Introduction
Anatomische pad tracing is een van de meest gebruikte middelen om de relatie tussen hersenen en gedrag 1 ontcijferen. Vooruitgang in de neurale circuit tracing technologieën heeft neurowetenschappers geschonken met de mogelijkheid om neurale circuits sporen van genetisch geïdentificeerd neuron bevolking in muizen 2. Ondanks deze technische vooruitgang blijft een uitdaging om de vorming van neurale circuits ontrafelen vooral tijdens embryonale ontwikkeling. Dit is omdat de meeste van de tracering worden ontwikkeld tijd berusten op stereotaxische injectie van transsynaptische tracers of genetisch gemodificeerde neurotrope virussen (figuur 1) 2,3. Hoewel deze technieken te bereiken ruimtelijke en temporele resolutie van connectiviteit, een aantal inherente beperkingen, zoals technisch uitdagende tracer injecties in de ontwikkeling van de hersenen, de reproduceerbaarheid van de plaats van injectie, potentiële ontsteking op de injectieplaats en de meeste belang-tantly cytotoxiciteit veroorzaakt door neurotrope virussen beperken hun gebruik 4.
Een alternatieve methode is het transsynaptische tracers als transgenen in genetisch gemanipuleerde muizen tot expressie. We hebben recent gewijzigde deze techniek en ontwikkelde een binaire genetische transsynaptische tracing systeem om de neurale circuits van elk genetisch geïdentificeerd neuronale populatie 5 in kaart. Onze experimentele strategie is gebaseerd op twee nieuwe knock-in muizen stammen, die ofwel de bidirectionele merker gerst lectine (BL) 6 of retrograde tracer tetanustoxinefragment C gefuseerd aan GFP (GTT) 7 van de ROSA 26 locus kenbaar na Cre gemedieerde recombinatie. Hier gebruiken we deze muis stammen om selectief te uiten BL en GTT in neuronen die kisspeptin produceren, een neuropeptide dat betrokken is bij het reguleren van de rijping van de reproductieve as 8,9. We tonen aan dat deze techniek geschikt is voor de ontwikkeling en rijping van kiss visualiserenpeptin neurale circuits tijdens de embryonale ontwikkeling van de vrouwelijke hersenen van muizen 5.
Kweekstrategie
De R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) en de R26-GFP-TTC (GTT) tracer lijnen zijn knock-in stammen 5 dat recombinant ROSA26 allelen dragen. De R26-BIZ en R26-GTT allelen transcriptioneel stil door de aanwezigheid van een sterk transcriptie stopsignaal, die wordt geflankeerd door twee loxP plaatsen 5. Expressie van de BIZ en GTT transgen wordt geactiveerd door Cre gemedieerde verwijdering van de transcriptie stopsignaal. De R26-BIZ en R26-GTT allelen kunnen onafhankelijk door simpelweg kruising met een Cre bestuurder lijn worden gebruikt. Voor analyse dieren heterozygoot voor de respectievelijke Cre en R26 allelen kunnen worden gebruikt. Nestgenoten die één Cre of een allel R26, respectievelijk, worden gebruikt als controles. Als alternatief is het ook mogelijk om t genererenriple knock-in dieren die het Cre, R26-BIZ en R26-GTT allelen, maar dit zal een extra kruis nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Ethiek Verklaring: Procedures met dierlijke proefpersonen werden goedgekeurd door het dierenwelzijn commissie van de Universiteit van Hamburg en de Universiteit van Saarland.
1. Voorbereiding en Fixatie van embryonaal weefsel
- Schik alle apparatuur die nodig is om te ontleden uit de embryo's en oplossingen voor de daaropvolgende fixatie van het weefsel te bereiden voor het opofferen van de dieren.
OPMERKING: bereid altijd vers 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing (4% PFA in 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH op 7,4). - Euthanaseren getimede zwangere vrouwelijke muis met een ethisch goedgekeurde procedure.
- Overdracht van de muis op een platform. Bevochtig de ventrale zijde van de buik met 70% ethanol en maak een verticale incisie met behulp van een scherpe schaar om de buikholte bloot te leggen.
- Identificeer de embryonale ketting en trek het voorzichtig uit het gebruik van stompe pincet en plaats deze in ijskoude PBS.
- Verwijder de individuele embryo's uitde embryonale ketting met behulp van fijne schaar en pincet. Verwijder extra weefsel rond de embryo's en was ze in ijskoud PBS.
- Neem een kleine staart biopsie (vóór de overdracht van de embryo in PFA) en incubeer het in de staart lysebuffer voor de identificatie geslacht en tracer allel genotypering PCR.
- Begin van het embryo in de meest laterale zijde en breng elke embryo afzonderlijk in een buis met daarin ijskoude 4% PFA op ijs op een shaker.
- Geniet het embryo op leeftijd E13.5 of jonger 1,5 uur op ijs met constant schudden. Week de embryo's op de leeftijd van E14.5 en E15.5 voor 2,5 uur op ijs met constante schudden.
- Voor embryo leeftijd E16.5 of ouder, onthoofden en verwijder de buitenste huid voor het weken de kop in PFA-oplossing. Hoofden van E16.5 embryo's kunnen worden geweekt voor 4,5 uur op ijs met constante schudden.
- Na geschikte fixatie, was het embryo drie maal met ijskoude PBS. Breng de embryo's in 30% sucrose in PBS oplossing bij 4 ° C totdat ze zinkennaar de bodem.
2. Bevriezing
- Schik alle vereiste voordat het invriezen materialen: cryo-schimmel, cryo-handschoenen, vedergewicht entomologie tang, viltstift en optimale snijtemperatuur verbinding (oktober)
- Label de cryo-vorm met een permanente alcohol-resistente marker (vermelden van de oriëntatie van het weefsel, datum en genotype). Bereid een slush van gemalen droog ijs en 100% ethanol in een ijsemmer. Plaats een glazen beker van binnen met isopentaan. Wacht 10 minuten voor de isopentaan afkoelen.
- Ondertussen verwijder het weefsel van de sucrose oplossing, veeg het overtollige sucrose rond het weefsel met behulp van laboratorium doekjes. Breng het weefsel in een gelabelde cryo-vorm met voldoende oktober het weefsel bedekken. Vermijd eventuele luchtbellen in de LGO; vooral rond het weefsel.
- Oriënteren het weefsel in oktober met behulp vedergewicht entomologie tang om weefselschade te voorkomen. Begin bevriezen door de overdracht van de cryo-mold in de pre-gekoelde isopentaan bad. Niet spetteren isopentaan in het LGO want het zal niet goed bevriezen. Wikkel de monsters in aluminiumfolie en bewaar bij -80 ° C.
3. cryosectioning
- Snijd 14 micrometer dunne seriecoupes in serie 'van vijf met behulp van een cryostaat en verzamelen over SuperFrost® Plus glasplaatjes voor immunofluorescentie (IF) analyse. Bewaar de slides bij -80 ° C tot gebruikt.
4. Tracer visualisatie Met de Tyramide signaalversterking (TSA) Protocol
- Bereid de buffers en reagentia nodig voor kleuring. Altijd vers bereiden Tris-NaCl-Tween (TNT) buffer op de dag van gebruik.
- Bereid TNT buffer met 100 ml van 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml van 5 M NaCl en DDH 2 O tot een eindvolume van 1 L. Voeg 500 ul Tween 20 met een pipet 1 ml. Voeg Tween 20 langzaam en spoel de pipet op en neer herhaaldelijk dat alle Tween 20 inoplossing.
- Bereid Tris-NaCl-Blocking (TNB) buffer met 100 ml van 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml van 5 M NaCl en DDH 2 O tot een eindvolume van 1 L. toevoegen 5 g Blocking Reagent (bij de kit) langzaam geleidelijk bij om de buffer onder roeren. Verwarm de oplossing langzaam tot 55 ° C onder voortdurend roeren tot volledig op te lossen Blocking Reagent (dit mag niet langer dan 30-60 min). Om dit te bereiken homogene verwarming gebruik maken van een waterbad bij 55 ° C. De oplossing zal verschijnen melkachtig. Breng de oplossing op kamertemperatuur voor gebruik. Aliquot en bewaar bij -20 ° C voor langdurige opslag.
- Reconstitueren biotine tyramide reagens (geleverd bij de kit) in Molecular Biology / HPLC-kwaliteit DMSO. Afhankelijk van welke kit wordt gebruikt de juiste hoeveelheid DMSO kan variëren. Bewaar de voorraad oplossing bij 4 ° C.
Opmerking secties van dieren die heterozygoot zijn voor de respectievelijke Cre en R26 allelen kan worden gebruikt voor circuit analyse. Gebruik sbespiegelingen van nestgenoten die één Cre of één R26 allel, respectievelijk als negatieve controles. Behandel negatieve controle dia's precies zoals dia's van dubbel heterozygote dieren. Daarnaast bestaan uit één dia uit een dubbel heterozygote dieren, maar laat de TSA reagens (onversterkte controle).
- Met behulp van een scherpe verse scalpel verwijderen overtollige oktober rond het weefsel secties en markeer de grens rond de secties met een PAP pen.
- Droog de objectglaasjes gedurende 2-3 min bij kamertemperatuur (RT). Was de dia's bij RT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk. Incubeer de glaasjes bij RT gedurende 30 min in 0,3% H 2 O 2 oplossing ijskoude methanol om endogene peroxidase activiteit te blussen.
- Was 3x met PBS gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur. Incubeer gedurende 10 minuten in 0,5% Triton X-100 in PBS voor tissue permeabilisatie. Was de dia's bij RT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk.
- Blok met TNB (blokkeeroplossing, 200-300 ul per dia) voor 30min bij RT in een vochtige kamer. Zorg ervoor dat alle onderdelen zijn volledig bedekt door TNB. Laat niet de dia's uitdrogen tussen de stappen.
- Giet overtollige blokkeerbuffer en het primaire antiserum herkennen van de tracer toepassen (1: 1,000 geit anti-WGA BL, 1: 15,000 konijn anti-GFP voor GTT) verdund in TNB 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Zorg ervoor dat u voldoende volume te gebruiken om volledig te bedekken de sectie weefsel (200-300 ul per dia).
OPMERKING: De primaire antisera verdunningen hier aangeraden eventueel moeten worden aangepast. - Was de dia's bij KT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk met roeren.
- Incubeer de secties met gebiotinyleerde secundaire antiserum herkennen de gastheer van de eerste antiserum (1: 500 paard anti-geit IgG anti-WGA, 1: 5000 geit anti-konijn IgG van anti-GFP in TNB gedurende 1 uur bij RT).
- Was 3x met TNT bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten elk met roeren. Incubeer in 1: 100 streptavidine (SA) geconjugeerd mierikswortelperoxidase (SA-HRP, mits with de kit) in TNB gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Was de dia's bij RT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk. Ondertussen ontdooien de TSA.
- Verdun 1:50 in TSA TSA amplificatie oplosmiddel (bij de kit, gebruik TSA kit voor de visualisatie van BL en de TSA + kit voor GTT). Incubeer het weefsel secties in verdunde TSA voor precies 10 min bij kamertemperatuur. Verdunnen TSA vlak voor gebruik, ideaal tijdens de vorige wasstap, hoeft de resterende verdund TSA reagens voor toekomstige experimenten niet te gebruiken; altijd vers bereid.
- Was de dia's bij KT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk met roeren. Incubeer met 1: 500 Alexa Fluor® 546 streptavidine conjugaat in TNB gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de dia's bij KT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk met roeren.
- Incubeer gedurende 10 min in 5% bisbenzimide oplossing in PBS bij kamertemperatuur nucleaire kleuring. Was de dia's bij KT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk met roeren. Monteer met Fluromount G en epifluorescentie of confocale microscopie.
5. τlacZ kleuring voor Embryonale secties
- Bereid de buffers en reagentia nodig voor kleuring. Altijd vers bereiden de LacZ- buffer C voor gebruik.
- Bereid 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) voorraadoplossing (40 mg / ml) door toevoeging van 40 g van X-gal aan 1 ml 70% dimethylformamide (DMF). Dek af met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C voor langdurige opslag.
- Bereid nitroblauwtetrazolium (NBT) stock oplossing (50 mg / ml) door toevoeging van 50 g NBT tot 1 ml 70% DMF. Dek af met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C voor langdurige opslag.
- Bereid LacZ fixeermiddel met 80 pl 25% glutaaraldehyde, 5 ml 4% PFA, 20 pl 1 M MgCl2, 100 ul 500 mM EGTA, 1 ml 1 M fosfaatbuffer pH 7,4 en DDH 2 O tot een uiteindelijke volume van 10 ml.
- Bereid LacZ buffer A met 1 ml 1 M MgCl2, 5 ml 500 mM EGTA, 50 ml 1 M fosfaatbuffer pH 7,4 en DDH 2 O tot een eindvolume van 500 ml.
- Bereid LacZ buffer B met 1 ml 1 M MgCl2, 5 ml 500 mM EGTA, 5 ml 1% natriumdeoxycholaat, 100 ml van 10% NP-40, 50 ml 1 M fosfaatbuffer pH 7,4 en DDH 2 O tot een eindvolume van 500 ml.
- Bereid LacZ- buffer C door het toevoegen van 10 ul van NBT stockoplossing en 12,5 ul van X-gal stockoplossing aan 1 ml LacZ- buffer B. Maak verse vlak voor gebruik en dek af met aluminiumfolie.
- Droog de glaasjes bij RT in ieder geval voor 10-15 min (ondertussen de dia's met een PAP pen te bereiden).
- Bevestig de sectie LacZ fixeermiddel gedurende 2 min bij kamertemperatuur in een vochtige kamer in een chemische damp-kap. Was 3 maal met PBS aangevuld met 2 mM MgCl2.
- Spoel de objectglaasjes LacZ buffer A. Was de dia's met LacZ buffer A 3 maal gedurende 10 min elk bij kamertemperatuur. Was 2 maal met LacZ buffer B gedurende 5 minuten elk. Incubeer de glaasjes in LacZ buffer C bij 30-37 ° C gedurende 6 uur of overnacht in een vochtige kamer.
OPMERKING: Voeg voldoende volume van LacZ- buffer C; dia's mag niet uitdrogen tijdens de incubatie. - Na geschikte incubatie Was de dia's met PBS aangevuld met 2 mM MgCl2. Spoel secties kort met DDH 2 O. Dekglaasje met Mayer's glycine gelatine. Geschikt voor een lichtmicroscoop uitgerust met een differentieel interferentie contrast (DIC) beeldvorming set-up.
6. GendER en Tracer Genotyping
- Bereid staart lysis buffer met 1 ml van 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 ul 500 mM EGTA, 200 pl 10% SDS, 400 pl van 5 M NaCl en DDH 2 O om een eindvolume van 10 ml.
- Voeg 500 ul van de staart lysebuffer aan elke Eppendorf buis met een staart biopsie. Voeg proteinase K tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg / ml. Incubeer overnacht op een schudder bij 55 ° C.
- Centrifugeer de monsters bij 17.000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Breng het supernatant naar een nieuwe centrifugebuis. Voeg 500 ul isopropanol aan het supernatant. Meng gedurende ten minste 5 minuten door het omkeren van de buizen op en neer.
- Spin in centrifuge bij 17.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet het supernatant. Voeg 200 ui 70% ethanol. Schud gedurende tenminste 5 min.
- Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant met een Pipetman (niet afgieten). Droog de pellet in een warme kamer (37 ° C) gedurende 15-30 min.
- Resuspendeer pellet in 100 plvan lage TE pH 8,0 of water met behulp van wide-bore gefilterd tips. Installeer 55 ° C gedurende 1 uur en bij 37 ° C gedurende de nacht voor een goede oplossen. Bewaar bij 4 ° C.
- Met 1 pl DNA voor PCR-reactie (50 ui reactiemengsel dat 1 pl staart DNA, 2,5 pl DMSO, 10:00 van elke primer, 25 uM van elk dNTP, 1 M en betaïne). PCR-primers voor genotypering en gender identificatie zijn vermeld in de tabel Materials.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie toont representatieve resultaten die kunnen worden verkregen werken met de R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) en de R26-GTT (G FP TT C) allelen. Hier gebruiken we de R26-BIZ en de R26-GTT allelen op de rijping van de neurale circuits reguleren van de reproductieve as analyseren. Reproductie in gewervelde dieren wordt centraal geregeld door een kleine subset van neuronen in de hypothalamus, die gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH) afscheiden. Kisspeptin, een potente activator van GnRH neuronen, is betrokken bij het reguleren van de activiteit van de GnRH neuronen, maar toen de neurale circuits tussen GnRH en kisspeptin neuronen gevestigd zijn in het ontwikkelen van vrouwelijke muizenhersenen niet bekend 5. Eerst laten we zien dat expressie van de transgenen BIZ en GTT specifiek door Cre-afhankelijke recombinatie in embryonale geactiveerdkisspeptin neuronen in de boogvormige nucleus (ARC) (figuur 2) met een kisspeptin specifieke Cre driver lijn 10. Vervolgens hebben we aangetoond dat kisspeptin neuronen in de ARC al communiceren met een specifieke subgroep van GnRH neuronen in utero (figuur 3A, B). Vervolgens wordt aangetoond dat ARC kisspeptin neuronen vóór GnRH neuronen (Figuur 3A, C). Genomen samen onze bevindingen blijkt dat de neurale circuits tussen kisspeptin en GnRH neuronen volledig zijn gevestigd en werkzaam in de vrouwelijke hersenen van muizen voor de geboorte.
Figuur 1:. Transsynaptische overdracht van tracers gebruik van conventionele of genetische technieken In de conventionele benadering, wordt een transsynaptische tracer opgenomen door de neuronen op de injectieplaats dus potentieel etiketteren aspecifieke onafhankelijke routes. Inde genetische benadering, wordt de tracer selectief uitgedrukt door genetisch bepaalde neuronen dus specifiek visualiseren neuronen verbonden met de tracer tot expressie brengen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Trouw activering van de BIZ en GTT transgen in embryonale ARC kisspeptin neuronen. (A) Fokstrategie om BIZ en GTT meningsuiting in kisspeptin neuronen activeren. We gefokt R26-BIZ en R26 GTT-muizen met kisspeptin-IRES-Cre (KissIC) muizen 10, waarbij Cre-recombinase tot expressie wordt gebracht onder de controle van de Kiss1 promoter. (CE) β-gal enzymatische activiteit worden de tracer producerende cellen en is beperkt tot de ARC in de hersenen van een vrouwelijke KissIC / R26-BIZ embryo in embryonale dag (E) 18.5. (FG) Dubbele immunofluorescentie voor kisspeptin (groen) en BL (rood) (F) of GTT (rood) (G) toont trouwe activering van BL of GTT expressie door Cre-gemedieerde recombinatie in kisspeptin neuronen in KissIC / R26-BIZ of KissIC / R26-GTT vrouwelijke muis embryo's, respectievelijk. Schaalbalken (C) 500 micrometer, (D) 200 micrometer, (F, G) van 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: GnRH neuronen synaptisch verbonden en stroomafwaarts van kisspeptin neuronen. (A) Combinatorische genetische bidirectionele transsynaptische tracing. Terwijl τlacZ is beperkt tot het Cre-uiting kisspeptin neuronen, is BL transsynaptically overgebracht naar upstream (presynaptische) en downstream (postsynaptische) neuronen in KissIC / R26-BIZ muizen. Daarentegen wordt GFP-TTC transsynaptically overgedragen aan presynaptische, maar niet postsynaptische neuronen in KissIC / R26 GTT-muizen. Postsynaptische neuronen τlacZ positieve axon vezels in hun nabijheid (B, C) Dubbele immunofluorescentie BL (red; B). Of GTT (rood, C) en GnRH (groen) op een sagittale doorsnede door de gehele kop van een vrouwelijke KissIC / R26-BIZ of KissIC / R26-GTT embryo in E18.5. (B) Merk op dat sommige, maar niet alle GnRH neuronen bevatten BL. Deze gegevens tonen dat een subset van embryonale GnRH neuronen synaptisch verbonden is kisspeptin neuronen ARC. (C) Merk op dat geen van de GnRH neuronen bevatten GTT. Exclusieve transsynaptische overdracht van BL maar niet GTT te GnRH neuronen toont aan dat GnRH neuronenzijn stroomafwaarts van kisspeptin neuronen. Schaalbalken (B, C) van 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Kenmerken | Transsynaptische tracers | Neurotropic virussen |
| Wijze van toepassing | Uitgedrukt als een transgen | Mechanisch ingespoten |
| Richting van de spread | Anterograde, retrograde & bidirectionele | Retrograde & anterograde |
| Synaptische werkzaamheid | Multisynaptic | Multisynaptic of monosynaptic (alleen retrograde) |
| Signaalsterkte | Zwakke, neemt af bij elke synaps | Sterke, signaalversterking bij elke synaps |
| Immuunrespons | None; uitgedrukt als endogene eiwit | Sterke immuunrespons, dodelijk |
| Ruimtelijke en temporele resolutie | Afhankelijk van promotor van keuze | Zeer selectief als gevolg van mechanische injecties op afzonderlijke locaties |
Tabel 1: Vergelijking van de kenmerken van genetische transsynaptische tracers en genetisch gemodificeerde neurotropic virussen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uitdrukken transsynaptische tracers als transgenen naar de neurale circuits van genetisch bepaalde neuronale populatie traceren heeft een aantal voordelen ten opzichte van de stereotactische injectie van tracers of neurotopic virussen. Eerst wordt de tracer geproduceerd als een endogeen eiwit en dus geen immuunrespons opwekken en een selectieve neurale weg kan verschillende dieren met een hoge reproduceerbaarheid geanalyseerd. Ten tweede, aangezien dit een niet-invasieve methode kan worden gebruikt om de circuits traceren van neuronen niet gemakkelijk toegankelijk voor stereotaxische injecties, bijvoorbeeld in utero. Beperkingen omvatten doorgaans geringe werkzaamheid bij transsynaptische overdracht, wat kan leiden tot moeilijkheden bij het detecteren van het indicatorgas. Bovendien wordt de tracer molecuul verdund bij elke synaps. Daarentegen neurotrope virussen repliceren en virale replicatie leidt vervolgens tot amplificatie signaal nadat u de synaps. Echter, virale replicatie is ook een belangrijke BEPERKINGENion van het gebruik van neurotrope virussen vanwege intrinsieke virale cytotoxiciteit. Sommige functies van genetische transsynaptische tracers en genetisch gemodificeerde neurotrope virussen vergeleken in tabel 1.
De R26-BIZ en R26-GTT allelen elkaar aanvullen en de visualisatie van de neurale circuits van een genetisch geïdentificeerd neuronale populatie van Cre-gemedieerde recombinatie vergemakkelijken. De R 26 promotor is goed gekarakteriseerd en bemiddelt alomtegenwoordige uitdrukking met een bescheiden kracht 11,12. Met behulp van zeer gevoelige methoden voor tracer detectie zoals de tyramide signaalversterking (TSA) systeem maakt het mogelijk de identificatie van zelfs minieme hoeveelheden van tracer moleculen overgedragen aan de overkant van synapsen. Een ander groot voordeel van het gebruik van de R26 promotor om tracer expressie te rijden is dat het uiten van neuronen continu synthetiseren de tracers gedurende hun hele leven. Dit maakt het mogelijk om circuit rijping analyserengedurende langere tijdsperioden 5. Daarentegen is dit niet mogelijk met neurotrope virussen vanwege hun cytotoxiciteit. Belangrijk ons binaire genetisch systeem en het gebruik van de promotor R26 ontkoppelt tracer productie van mogelijk sterk gereguleerde endogene promoters vinden Cre expressie (in dit geval, de Kiss1 promotor), die door een verscheidenheid van genetische en epigenetische factoren 13 kan worden geregeld. Vandaar transsynaptische overdracht van BL en GTT weerspiegelt werkelijke synaptische communicatie tussen twee neuronale populaties.
Cre gemedieerde recombinatie een onomkeerbaar feit en daarom verandert ontwikkelingsgebied transiënte genexpressie in stabiele transgene expressie. Het gebruik van een induceerbare Cre systeem 14 kan mogelijk ontmaskeren een effect op de ontwikkeling van voorbijgaande Cre expressie.
Concluderend kunnen de twee nieuwe R26-BIZ en R26-GTT muizestammen gebruikt worden lokale en lo te analyserenng bereik neurale circuits die zijn samengesteld uit verschillende klassen en soorten van neuronen afkomstig uit een hersengebied of van het ruggenmerg in een Cre-afhankelijke wijze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
- Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
- Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
- Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
- De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
- Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
- Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67 (2005).
- Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
- Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).
