Introduction
Anatomisk bane sporing er en av de mest vanlig anvendte verktøy for å dechiffrere forholdet mellom hjernen og opptreden en. Avansement i nevrale kretser tracing teknologier har skjenket nevrologer med evnen til å spore nevrale kretser fra genetisk identifisert neuron populasjoner i mus 2. På tross av disse tekniske fremskritt er det fortsatt utfordrende å rakne dannelsen av nevrale kretser spesielt under embryonal modning. Dette er fordi de fleste av sporings metodene som er utviklet til dags dato er basert på stereotaxic injeksjon av transsynaptic tracere eller genmodifiserte neurotropisk virus (figur 1) 2,3. Mens disse teknikkene oppnå romlig og tidsmessig oppløsning av tilkoblingsmuligheter, flere iboende begrensninger som teknisk utfordrende tracer injeksjoner i utviklingen av hjernen, reproduserbarhet av injeksjonsstedet, potensiell betennelse på injeksjonsstedet og viktig-tantly cytotoksisitet forårsaket av neurotropisk virus begrense bruken fire.
En alternativ metode er å uttrykke de transsynaptic tracere som transgener i genetisk endrede mus. Vi har nylig endret denne teknikken og utviklet en binær genetisk transsynaptic tracing system for å kartlegge de nevrale kretser av noe genetisk identifisert nevronale befolkningen fem. Vår eksperimentell strategi er basert på to nye knock-in musestammer som uttrykker enten toveis tracer bygg lectin (BL) 6 eller retrograd tracer tetanustoksin fragment C smeltet til GFP (GTT) 7 fra ROSA 26 locus etter Cre-mediert rekombinasjon. Her har vi brukt disse musestammer for selektivt å uttrykke BL og GTT i neuroner som produserer kisspeptin, et neuropeptid som er implisert i regulering av modning av forplantningsakse 8,9. Vi viser at denne teknikken er egnet for å visualisere utviklingen og modningen av Kisspeptin nevrale kretser under embryonal utvikling av den kvinnelige mus hjernen 5.
Avlsarbeid
Den R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) og R26-GFP-TTC (GTT) sporlinjer er knock-in stammer 5 som bærer rekombinante ROSA26 alleler. Den R26-BIZ og R26-GTT-alleler er transkripsjonelt stille på grunn av nærvær av en sterk transkripsjonsstoppsignal, som er flankert av to loxP-seter 5. Ekspresjon av BIZ og GTT transgenet blir aktivert av Cre-formidlet fjerning av transkripsjonsstoppsignalet. De R26-BIZ og R26-GTT alleler kan brukes uavhengig av bare krysset med en Cre driver linje. For dyr analyse heterozygotisk for de respektive Cre og R26 alleler kan bli brukt. Kullsøsken som bærer ett Cre eller en R26 allel henholdsvis bør brukes som kontroller. Alternativt er det også mulig å generere tRiple knock-in dyr bærer Cre, R26-BIZ og R26-GTT alleler, men dette vil kreve ytterligere ett kryss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Etikk Uttalelse: Prosedyrer som involverer forsøksdyr ble godkjent av dyrevelferd komité ved Universitetet i Hamburg og Universitetet i Saarland.
1. Forberedelse og Fiksering av Embryonic Tissue
- Ordne alt utstyr som trengs for å dissekere ut embryoene og forberede løsninger for påfølgende fiksering av vevet før ofre dyrene.
MERK: alltid fremstille en frisk 4% paraformaldehyd (PFA) løsning (4% PFA i 0,1 M fosfat-bufret saltvann (PBS), justere pH til 7,4). - Avlive timet gravid kvinnelig mus med en etisk godkjent prosedyre.
- Overfør musa på en plattform. Fukt ventral side av magen med 70% etanol og lage et vertikalt snitt bruker skarp saks til å eksponere bukhulen.
- Identifisere den embryonale kjeden og trekk den forsiktig ut med butte pinsett og legg den inn i iskald PBS.
- Fjern de enkelte embryoer fraembryonale kjeden hjelp av gode saks og pinsett. Fjern ekstra vevet rundt embryoene og vaske dem i iskald PBS.
- Ta en liten hale biopsi (før du overfører embryoet inn i PFA) og inkuberes den i halen lysisbuffer for kjønnsidentitet og tracer allel genotyping PCR.
- Start fra embryo på det mest lateral side og overfører hvert embryo separat inn i et rør inneholdende iskald 4% PFA på is på en ristemaskin.
- Suge embryoene i en alder av E13.5 eller yngre i 1,5 timer på isen med konstant risting. Suge embryoene på alder E14.5 og E15.5 i 2,5 timer på isen med konstant risting.
- For embryoer alder E16.5 eller eldre, halshogge og fjern den ytre huden før soaking hodet i PFA løsning. Heads of E16.5 embryoer kan være gjennomvåt i 4,5 time på is med konstant risting.
- Etter passende fiksering, vaske embryoene tre ganger med iskald PBS. Overfør embryoene i 30% sukrose i PBS-løsning ved 4 ° C inntil de synkertil bunnen.
2. Fryse
- Ordne alle materialer som kreves før du starter fryseprosessen: cryo-mold, Cryo handsker, fjærvekt entomologi tang, tusj og optimal kutte temperatur sammensatte (OCT)
- Merke Cryo-formen med en permanent alkoholbestandig markør (nevne orientering av vev, dato og genotype). Forberede en slush av knust tørris og 100% etanol i en isen bøtte. Plasser et glass beger inne inneholder isopentan. Vent i 10 minutter for isopentan å kjøle seg ned.
- I mellomtiden fjerne vev fra sukroseløsning, tørk av overflødig sukrose rundt vev ved hjelp av laboratorie våtservietter. Overfør vevet inn i en på forhånd merket cryo-formen med tilstrekkelig oktober å dekke vevet. Unngå eventuelle luftbobler i oktober; spesielt rundt vevet.
- Orientere vev i oktober hjelp featherweight entomologi tang for å unngå skade på vev. Begynne å fryse ved å overføre cryo-mold i den på forhånd avkjølte isopentan bad. Ikke sprut isopentan inn i oktober da det ikke vil fryse skikkelig. Pakk prøvene i folie og lagre aluminium ved -80 ° C.
3. Cryosectioning
- Skjær 14 mikrometer tynne seriesnitt i serien av fem bruker en cryostat og samle på SuperFrost® Plus glass for immunfluorescens (IF) analyse. Oppbevar lysbilder ved -80 ° C til de er benyttet.
4. Tracer visualisering Bruke tyramide Signal Amplification (TSA) Protokoll
- Forberede buffere og reagenser som kreves for farging. Alltid ferskt fremstille Tris-NaCl-Tween (TNT) buffer på dagen for anvendelse.
- Forbered TNT-buffer ved anvendelse av 100 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml av 5 M NaCl og DDH 2 O opp til et endelig volum på 1 l til 500 ul Tween 20 anvendelse av en 1 ml pipette. Legg til Tween 20 sakte og skylle pipetten opp og ned flere ganger for å sikre at alle Tween 20 er ioppløsning.
- Forbered Tris-NaCl-Blocking (TNB) buffer ved anvendelse av 100 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml av 5 M NaCl og DDH 2 O opp til et endelig volum på 1 L. Tilsett 5 g Blokkering reagens (tilgjengelig med kit) sakte i små trinn til buffer under omrøring. Oppvarm løsningen gradvis til 55 ° C under kontinuerlig omrøring for å løse opp Blocking Reagens (dette bør ikke ta mer enn 30 til 60 minutter). For å oppnå homogen oppvarming bruke et vannbad ved 55 ° C. Løsningen vil dukke opp melkeaktig. Bringe løsningen til romtemperatur før bruk. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C for langtidslagring.
- Rekonstituere biotin tyramide reagens (følger med kit) i Molecular Biology / HPLC-grade DMSO. Avhengig av hvor settet brukes passende mengde DMSO kan variere. Oppbevar stamløsning ved 4 ° C.
MERK: Deler fra dyr heterozygote for de respektive Cre og R26 alleler kan bli brukt for kretsanalyse. Bruk seksjoner fra kullet som bærer en Cre eller en R26-allel, henholdsvis, som negative kontroller. Behandle negative slides akkurat som lysbilder fra dobbelt heterozygote dyr. I tillegg inkluderer en kontroll lysbilde fra en dobbel heterozygot dyr, men la ut TSA reagens (unamplified kontroll).
- Ved hjelp av en skarp frisk skalpell fjerne overflødig oktober omliggende vevet seksjoner og markerer grensen rundt seksjonene med en PAP penn.
- Tørk de glir i 2-3 minutter ved romtemperatur (RT). Vask lysbilder på RT 3x med TNT for 5 min hver. Inkuber objektglassene ved RT i 30 minutter i 0,3% H 2 O 2 løsning i iskald metanol for å slukke endogen peroksidaseaktivitet.
- Vask 3 ganger med PBS i 5 minutter hver ved RT. Inkuber i 10 min i 0.5% Triton X-100 i PBS i vev permeabilization. Vask lysbilder på RT 3x med TNT for 5 min hver.
- Blokker med TNB (blokkering løsning, 200-300 mikroliter per lysbilde) for 30min ved RT i et fuktet kammer. Sørg for at alle delene er helt dekket av TNB. Ikke la lysbildene tørke ut mellom trinnene.
- Avløp av overskytende blokkeringsbuffer og anvende det primære antiserum som gjenkjenner tracer (1: 1000 geit-anti-WGA for BL, 1: 15.000 kanin anti-GFP for GTT) fortynnet i TNB i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C. Sørg for å bruke nok volum til å dekke vev delen (200-300 mL per lysbilde).
MERK: Den primære antisera fortynninger anbefalte her kan måtte justeres. - Vask objektglassene ved RT 3x med TNT i 5 minutter hver med omrøring.
- Inkuber seksjoner med biotinylert sekundært antiserum som gjenkjenner verts av første antiserum (1: 500 heste anti-geite-IgG-anti-WGA, 1: 5000 geit-anti-kanin-IgG-anti-GFP i TNB i 1 time ved RT).
- Vask 3 ganger med TNT ved RT i 5 minutter hver med omrøring. Inkuber i 1: 100 streptavidin (SA) -konjugert pepperrotperoksidase (SA-HRP, forut with settet) i TNB i 30 minutter ved romtemperatur i et fuktig kammer. Vask lysbilder på RT 3x med TNT for 5 min hver. I mellomtiden tine TSA.
- Fortynne TSA 01:50 i TSA forsterkning fortynningsmiddel (følger med settet, bruk TSA kit for visualisering av BL og TSA + kit for GTT). Inkuber vevsdelene i fortynnet TSA for nøyaktig 10 min ved RT. Fortynne TSA like før bruk, helst i løpet av forrige vasketrinn, må du ikke bruke eventuelle gjenværende utvannet TSA reagens for fremtidige eksperimenter; alltid forberede frisk.
- Vask objektglassene ved RT 3x med TNT i 5 minutter hver med omrøring. Inkuber med 1: 500 Alexa Fluor® 546 streptavidin-konjugat i TNB i 30 min ved RT. Vask objektglassene ved RT 3x med TNT i 5 minutter hver med omrøring.
- Inkuber i 10 minutter i 5% bisbenzimide løsning i PBS ved romtemperatur i nukleær farging. Vask objektglassene ved RT 3x med TNT i 5 minutter hver med omrøring. Monter med Fluromount G og utføre epifluorescence eller konfokalmikroskopi.
5. τlacZ Farging for Embryonale Seksjoner
- Forberede buffere og reagenser som kreves for farging. Alltid ferskt fremstille LacZ buffer C før bruk.
- Forbered 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-gal) stamoppløsning (40 mg / ml) ved å tilsette 40 g av X-gal til 1 ml 70% dimetylformamid (DMF). Dekk med aluminiumsfolie og oppbevar ved -20 ° C for langtidslagring.
- Forberede nitro blå tetrazolium (NBT) stflokk-oppløsning (50 mg / ml) ved tilsetning av 50 g av NBT til 1 ml 70% DMF. Dekk med aluminiumsfolie og oppbevar ved -20 ° C for langtidslagring.
- Forbered LacZ fiksativ ved hjelp av 80 ul 25% glutaraldehyd, 5 ml av 4% PFA, 20 pl av 1 M MgCl2, 100 ul av 500 mM EGTA, 1 ml 1 M fosfatbuffer pH 7,4 og DDH 2 O opp til en endelig volum på 10 ml.
- Forbered LacZ buffer A ved hjelp av 1 ml av 1 M MgCl2, 5 ml 500 mM EGTA, 50 ml 1 M fosfatbuffer pH 7,4 og DDH 2 O opp til et sluttvolum på 500 ml.
- Forbered LacZ buffer B ved anvendelse av 1 ml av 1 M MgCl2, 5 ml 500 mM EGTA, 5 ml 1% natriumdeoksycholat, 100 ml 10% NP-40, 50 ml av 1 M fosfatbuffer pH 7,4 og DDH 2 O opp til et sluttvolum på 500 ml.
- Forberede LacZ buffer C ved tilsetning av 10 pl NBT stamløsning og 12,5 mL av X-gal stamløsning til 1 ml LacZ buffer B. Gjør frisk like før bruk og dekk med aluminiumsfolie.
- Tørk lysbilder på RT minst for 10-15 min (i mellomtiden forbereder lysbilder med en PAP penn).
- Fest seksjon med LacZ fiksativ i 2 min ved romtemperatur i en fuktet kammer inne avtrekks-hette. Vask 3 ganger med PBS supplert med 2 mM MgCl2.
- Skyll lysbilder med LacZ buffer A. Vask lysbildene med LacZ buffer A 3 ganger i 10 minutter hver på RT. Vask to ganger med LacZ buffer B for 5 min hver. Inkuber objektglassene i LacZ buffer C ved 30-37 ° C i 6 timer eller natten over i et fuktet kammer.
MERK: Legg tilstrekkelig volum av LacZ buffer C; lysbilder bør ikke tørke ut under inkubasjon. - Etter passende inkubasjonen vaskes lysbilder med PBS supplert med 2 mM MgCI2. Skyll seksjoner kort med DDH 2 O. Dekkglass med Mayer glysin gelatin. Egnet for et lysmikroskop utstyrt med en kontrast differensial forstyrrelser (DIC) avbildning set-up.
6. GendER og Tracer Genotyping
- Forbered halen lysisbuffer ved hjelp av 1 ml av 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 pl 500 mM EGTA, 200 ul 10% SDS og 400 ul av 5 M NaCl og DDH 2 O for å gi et sluttvolum på 10 ml.
- Legg 500 mL av halen lysisbuffer til hver Eppendorf rør som inneholder en hale biopsi. Legg proteinase K til en endelig konsentrasjon på 100 mg / ml. Inkuber over natten på en rystemaskin ved 55 ° C.
- Sentrifuger prøvene ved 17 000 xg i 10 min ved RT. Overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør. Legg 500 ul av isopropanol til den overliggende væske. Blandes i minst 5 minutter ved å invertere rørene opp og ned.
- Spinne i sentrifuger ved 17 000 xg i 5 minutter ved RT. Hell av supernatanten. Tilsett 200 ul 70% etanol. Rist i minst 5 min.
- Sentrifuger ved 17000 x g i 5 min. Fjern supernatanten med en Pipetman (ikke helle av). Tørk pellet i et varmt kammer (37 ° C) i 15-30 min.
- Resuspender pelleten i 100 plav lav TE pH 8,0 eller vann ved hjelp vid boring filtrerte tips. Sett i 55 ° C i 1 time og ved 37 ° C over natten for riktig oppløsning. Oppbevares ved 4 ° C.
- Bruke 1 pl av DNA for PCR-reaksjon (50 ul reaksjonsblanding inneholdende 1 pl av hale-DNA, 2,5 ul DMSO, 22:00 av hver primer, 25 uM av hver dNTP, og 1 M betain). PCR primere for genotyping og kjønnsidentitet er oppført i Materials tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne delen viser representative resultater som kan oppnås jobbe med R26-BIZ (B L- jeg RES-τlac Z) og R26-GTT (G FP- TT C) alleler. Her bruker vi R26-BIZ og R26-GTT alleler å analysere modningen av nevrale kretser som regulerer reproduktive aksen. Reproduksjon i virveldyr er sentralt styrt av en liten undergruppe av nevroner i hypothalamus, som skiller ut gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH). Kisspeptin, en potent aktivator av GnRH-neuroner, har vært implisert i regulering av aktiviteten av GnRH-neuroner, men når de nevrale kretser mellom GnRH og kisspeptin neuroner er etablert i den tredje hunnmus hjernen var ikke kjent 5. Først viser vi at uttrykket av BIZ og GTT transgener er spesielt aktiveres av Cre-avhengige rekombinasjon i embryonalekisspeptin nevroner i den bueformede kjerne (ARC) (figur 2) ved hjelp av en kisspeptin spesifikk Cre driver linje 10. Vi demonstrerer at kisspeptin neuroner i ARC allerede kommuniserer med en bestemt undergruppe av GnRH-neuroner in utero (figur 3A, B). Videre viser vi at ARC kisspeptin neuroner er oppstrøms for GnRH-neuroner (figur 3A, C). Tatt sammen våre funn tyder på at de nevrale kretser mellom kisspeptin og GnRH nevroner er fullt etablert og operativt i den kvinnelige mus hjernen før fødselen.
Figur 1:. Transsynaptic overføring av tracere med konvensjonelle eller genetiske tilnærminger I den konvensjonelle tilnærmingen, er en transsynaptic tracer tatt opp av alle nervecellene på injeksjonsstedet og dermed potensielt merking uspesifikke urelaterte trasé. Igenetisk tilnærming, er sporstoffet selektivt uttrykt av genetisk definerte nevroner dermed spesielt visualisere nerveceller knyttet til tracer-uttrykke celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Trofast aktivering av BIZ og GTT transgenet i embryonale ARC kisspeptin nevroner. (A) Avl strategi for å aktivere BIZ og GTT uttrykk i kisspeptin nevroner. Vi avlet R26-BIZ og R26-GTT-mus med Kisspeptin-IRES-Cre (KissIC) mus 10, hvori Cre-rekombinasen blir uttrykt under kontroll av promoteren kiss1. (CE) β-gal enzymatisk aktivitet identifiserer tracer-produserende celler og er begrenset til ARC i hjernen hos en kvinnelig KissIC / R26-BIZ embryo på embryonale dag (E) 18.5. (FG) Dobbelt immunfluorescens for kisspeptin (grønn) og BL (red) (F) eller GTT (red) (G) viser trofast aktivering av BL eller GTT uttrykk av Cre-mediert rekombinasjon i kisspeptin nevroner i KissIC / R26-BIZ eller KissIC / R26-GTT kvinnelig museembryoer, henholdsvis. Skala barer (C) 500 mikrometer, (D) 200 mikrometer, (F, G) 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: GnRH nevroner postsynaptisk forbundet med og nedstrøms for kisspeptin neuroner. (A) Kombi genetisk toveis transsynaptic tracing. Mens τlaCZ er begrenset til de Cre-uttrykker kisspeptin nevroner, er BL transsynaptically overført til oppstrøms (presynaptisk) og nedstrøms (postsynaptiske) nevroner i KissIC / R26-BIZ mus. I kontrast er GFP-TTC transsynaptically overført til presynaptiske, men ikke postsynaptiske nevroner i KissIC / R26-GTT mus. Postsynaptiske nevroner har τlacZ-positive axon fiber i deres nærhet (B, C) Dobbelt immunfluorescens for BL (rød, B). Eller GTT (rød, C) og GnRH (grønn) på en sagittal snitt gjennom hele hodet av en kvinnelig KissIC / R26-BIZ eller KissIC / R26-GTT embryo ved E18.5. (B) Merk at noen, men ikke alle GnRH nevroner inneholde BL. Disse dataene viser at en undergruppe av embryonale GnRH nevroner er postsynaptisk koblet til ARC kisspeptin nevroner. (C) Legg merke til at ingen av GnRH nevroner inneholde GTT. Eksklusiv transsynaptic overføring av BL men ikke GTT til GnRH nevroner demonstrerer at GnRH nevronerer nedstrøms kisspeptin nevroner. Skala barer (B, C) 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Funksjoner | Transsynaptic sporstoffer | Neurotropisk virus |
| Modus av søknaden | Uttrykt som en transgen | Mekanisk injisert |
| Retning av spredning | Antero, retrograd og toveis | Retrograd og antero |
| Synaptic effekt | Multisynaptiske | Multisynaptiske eller monosynaptisk (retrograd only) |
| Signalstyrke | Svak, synker på hver synapse | Sterk, signalforsterkning på hver synapse |
| Immunrespons | None; uttrykt som endogent protein | Sterk immunrespons, dødelig |
| Romlig og tidsmessig oppløsning | Avhenger formidler av valg | Svært selektiv på grunn av mekaniske injeksjoner på enkeltsider |
Tabell 1: Sammenligning av funksjoner av genetiske transsynaptic tracere og genmodifiserte neurotropisk virus
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uttrykke transsynaptic sporstoffer som transgener å spore nevrale kretser av genetisk definerte nevronale populasjoner har flere fordeler i forhold til stereotaxic injeksjon av sporstoffer eller neurotopic virus. Først blir tracer produsert som et endogent protein, og derfor ikke fremkalle noen immunrespons og en selektiv nervebanen kan bli analysert i forskjellige dyr med høy reproduserbarhet. For det andre, fordi dette er en ikke-invasiv metode kan bli anvendt for å spore de kretser fra neuroner ikke lett tilgjengelige for stereotaksiske injeksjoner, for eksempel in utero. Begrensninger omfatter en generelt lav effekt i transsynaptic overføring, noe som kan resultere i vanskeligheter med å detektere sporstoff. Videre blir det tracer molekyl utvannet ved hver synapse. I kontrast, neurotropisk virus replikere og virusreplikasjon i sin tur fører så å signalforsterkning etter å ha krysset synapse. Imidlertid er virusreplikasjon også en stor limitation av bruken av neurotropisk virus på grunn av iboende viral cytotoksisitet. Noen funksjoner i genetiske transsynaptic sporstoffer og genmodifiserte neurotropisk virus er sammenlignet i tabell 1.
De R26-BIZ og R26-GTT alleler utfyller hverandre og legge til rette for synliggjøring av de nevrale kretser av en genetisk identifisert nevronale befolkningen på Cre-mediert rekombinasjon. R 26 promoter er godt karakterisert og formidler stedsnærværende uttrykk med beskjeden styrke 11,12. Ved hjelp av svært følsomme metoder for tracer deteksjon som tyramide signalforsterkning (TSA) systemet tillater identifisering av selv små mengder av spor molekyler overført over synapser. En annen stor fordel av å bruke R26 promoter å kjøre tracer uttrykk er at de uttrykker nevroner kontinuerlig syntetisere sporingsstoffene i hele sitt liv. Dette gjør det mulig å analysere kretsen modningi lengre tidsperioder 5. I motsetning til dette, er dette ikke mulig ved bruk av neurotropisk virus på grunn av deres cytotoksisitet. Viktigere, vår binære genetisk system og bruk av R26-promoteren frakobler sporstoffproduksjon fra potensielt sterkt regulert endogene promotere ikke Cre uttrykket (i dette tilfellet, den kiss1 promoter), som kan reguleres av en rekke genetiske og epigenetisk faktorer 13. Derfor transsynaptic overføring av BL og GTT gjenspeiler faktiske synaptisk kommunikasjon mellom to nevronale populasjoner.
Cre-mediert rekombinasjon er en irreversibel arrangement og derfor konverterer utviklingshemmede forbigående genuttrykk i stabil transgene uttrykk. Bruken av en induserbar Cre system 14 potensielt kan avdekke en utviklingseffekt på grunn av forbigående ekspresjon Cre.
I konklusjonen, kan de to nye R26-BIZ og R26-GTT musestammer brukes til å analysere lokal og long gående nevrale kretser som kan være sammensatt av forskjellige klasser og typer av nerveceller som stammer fra en hjerneregion eller fra ryggmargen i en Cre-avhengig måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
- Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
- Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
- Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
- De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
- Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
- Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67 (2005).
- Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
- Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).
