Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Betinget Genetisk transsynaptisk sporing i den embryoniske musehjerne

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52487

Introduction

Anatomisk sti sporing er en af de mest almindeligt anvendte værktøjer at dechifrere forholdet mellem hjernen og adfærd 1. Avancement i neurale kredsløb opsporing teknologier har skænket neuroforskere med muligheden for at spore neurale kredsløb af genetisk identificerede neuron populationer i mus 2. På trods af disse tekniske fremskridt er det stadig en udfordring at optrævle dannelsen af ​​neurale kredsløb, især i embryonale modning. Dette er fordi de fleste af sporing metoder udviklet til dato er baseret på stereotaktisk injektion af transsynaptisk sporstoffer eller genetisk modificerede neurotrofiske virus (figur 1) 2,3. Selv om disse teknikker opnå rumlig og tidsmæssig opløsning på tilslutningsmuligheder, adskillige iboende begrænsninger såsom teknisk udfordrende tracer injektioner i hjernens udvikling, reproducerbarhed injektionsstedet, potentiel inflammation på injektionsstedet og mest betydtantly cytotoksicitet skyldes neurotropiske virus begrænse deres brug 4.

En alternativ metode er at udtrykke de transsynaptisk sporstoffer som transgener i genetisk ændrede mus. Vi har for nylig ændret denne teknik og udviklet en binær genetisk transsynaptisk sporingssystem til at kortlægge de neurale kredsløb af nogen genetisk identificeret neuronpopulation 5. Vores eksperimentelle strategi er baseret på to nye knock-in musestammer, som udtrykker enten tovejs sporstof byg lectin (BL) 6 eller retrograd sporstof tetanustoxinfragment C fusioneret til GFP (GTT) 7 fra ROSA 26 locus efter Cre-medieret rekombination. Her brugte vi disse musestammer til selektivt at udtrykke BL og GTT i neuroner, der producerer kisspeptin, et neuropeptid, er impliceret i reguleringen modningen af reproduktive akse 8,9. Vi viser, at denne teknik er egnet til at visualisere udviklingen og modningen af ​​kyspeptin neurale kredsløb under fosterudviklingen af den kvindelige musehjerne 5.

Breeding strategi

Det R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) og R26-GFP-TTC (GTT) tracer linjer er knock-i stammer 5, som bærer rekombinante ROSA26 alleler. Den R26-BIZ og R26-GTT alleler er transkriptionelt tavst på grund af tilstedeværelsen af en stærk transkriptionel stopsignal, som er flankeret af to loxP-sites 5. Ekspression af BIZ og GTT transgen aktiveres af Cre-medieret fjernelse af den transkriptionelle stopsignal. De R26-BIZ og R26-GTT alleler kan anvendes uafhængigt ved blot passage med en Cre driver linje. Til analyse dyr heterozygote for de respektive Cre og R26 alleler kan anvendes. Kuldsøskende bærer en Cre eller en R26-allel, henholdsvis skal anvendes som kontroller. Alternativt er det også muligt at generere triple knock-dyr bærer Cre, R26-BIZ og R26-GTT alleler, men dette vil kræve en ekstra kryds.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Etik erklæring: procedurer, der involverer dyr forsøgspersoner blev godkendt af dyrevelfærd udvalg fra University of Hamburg og universitetet i Saarland.

1. Forberedelse og Fiksering af fostervæv

  1. Arranger alt det nødvendige udstyr til at dissekere ud embryonerne og forberede løsninger til efterfølgende fiksering af vævet før at ofre dyrene.
    BEMÆRK: altid udarbejde en frisk 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning (4% PFA i 0,1 M phosphatpufret saltvand (PBS), justere pH til 7,4).
  2. Aflive timet gravid hunmus med en etisk godkendt procedure.
  3. Overfør musen på en platform. Fugt den ventrale side af maven med 70% ethanol og gøre en lodret snit ved hjælp af en skarp saks for at blotlægge den abdominale kavitet.
  4. Identificer embryonale kæde og træk det forsigtigt ud ved stump pincet og placere den i iskold PBS.
  5. Fjern de enkelte embryoner fraden embryonale kæde med fin saks og pincet. Fjern ekstra væv omkring embryonerne og vaske dem i iskoldt PBS.
  6. Tag en lille hale biopsi (før overførsel embryoet i PFA) og inkuberes den i halen lysisbuffer for identifikation køn og sporstof allel genotypning PCR.
  7. Start fra embryonet på det mest laterale side og overføre hvert embryo separat i et rør indeholdende iskold 4% PFA på is på et rysteapparat.
  8. Soak embryoner i en alder af E13.5 eller yngre i 1,5 timer på is med konstant omrystning. Soak embryoner i en alder E14.5 og E15.5 i 2,5 timer på is med konstant omrystning.
  9. For embryoner alder E16.5 eller ældre, halshugge og fjern den ydre hud før iblødsætning hovedet i PFA-løsning. Lederne af E16.5 embryoer kan udblødt i 4,5 time på is med konstant omrystning.
  10. Efter passende fiksering vaskes embryoner tre gange med iskold PBS. Overfør embryoner i 30% saccharose i PBS-opløsning ved 4 ° C, indtil de synkertil bunden.

2. Indefrysning

  1. Arranger alle de nødvendige materialer, før du starter indefrysning processen: cryo-skimmel, cryo-handsker, fjerlette entomologi tang, tusch og optimal skæring temperatur sammensatte (OLT)
  2. Mærk kryo-formen med en permanent alkohol-resistent markør (nævne orientering af væv, dato og genotype). Forbered en slush af knust tøris og 100% ethanol i en ice bucket. Anbring et glas bæger inde indeholder isopentan. Vent i 10 minutter for isopentan at køle ned.
  3. I mellemtiden fjerne væv fra saccharoseopløsningen, tørre overskydende saccharose omkring vævet med laboratorie klude. Overfør vævet ind i en præ-mærket cryo-formen med tilstrækkelig oktober at dække vævet. Undgå luftbobler i oktober; især omkring vævet.
  4. Vend vævet i oktober ved hjælp fjervægtsklassen entomologi pincet for at undgå vævsskade. Begynd frysning ved at overføre kryo-mold i den præ-afkølet isopentan bad. Sprøjt ikke isopentan i OLT, da det ikke vil fryse ordentligt. Wrap prøverne i aluminiumfolie og opbevares ved -80 ° C.

3. Cryosectioning

  1. Skær 14 um tynde serielle sektioner i serie «af fem ved hjælp af en kryostat og samle på SuperFrost® Plus objektglas til immunofluorescens (IF) analyse. Opbevar slides ved -80 ° C indtil anvendt.

4. Tracer visualisering Brug af Tyramide Signal Amplification (TSA) Protokol

  1. Forbered buffere og reagenser, der kræves til farvning. Altid frisk forberede Tris-NaCl-Tween (TNT) buffer på dagen for brug.
    1. Forbered TNT buffer under anvendelse af 100 ml 1 M Tris-HCI, pH 7,5, 30 ml 5 M NaCl og ddH 2 O op til et endeligt volumen på 1 L. tilsættes 500 pi Tween 20 under anvendelse af en 1 ml pipette. Tilsæt Tween 20 langsomt og skylle pipetten op og ned flere gange for at sikre, at alle Tween 20 er iopløsning.
    2. Forbered Tris-NaCl-blokerende (TNB) buffer under anvendelse af 100 ml 1 M Tris-HCI, pH 7,5, 30 ml 5 M NaCl og ddH 2 O op til et endeligt volumen på 1 L. Tilsæt 5 g blokerende reagens (forsynet med kit) langsomt i små trin til bufferen under omrøring. Opvarm opløsningen gradvist til 55 ° C med kontinuerlig omrøring at opløse blokeringsreagens (dette bør ikke tage længere end 30-60 min). For at opnå homogen opvarmning anvende et vandbad ved 55 ° C. Løsningen vises mælkehvidt. Bring opløsningen til stuetemperatur før brug. Alikvot og opbevares ved -20 ° C i langtidsopbevaring.
    3. Opløs biotin tyramid reagens (leveres med sættet) i molekylær biologi / HPLC-grade DMSO. Afhængigt af hvilken kittet anvendes den passende mængde af DMSO kan variere. Opbevar stamopløsningen ved 4 ° C.
      BEMÆRK: Snit fra dyr heterozygote for de respektive Cre og R26 alleler kan anvendes til kredsløb analyse. Brug stninger fra samme kuld med kun én Cre eller en R26 allel henholdsvis som negative kontroller. Forkæl negative kontrolglas præcis som lysbilleder fra dobbelt heterozygote dyr. Desuden omfatter en kontrol dias fra en dobbelt heterozygot dyr, men udelade TSA reagens (uforstærkede kontrol).
  2. Ved hjælp af en skarp frisk skalpel fjerne overskydende oktober omgiver vævssnit og markere grænsen omkring afsnittene med en PAP pen.
  3. Tør slides til 2-3 minutter ved stuetemperatur (RT). Vask dias på RT 3x med TNT i 5 min hver. Glassene inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter i 0,3% H 2 O 2 opløsning i iskold methanol for at standse endogen peroxidaseaktivitet.
  4. Vask 3 x med PBS i 5 minutter hver ved stuetemperatur. Inkuber i 10 minutter i 0,5% Triton-X 100 i PBS i væv permeabilisering. Vask dias på RT 3x med TNT i 5 min hver.
  5. Block med TNB (blokerende opløsning, 200-300 gi pr slide) i 30min ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Kontroller, at alle sektioner er helt dækket af TNB. Lad ikke slides tørre ud mellem trinene.
  6. Hæld overskydende blokerende buffer, og anvende den primære antiserum anerkender sporstof (1: 1,000 ged anti-WGA for BL, 1: 15.000 af kanin-anti-GFP for GTT) fortyndet i TNB i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. Sørg for at bruge nok volumen til helt at dække vævssnittet (200-300 gi pr slide).
    BEMÆRK: De primære antisera fortyndinger anbefales her, kan justeres.
  7. Vask slides ved stuetemperatur 3x med TNT i 5 min hver med omrøring.
  8. Inkuber sektioner med biotinyleret sekundært antiserum genkender vært for første antiserum (1: 500 heste-anti-gede-IgG for anti-WGA, 1: 5.000 gede-anti-kanin-IgG for anti-GFP i TNB i 1 time ved stuetemperatur).
  9. Wash 3x med TNT ved stuetemperatur i 5 min hver med omrøring. Inkuber i 1: 100 streptavidin (SA) -konjugeret peberrodsperoxidase (SA-HRP, forudsat with kit) i TNB i 30 minutter ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Vask dias på RT 3x med TNT i 5 min hver. I mellemtiden tø TSA.
  10. Fortynd TSA 1:50 i TSA forstærkning fortynder (leveres med sættet, brug TSA kit til visualisering af BL og TSA + kit til GTT). Inkubér vævssnit i fortyndet TSA netop 10 minutter ved stuetemperatur. Fortynd TSA lige inden brug, helst i den foregående vaskningstrin, ikke bruger nogen resterende fortyndede TSA reagens til fremtidige eksperimenter; altid forberede frisk.
  11. Vask slides ved stuetemperatur 3x med TNT i 5 min hver med omrøring. Inkuberes med 1: 500 Alexa Fluor® 546 streptavidin konjugat i TNB i 30 minutter ved stuetemperatur. Vask slides ved stuetemperatur 3x med TNT i 5 min hver med omrøring.
  12. Inkuber i 10 minutter i 5% bisbenzimid opløsning i PBS ved stuetemperatur for nuklear farvning. Vask slides ved stuetemperatur 3x med TNT i 5 min hver med omrøring. Monter med Fluromount G og udføre epifluorescens eller konfokal mikroskopi.
    ROSA26 locus i de producerende celler (bestemt ved Cre driver linje anvendes) og den neurale kredsløb analyseres (fx antal neuroner producerer sporstof, konvergens etc.). Derfor de primære antisera fortyndinger anbefales her måske skal justeres for at forhindre lav eller overskydende signal. Baggrund skal altid analyseres ved hjælp af passende kontrolforanstaltninger dias (se ovenfor).

5. τlacZ farvning for Embryonale Sektioner

  1. Forbered buffere og reagenser, der kræves til farvning. Altid frisk forberede LacZ buffer C før brug.
    1. Forbered 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) stamopløsning (40 mg / ml) ved tilsætning af 40 g af X-gal til 1 ml 70% dimethylformamid (DMF). Dæk med aluminiumfolie og opbevares ved -20 ° C til langtidsopbevaring.
    2. Forbered nitro blå tetrazolium (NBT) stOck opløsning (50 mg / ml) ved tilsætning af 50 g af NBT til 1 ml 70% DMF. Dæk med aluminiumfolie og opbevares ved -20 ° C til langtidsopbevaring.
    3. Forbered LacZ fiksativ anvendelse af 80 pi af 25% glutaraldehyd, 5 ml 4% PFA 20 pi 1 M MgCl2, 100 pi 500 mM EGTA, 1 ml 1 M phosphatpuffer pH 7,4 og ddH 2 O op til en endelig volumen på 10 ml.
    4. Forbered LacZ puffer A under anvendelse af 1 ml 1 M MgCl2, 5 ml 500 mM EGTA, 50 ml 1 M phosphatpuffer pH 7,4 og ddH 2 O op til et endeligt volumen på 500 ml.
    5. Forbered LacZ puffer B under anvendelse af 1 ml 1 M MgCl2, 5 ml 500 mM EGTA, 5 ml 1% natriumdeoxycholat, 100 ml 10% NP-40, 50 ml 1 M phosphatpuffer pH 7,4 og ddH 2 O op til et endeligt volumen på 500 ml.
    6. Forbered LacZ buffer C ved tilsætning af 10 pi NBT stamopløsning og 12,5 pi X-gal stamopløsning til 1 ml LacZ buffer B. gøre frisk lige før brug og dæk med alufolie.
    7. Tør dias ved stuetemperatur i det mindste for 10-15 min (i mellemtiden forberede dias med et PAP pen).
    8. Fastgør sektion med LacZ fiksativ i 2 minutter ved stuetemperatur i et fugtigt kammer i en kemisk røg-hætte. Vask 3 gange med PBS suppleret med 2 mM MgCI2.
    9. Skyl dias med LacZ buffer A. Vask dias med LacZ buffer A 3 gange i 10 minutter hver ved stuetemperatur. Vask 2 gange med LacZ buffer B i 5 minutter hver. Glassene inkuberes i LacZ buffer C ved 30-37 ° C i 6 timer eller natten over i et fugtigt kammer.
      BEMÆRK: Læg tilstrækkeligt volumen af ​​LacZ buffer C; slides bør ikke tørre ud under inkubation.
    10. Efter passende inkubation vaskes objektglassene med PBS suppleret med 2 mM MgCI2. Skyl sektioner kortvarigt med Hedeselskabet 2 O. Dækglasset med Mayers glycin gelatine. Velegnet til en lysmikroskop udstyret med en kontrast differential interferens (DIC) imaging opsætning.

    6. GendER og Tracer Genotypebestemmelse

    1. Forbered hale lysepuffer anvendelse af 1 ml 1 M Tris-HCI, pH 8,5, 100 pi 500 mM EGTA, 200 pi 10% SDS, 400 pi af 5 M NaCl og ddH 2 O for at frembringe et endeligt volumen på 10 ml.
    2. Der tilsættes 500 pi hale lyseringsbuffer til hver Eppendorf-rør indeholdende en hale biopsi. Tilføj proteinase K til en slutkoncentration på 100 mg / ml. Inkuber natten over på et rysteapparat ved 55 ° C.
    3. Centrifugér prøver ved 17.000 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten overføres til et nyt centrifugerør. Der tilsættes 500 pi isopropanol til supernatanten. Bland i mindst 5 minutter ved at vende rørene op og ned.
    4. Spin i centrifuge ved 17.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Hæld supernatanten. Tilsæt 200 pi 70% ethanol. Ryst i mindst 5 min.
    5. Centrifuger ved 17.000 xg i 5 min. Fjern supernatanten med en Pipetman (ikke hæld). Tør pellet i en varm kammer (37 ° C) i 15-30 min.
    6. Resuspender pellet i 100 pilav TE pH 8,0 eller vand ved hjælp af wide-boring filtrerede tips. Sæt 55 ° C i 1 time og ved 37 ° C natten over for korrekt opløsning. Opbevares ved 4 ° C.
    7. Brug 1 pi DNA til PCR-reaktionen (50 pi reaktionsblanding indeholdende 1 pi af hale-DNA, 2.5 pi DMSO, 10 pM hver primer, 25 pM af hver dNTP, og 1M betain). PCR primere til genotypebestemmelse og køn identifikation er angivet i Materials tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette afsnit viser repræsentative resultater, der kan opnås arbejde med R26-BIZ (B L- I RES-τlac Z) og R26-GTT (G RP TT C) alleler. Her bruger vi R26-BIZ og R26-GTT alleler at analysere modningen af de neurale kredsløb, der regulerer den reproduktive akse. Reproduktion hos hvirveldyr styres centralt af en lille delmængde af neuroner i hypothalamus, som udskiller gonadotropin-frigivende hormon (GnRH). Kisspeptin, en potent aktivator af GnRH-neuroner, er blevet impliceret i reguleringen af aktiviteten af GnRH-neuroner, men når de neurale kredsløb mellem GnRH og kisspeptin neuroner er etableret i udviklingslandene hunmus hjerne var ikke kendt 5. Først viser vi, at ekspression af biz og GTT transgener specifikt aktiveres af Cre-afhængig rekombination i embryonalekisspeptin neuroner i den bueformede nucleus (ARC) (figur 2) ved hjælp af en kisspeptin-specifik Cre driver linje 10. Vi derefter vise, at kisspeptin neuroner i ARC allerede kommunikerer med en specifik delmængde af GnRH-neuroner i livmoderen (Figur 3A, B). Viser vi desuden, at ARC kisspeptin neuroner er opstrøms for GnRH-neuroner (figur 3A, C). Tilsammen vores resultater viser, at de neurale kredsløb mellem kisspeptin og GnRH neuroner er fuldt etableret og operativ i hunmus hjernen før fødslen.

Figur 1
Figur 1:. Transsynaptisk overførsel af sporstoffer under anvendelse af konventionelle eller genetiske metoder I den konventionelle fremgangsmåde, er en transsynaptisk sporstof taget op af alle neuroner på injektionsstedet dermed potentielt mærkning uspecifikke uafhængige veje. Iden genetiske metode, er sporstoffet selektivt udtrykt af genetisk definerede neuroner således specifikt visualisere neuroner forbundet til tracer-udtrykkende celler. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Trofast aktivering af BIZ og GTT transgen i embryoniske ARC kisspeptin neuroner. (A) Avlsstrategi at aktivere BIZ og GTT udtryk i kisspeptin neuroner. Vi opdrættet R26-BIZ og R26-GTT mus med kisspeptin-IRES-Cre (KissIC) mus 10, hvor Cre-rekombinase udtrykkes under kontrol af kiss1 promotoren. (CE) β-gal enzymatisk aktivitet identificerer tracer-producerende celler og er begrænset til ARC i hjernen hos en kvindelig KissIC / R26-BIZ embryo på embryonisk dag (E) 18.5. (FG) Dobbelt immunfluorescens for kisspeptin (grøn) og BL (rød) (F) eller GTT (rød) (G) viser trofast aktivering af BL eller GTT ekspression af Cre-medieret rekombination i kisspeptin neuroner i KissIC / R26-BIZ eller KissIC / R26-GTT kvindelig museembryoer hhv. Scale stænger (C) 500 um, (D) 200 um, (F, G) 50 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3: GnRH neuroner synaptisk forbundet til og nedstrøms for kisspeptin neuroner. (A) Combinatorial genetisk tovejs transsynaptisk sporing. Mens τlaCZ begrænset til Cre-udtrykkende kisspeptin neuroner, er BL transsynaptically overføres til opstrøms (præsynaptiske) og nedstrøms (postsynaptiske) neuroner i KissIC / R26-BIZ mus. I modsætning hertil er GFP-TTC transsynaptically overført til præsynaptiske, men ikke postsynaptiske neuroner i KissIC / R26-GTT mus. Postsynaptiske neuroner har τlacZ positive Axon fibre i deres umiddelbare nærhed (B, C) ​​Dobbelt immunfluorescens for BL (rød, B). Eller GTT (rød; C) og GnRH (grøn) på et sagittalt snit gennem hele hovedet af en kvindelig KissIC / R26-BIZ eller KissIC / R26-GTT foster ved E18.5. (B) Bemærk, at nogle, men ikke alle GnRH neuroner indeholder BL. Disse data viser, at en delmængde af embryonale GnRH neuroner synaptisk er forbundet til ARC kisspeptin neuroner. (C) Bemærk, at ingen af de GnRH-neuroner indeholder GTT. Eksklusiv transsynaptisk overførsel af BL, men ikke GTT til GnRH neuroner viser, at GnRH neuronerer nedstrøms for kisspeptin neuroner. Scale stænger (B, C) ​​50 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Egenskaber Transsynaptisk sporstoffer Neurotropisk vira
Anvendelsesmåde Udtrykt som en transgen Mekanisk injiceres
Retning for spredning Anterograd, retrograd & tovejs Retrograd & anterograd
Synaptic effekt Multisynaptiske Multisynaptiske eller monosynaptiske (retrograd kun)
Signalstyrke Svag, falder ved hver synapse Stærk, signal forstærkning ved hver synapse
Immunrespons Ingen; udtrykt som endogent protein Stærkt immunrespons, dødelig
Rumlig og tidsmæssig opløsning Afhænger promotor af valg Meget selektiv på grund af mekaniske injektioner på de enkelte lokaliteter

Tabel 1: Sammenligning af funktioner i genetiske transsynaptisk sporstoffer og genetisk modificerede neurotropiske virus

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udtrykke transsynaptisk sporstoffer som transgener at spore neurale kredsløb af genetisk definerede neuronale populationer har flere fordele i forhold til stereotaktisk injektion af røbestoffer eller neurotopic virus. Først sporstof fremstillet som et endogent protein, og derfor ikke fremkalde nogen immunrespons og en selektiv neural pathway kan analyseres i forskellige dyr med høj reproducerbarhed. For det andet, fordi det er en ikke-invasiv metode, den kan anvendes til at spore kredsløb fra neuroner ikke er let tilgængelige for stereotaksiske injektioner, for eksempel i livmoderen. Begrænsninger omfatter en generelt lav effektivitet i transsynaptisk overførsel, hvilket kan resultere i problemer med at påvise sporstof. Desuden bliver sporstoffet molekylet fortyndet ved hver synapse. I modsætning hertil neurotrofiske virus replikere og viral replikation igen derefter fører til signalforstærkning efter passage synapsen. Imidlertid viral replikation er også en stor limitation af anvendelsen af ​​neurotrofiske vira på grund af iboende viral cytotoksicitet. Nogle af genetiske transsynaptisk sporstoffer og genetisk modificerede neurotrofiske virus funktioner er sammenlignet i tabel 1.

De R26-BIZ og R26-GTT alleler supplerer hinanden og lette visualiseringen af de neurale kredsløb af en genetisk identificeret neuronal population på Cre-medieret rekombination. R 26-promotoren er velkarakteriseret og medierer allestedsnærværende ekspression med beskeden styrke 11,12. Brug meget følsomme metoder til tracer detektering såsom tyramid signalamplifikationssystem (TSA) tillader identifikation af selv små mængder af tracer molekyler overført tværs synapser. En anden stor fordel ved at anvende R26 promotoren til at drive sporstof udtryk er, at de udtrykker neuroner kontinuerligt syntetisere sporstoffer i hele deres levetid. Dette gør det muligt at analysere kredsløb modningi længere tidsperioder 5. I modsætning hertil er dette ikke muligt ved brug af neurotrofiske vira på grund af deres cytotoksicitet. Vigtigt er det, vores binære genetiske system, og brugen af R26 promotoren afkobler tracer produktion fra potentielt stærkt regulerede endogene promotorer kørsel Cre-ekspression (i dette tilfælde, det kiss1 promotor), som kan reguleres af en række genetiske og epigenetiske faktorer 13. Derfor transsynaptisk overførsel af BL og GTT afspejler faktiske synaptisk kommunikation mellem to neuronale populationer.

Cre-medieret rekombination er en irreversibel begivenhed og derfor det konverterer udviklingsmæssigt forbigående genekspression i stabil transgen ekspression. Anvendelsen af en inducerbar Cre systemet 14 kan potentielt afsløre en udviklingsmæssig effekt på grund af forbigående Cre-ekspression.

Som konklusion kan de to nye R26-BIZ og R26-GTT musestammer bruges til at analysere lokale og long range neurale kredsløb, der kan være sammensat af forskellige klasser og typer af neuroner, der hidrører fra en hvilken som helst område af hjernen eller fra rygmarven i et Cre-afhængig måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) Sigma 14530-100MG
Ethanol Sigma 32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way) Polyscience Inc. 18646A-1 22 x 22 x 20mm
DMSO Sigma D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF) VWR Chemicals 23470,293
EGTA ROTH 3054.3
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glutaraldehyde Sigma G5882-50ML
Hydrogen peroxide Sigma 34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane) Sigma M32631-2.5L
Kaiser's glycine gelatin Merck 1092420100
Methanol Sigma 494437-1L
MgCl2 Sigma M2670-100G
NaCl ROTH HN00.2
NBT Sigma 298-83-9
Nonidet P40 substitute Fluka 743.85
OCT Leica 14020108926
PAP pen Dako S2002
Parafarmaldehyde Sigma P6148-1KG
Sodium deoxycholate Sigma D6750-25G
Sucrose Sigma S7903-1KG
Superfrost slides Thermo Scientific FT4981GLPLUS
TSA kit PerkinElmer NEL700
TSA plus kit PerkinElmer NEL749A001KT
Tris ROTH AE15.2
Triton-X 100 ROTH 3051.2
Tween 20 ROTH 9127.1
X-gal ROTH 2315.1
Cryostat Leica na
Light microscope equipped with DIC imaging Zeiss Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope Zeiss Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop Adobe PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL) Vector Laboatories AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG Vector Laboatories BA-9500
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboatories BA-1000
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) Invitrogen A11122
Rabbit anti-GnRH Affinity Bio Reagent PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG Thermo Scientific SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546 Life Technologies S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping) Eurofins MWG Operon ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (for BIZ genotyping) Eurofins MWG Operon AGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (for Cre genotyping) Eurofins MWG Operon GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (for Cre genotyping) Eurofins MWG Operon CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (for GTT genotyping) Eurofins MWG Operon AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (for GTT genotyping) Eurofins MWG Operon GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (for gender genotyping) Eurofins MWG Operon TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (for gender genotyping) Eurofins MWG Operon CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd Eurofins MWG Operon CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev Eurofins MWG Operon GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev Eurofins MWG Operon CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
  2. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  3. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  4. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
  5. Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
  6. Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
  7. Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
  8. De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
  9. Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
  10. Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
  11. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
  12. Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67 (2005).
  13. Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
  14. Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).

Tags

Neuroscience Neuroscience udviklingsmæssige biologi neurale kredsløb transsynaptisk opsporing byg lectin tetanustoxinfragment C mus embryo genmålretning, kisspeptin GnRH reproduktion
Betinget Genetisk transsynaptisk sporing i den embryoniske musehjerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, D., Boehm, U. ConditionalMore

Kumar, D., Boehm, U. Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain. J. Vis. Exp. (94), e52487, doi:10.3791/52487 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter