.
  6. Wick bort fläcken som i 7.4 och håll filterpapper mot gallret till 1 - 2 min.
  7. Överför nätet till en TEM provhållare och bild med hjälp av ett JEOL JEM-1400 drivs vid 80 kV med förstoring som sträcker sig från 10 K till 80 K (figur 5C).

8. Att bygga godtyckliga former Använda Molecular Canvas

  1. Identifiera en form och välja de strängar som motsvarar formen på molekyl duk. För en triangel form till exempel välja 206 362 trådar för molekylär duken.
  2. Ersätt den exponerade domänen (det vill säga längs hypotenusan av triangeln) med en poly-T-segmentet 10-11 nukleotider lång (konstruktion 1 i fig 6A), eller lägga till ett kantskydd som är komplementär till den exponerade domänen och avsluta den med en 10 - 11 nukleotider lång poly-T-segmentet (konstruktion 2 i figur 6A) för att förhindra aggregation.
    OBS: bara glödgning specialverktygen som motsvarar pixlarna i triangeln (utan att använda beskydd trådar) kommer att leda till aggregering och ingen separat produkt bandbildning på en gel. Använd kantskyddet design för olika former som det är mer resurseffektiva; Det kräver endast fyra ytterligare uppsättningar av trådar (figur 6C) jämfört med 14 ytterligare uppsättningar i ersättnings konstruktion (Figure 6B).
  3. Skapa en tråd bibliotek för 310-pixel molekyl duk som innefattar kärna (362 SST canvas), Set 1 * (kantskydd som binder till domän 1 av en SST), Set 2 * (kantskydd som binder till domän 2 av en SST), Set 3 * (kantskydd som binder till domän 3 av en SST), och Set 4 * (kantskydd som binder till domän 4 av en SST) för erhållande av totalt 1344 kantskydd.
  4. Centrifugera 96 ​​brunnsplattor för de olika uppsättningarna för ungefär 10 s. Pipettera ut de önskade strängarna från plattorna i syfte att göra en förrådslösning för en viss form.
    1. För formen av en triangel med kantskydd, pipett 1 pl 206 trådar från den kärna, 0 från set 1 *, 0 från set 2 *, 0 från uppsättning 3 * och 24 strängar från set 4 * i en 2 ml centrifug röret. Lägg 20 pl av destillerat avjoniserat vatten till röret för att göra en 400 nM stamlösning av DNA-strängarna.
  5. Lägg 50 pl av 400 nM förrådslösning av DNA-stra nds, 10 pl av 10X glödgning buffert B (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 125 mM MgCl2) stamlösning och 40 | j, l destillerat avjoniserat H2O till en 0,2 ml PCR-rör. Detta gör ett urval av triangeln i 1X pamingsbuffert B 100 ^ (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl2) med strängar vid en koncentration av cirka 200 nM per sträng.
  6. Glödga blandningen i en anordning för cyklisk värmebehandling under 17 timmar enligt beskrivningen i steg 2.3.
  7. Bered en nativ 2% agarosgel som beskrivs i steg 2.4.
  8. Rena prov som beskrivs i steg 2.5.
  9. Mäta koncentrationen av DNA som beskrivs i steg 2.6.
  10. Bild provet under AFM som beskrivs i steg 3 (Figur 7C och 7D).
  11. Plocka och blanda trådar för olika former med hjälp av samma sträng bibliotek. Glödga olika lösningar och kombinera renade prover av olika former för att spara tid under AFM avbildning.
jove_title "> 9 Tillval:. Robot automatisering av Shape Design och vätskeblandning

  1. Använd en anpassad MATLAB program för att underlätta utformningen av komplexa former.
  2. Använd programvaran för att leverera instruktioner i form av en pipetteringssekvens till en robot vätskehanterare. Använd roboten vätskehanteraren att välja och blanda trådar som utgör målet form.
    OBS: Shape design och sträng blandning automatiserades att minska den mänskliga faktorn och göra konstruktionen mindre arbetskrävande.

10. rektanglar och rör i olika skalor

  1. Konstruera olika stora rektanglar (Figur 10) genom att helt enkelt förändra antalet parallella skruvlinjer (H) och antal spiralvarv (T).
  2. Följ Steg 3 för en viss storlek rektangel.
  3. Följ steg 6 för en viss storlek rör.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den självorganisering av specialverktygen (figur 1) kommer att ge en 24 H × 28T rektangel, såsom visas i fig 2. DNA-sekvenser för de olika specialverktygen kan modifieras / optimeras för att möjliggöra streptavidin märkning (fig 3 och 4), omvandlingen av en rektangel i ett rör (Figur 5), den programmerbara självorganisering av specialverktygen för att bilda rör och rektanglar av varierande storlekar (Figur 10), och byggandet av 2D godtyckliga former med hjälp av molekylära duk (Figur 8). Två utföranden (domänsubstitutions design och kantskydd design) testades som lösningar sammanläggning längs utsatta områden av godtyckliga former (Figur 7). Båda mönster har jämförbar gel avkastning och strukturell integritet, men kantskyddet designen är mer kostnadseffektivt eftersom det krävs färre hjälp arter (Figur 6).Sträng plockning och blandning kan automatiseras, såsom visas i fig 9 för att reducera mänskliga fel och spara tid.

Figur 1
Figur 1. Själv montering av Molecular former med enkelträngade plattor. (A) Den kanoniska SST motiv, anpassad från 12 (B) Vänster och mellersta. Två skildringar av sammansatta specialverktygen. Inre specialverktygen har en full längd av 42 baser och är märkta "U", medan gränsspecialverktygen har 21 baser och är märkta "L". I den vänstra diagrammet, färger skilja olika domäner. I mitten diagram, färger skilja olika strängar. Höger: En schematisk bild av tegelvägg vy av SST strukturer. Tjocka tegel är fulla specialverktygen och tunna tegel är gränsspecialverktygen. Rundade kanter indikerar ingen kompletterande parning. Som i mitten figuren, färger urskilja enskilda plattor. I alla diagrammar, har varje platta en unik sekvens. (c) Undanhållande ett lämpligt urval av strängar från SST samlingen som utgör rektangeln designen i Figur B resulterar i bildningen av en annan önskad form, såsom en triangel (vänster) eller en rektangulär ring (höger). (d) Utformningen av ett rör med en förutbestämd bredd och längd. (E) Givet en förut syntetiserad pool av SST-sekvenser (överst), godtyckliga former (botten) kan utformas genom att välja en delmängd av trådar för att användning i strängblandningen (mörkblå pixlar) och eliminera resten (ljusblå pixlar). Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerad figur 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Design och AFM bild av 24H × 28T rektangel. (A) Schematisk bild av 24H × 28T rektangel. En inzoomad vy visas också för den detaljerade lokala strukturen. Den individuella SST segmentet arrangemang är antingen 10 nt - 11 nt - 11 nt - 10 nt (t.ex. A2.13-b2.13-a1.13 * -b1.12 *) eller 11 nt - 10 nt- 10 nt - 11 nt (t.ex. a3.12-b3.12-A2.13 * -b2.12 *). Trianglar på vänstra sidan av rektangeln visar rader med 10nt-11nt-11nt-10nt SST arrangemang; de andra interna specialverktygen har 11 nt - 10 nt -10 NT- 11 nt i stället (nt är en akronym för nukleotid). Eftersom 24H × 28T SST rektangel har liknande dimensioner till en DNA-origami struktur, det kriterium införts i DNA origami arbete och överväga en SST rektangel "välformade" om det har något fel i den förväntade översikten större än 15 nm i diameter var antogs. Dessutom, en "välformat" rektangel struktur has inga hål i dess inre större än 10 nm i diameter krävdes. Efter ovanstående kriterier, var en "väl-formation" förhållande av 55% (N = 163) erhålles. En röd asterisk (*) anger det nedre vänstra hörnet av rektangeln här. (B) 2% nativ agarosgelelektrofores. U, orenad; P, renad (genom gel-extraktion från lane U) (C) AFM bild av gitterstrukturen. (Svepstorlek: 2 | j, m x 2 pm). Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerad figur 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Boundary Märkning av 24H × 28T rektangel. (A) Schematisk bild av den specifika biOtin-märkt 24H × 28T rektangel. Strängarna markerade i blått är handtags strängarna. Strängarna markerade i rött är anti-handtag strängarna märkta med 3 "biotin (svarta prickar). Streptavidin avbildas som en orange boll (B) AFM bild innan du lägger streptavidin (skanning storlek: 1 pm x 1 pm).. (C) AFM bild efter tillsats av streptavidin (skanning storlek: 1 pm x 1 pm). Infälld, en inzoomad som visar framgångsrik märkning. Observera att streptavidin framstod som antingen vita prickar eller ränder på grund av deras upphöjda höjder. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerad figur 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Iinterna Märkning av 24H × 28T rektangel. (A) Schematisk bild av den specifika biotinmärkta 24H × 28T rektangel. Strängarna markerade i blått är handtags strängarna. Strängarna markerade i rött är anti-handtag strängarna märkta med 3 "biotin (svarta prickar). Streptavidin avbildas som en orange boll (B) AFM bild innan du lägger streptavidin (skanning storlek: 1 pm x 1 pm).. (C) AFM bild efter tillsats av streptavidin (skanning storlek: 1 pm x 1 pm). Infälld, en inzoomad som visar framgångsrik märkning. Observera att streptavidin verkade antingen som vita prickar eller ränder på grund av de upphöjda höjder. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerad figur 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

inom-page = "always"> Figur 5
Figur 5. Design och TEM bild av 24H × 28T Tube. (A) Schematisk bild av 24H × 28T fat. Två zoomat in synpunkter på toppen och botten visar detaljerade identiteter segment. Notera att segment a24.x * (t.ex. a24.13 *) och b24.x * (t.ex. b24.12 *) av den översta raden är komplementära till segment a24.x (t.ex. a24.13) och b24.x (t.ex., b24.12) hos den nedre raden; sådan komplementaritet förväntas resultera i bildningen av den rörformiga strukturen. (B) 2% nativ agarosgel elektrofores. U, orenad; P, renad (genom gelextraktion från spår U) (C) TEM bild av cylinderstrukturen (skala bar: 100 nm).. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerad figur 26.ighres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Två modeller för förhindrande av aggregation orsakas av Exposed Sticky domäner. (A) En sida-vid-sida demonstration av två metoder för att täcka utsatta områden. Den oparade klibbiga domän (domän 4) indikeras med en röd, streckad ruta. Design 1 är domänen substitutions konstruktion, i vilken det oparade domänen är substituerad med en poly-T-domän (visas i rött och märkt "T"). Design 2 är kantskyddet utformning, vilket innebär att täcka oparade domän med ett kantskydd sträng (visas i rött och märkt "T-4 *"). Kantskyddet sträng består av en poly-T avsnitt och ett komplement till den exponerade domänen. (B) De olika möjliga gräns konfigurationer i samband med domän substitution (konstruktion 1).Det finns 14 olika sätt en intern SST (visas i blått) kan lämna en exponerad domän eller domäner. De lämpliga strängen utbyten visas i rött för varje situation. (C) kantskyddet design (design 2). En intern SST (blå) kräver endast fyra kantskydd trådar (röd) för att täcka exponerade domäner med denna design. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerad figur 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. Två modeller för SST triangeln. (A) och (B) visar scheman baserade på design 1 (domän substitution) och design 2 (kantskydd) i figur 8, respektive. En poly-T-region (T10 eller T11 i figuren) är avbildad somett rundat hörn i blockdiagrammet. Den infällda bilden visar en förstorad vy av den angivna strukturen med den streckade rutan. Skalstrecken, 100 nm. (C) och (D) är de AFM-bilder. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerad figur 26.

Figur 8
Figur 8. Diagram och AFM-bilder av 100 olika former. Struktur mönster visas i ovanpanelema. Ljusblå färg indikerar duken trådar kvar av blandningen medan mörkblå färg indikerar strängarna ingår. För tydlighets skull, är kantskydd strängar utelämnas. En motsvarande AFM bild av varje struktur visas under dess utformning. Varje bild är 150 nm × 150 nm i området. Det finns 100 unika former. Inkluderat är 10 arabiska siffror, 26 versaler i det latinska alfabetet, 23 skiljetecken och keyboard symboler, 10 emoticons, 9 astrologiska symboler, 6 kinesiska tecken, och flera diverse symboler. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerad figur 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9
Figur 9. Robot Automation Flödesdiagram. Detta diagram visar arbetsflödet som används för att automatisera blandningsprocessen. Först är en anpassad MATLAB-program som används för att utforma den önskade formen. Än en gång, mörkblå rektanglar anger strängarna som skall ingå i blandningen. Efter konstruktionen är klar matar programmet en uppsättning pipetteringsanvisningar för robot vätskehanteraren. Roboten pipetter rätt koncentrationer av lämpliga trådar för en viss form i en plate väl. Blandningen genomgår sedan en kruka glödgning, följt av AFM-avbildning av de erhållna formerna. (Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerad figur 26). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10
Figur 10. självorganisering av rektanglar och rör i olika skalor. (A) AFM-bilder av SST rektanglar med följande utformade dimensioner (från vänster till höger):. 4H × 4T, 6H × 7T, 10H × 10T, 12H × 14T, 18H × 20T, 24H × 28T, och 36h × 34T ( B) Molekylvikterna för strukturerna är på en logaritmisk skala. Asterisken anger vikten av en typisk M13-DNA origami struktur som en referens. (C) TEM-bilderav SST-rör med följande designade dimensioner (från vänster till höger): 8H x 28T, 8H × 55T, 8H × 84T, 24H × 28T, och 12H × 177T. Alla skal staplarna visar 100 nm. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerad figur 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I strukturen bildningssteget, är det viktigt att hålla en lämplig koncentration av magnesiumkatjoner (t.ex.., 15 mM) i DNA-strängen blandningen egen montera DNA nanostrukturer. Även i agarosgelen karakterisering / reningssteg, är det viktigt att hålla en lämplig magnesium katjonkoncentration (t.ex.., 10 mM) i gelén och gelén kör buffert för att bibehålla DNA nanostrukturer under elektrofores. För 24H × 28T rektangel struktur, testade vi glödgning i olika Mg ++ koncentrationer och funnit att strukturen bildas typiskt inom intervallet 10 till 30 mM Mg ++ (med den bästa bildning utbytet med omkring 20 mM Mg ++).

Till skillnad från att bygga ställning origami struktur, har SST strukturen en modulär arkitektur. Olika former kan utformas från samma duk genom att välja en lämplig delmängd av SST kakel. Dessutom är SST struktur monteras tillbakam bara korta syntetiska DNA-strängar och inte innebär en lång klätterställning som används i origami strategi. Därför är storleken på SST strukturen inte begränsad av längden av den tillgängliga ställningen. Även DNA origami tillvägagångssätt ofta kan optimeras för att producera antingen vikta strukturer eller ovikta monomerer kan SST resultera i delvis formade strukturer och därmed kan kräva gelrening för senare användning. Dessutom, på grund av avsaknaden av en byggnadsställning sträng, kan ett SST struktur vara mer "sprött" än dess DNA origami motsvarighet. Både SST strategi och DNA origami strategi är snabb utvecklas, och en användare rekommenderas att välja en metod som bäst passar hans eller hennes särskilda funktionella behov.

Det är slående att hundratals små monomerer förmedlade endast av lokala bindningsinteraktioner kan själv montera in en föreskriven global form, vilket framgår av SST tillvägagångssätt. De grundläggande principer som anges i SST strategi should vara generaliserbara material bredvid DNA-strängarna, och den grundläggande metod som beskrivs i den här artikeln, efter lämplig modifiering, bör göra det möjligt för konstruktioner av komplexa strukturer själv sammansatta av olika material.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats av Office of Naval Research Young Investigator Program Award N000141110914, Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF KARRIÄR Award CCF1054898, NIH direktörens Nya Innovator Award 1DP2OD007292 och en Wyss Institutet för biologiskt inspirerade LTH Startup fonden (till PY) och Tsinghua-Peking Center for Life Sciences Startup fonden (BW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA Strands  Integrated DNA Technology Section 3.1
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen S33102 Section 3.4.2
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns BIO-RAD 731-6166 Section 3.6
Bruker's Sharp Nitride Lever Probes Bruker AFM Probes SNL10 Section 4.3
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator Invitrogen G6600 Section 3.6
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428 000.414 Section 3.6
Transmission Electron Microscope  Jeol Jem 1400 Section 7.4
Multimode 8 Veeco Section 4
Typhoon FLA 9000 Laser Scanner GE Heathcare Life Sciences 28-9558-08 Section 3.5
Ultrapure Distilled water Invitrogen 10977-023 Section 3.7.1
Mica disk SPI Supplies 12001-26-2 Section 4.1
Steel mounting disk Ted Pella, Inc. 16218 Section 4.1
carbon coated copper grid for TEM Electron Microscopy Sciences FCF400-Cu Section 7.2
tweezers Dumont 0203-N5AC-PO Section 7.31
glow discharge system Quorum Technologies K100X Section 7.2
DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler BIO-RAD PTC–0240G Section 3.3
Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems ThermoScientific B2 Section 3.4.3
Seekam LE Agarose 500G Lonza 50004 Section 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp ThermoScientific SM1333 Section 3.4.4
Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer ThermoScientific Section 3.7
0.2 um filter Corning Inc. 431219 Section 7.1.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
  2. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  3. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2 (12), e424 (2004).
  6. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
  7. Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
  8. Park, S. H., et al. Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures. Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).
  9. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  10. Schulman, R., Winfree, E. Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).
  11. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
  12. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  13. Sharma, J., et al. Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles. Science. 323 (5910), 112-116 (2009).
  14. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  15. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
  16. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  17. Zheng, J. P., et al. From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D. DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).
  18. Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
  19. Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline two-dimensional DNA origami arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).
  20. Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames. Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).
  21. Woo, S., Rothemund, P. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).
  22. Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
  23. Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures. ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).
  24. Seeman, N. C. Nanomaterials based on DNA. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).
  25. Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures. Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).
  26. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  27. Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly. J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).
  28. Seeman, N. C. De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering. J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).
  29. Hansma, H. G., Laney, D. E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy. Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).
  30. Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. Enzyme-free nucleic acid logic circuits. Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).
  31. Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. Programming biomolecular self-assembly pathways. Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).

Tags

Kemi självmontering DNA kakel enkelsträngade plattor molekylära duk molekyl pixel programmerbara nanostrukturer DNA-nanoteknologi
Själv montering av komplexa Tvådimensionella former från Single DNA Tiles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, B., Vhudzijena, M. K.,… More

Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles. J. Vis. Exp. (99), e52486, doi:10.3791/52486 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter