Introduction
Anatomische Pfadverfolgung ist eine der am häufigsten verwendeten Werkzeuge, um die Beziehung zwischen Gehirn und Verhalten 1 entziffern. Fortschritt in neuronalen Schaltkreis Tracing Technologien hat Neurowissenschaftler mit der Fähigkeit, neuronale Schaltkreise genetisch identifiziert Neuronenpopulationen in Mäusen 2 Spuren verliehen. Trotz dieser technischen Fortschritt bleibt es schwierig, die Bildung von neuronalen Schaltkreisen vor allem während der embryonalen Reifung zu entwirren. Das ist, weil die meisten der bisher entwickelten Tracing-Verfahren basieren auf stereotaktische Injektion von transsynaptische Tracer oder gentechnisch veränderten neurotropen Viren (Abbildung 1) 2,3 basierend. Während diese Techniken zu erreichen räumliche und zeitliche Auflösung der Konnektivität, mehrere inhärente Beschränkungen wie technisch anspruchs Tracer Injektionen in das sich entwickelnde Gehirn, die Reproduzierbarkeit der Injektionsstelle, potenzielle Entzündung an der Injektionsstelle und wich-tantly Zytotoxizität von neurotropen Viren verursacht begrenzen ihre Verwendung 4.
Eine alternative Methode ist es, die transsynaptische Tracer als Transgene in genetisch veränderten Mäusen exprimieren. Vor kurzem haben wir diese Technik modifiziert und eine binäre genetische transsynaptische Tracing-System, um die neuronalen Schaltkreise eines genetisch identifiziert neuronalen Population 5 Karte entwickelt. Unsere experimentellen Strategie basiert auf zwei neuen Knock-in Mausstämme, die entweder die bidirektionale Tracer Gerstenlektin (BL) 6 oder die retrograde Tracer-Tetanustoxin-Fragment C bis GFP (GTT) 7 von der ROSA 26 Ort verschmolzen Ausdruck basiert nach Cre-vermittelte Rekombination. Hier verwendeten wir diese Mäusestämme, selektiv auszudrücken BL und GTT in Neuronen, kisspeptin erzeugen, ein Neuropeptid, das bei der Regulierung der Reifung des reproduktiven Achse 8,9 gebracht wird. Wir zeigen, dass diese Technik geeignet ist, die Entwicklung und Reifung der Kuss visualisierenPeptin neuronalen Schaltkreise während der embryonalen Entwicklung des weiblichen Maushirn 5.
Zuchtstrategie
Die R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) und die R26-GFP-TTC (GTT) Begleitheizungsleitungen sind Knock-in-Stämme, die rekombinante 5 ROSA26 Allele tragen. Die R26-BIZ und die R26-GTT Allele transkriptional stumm aufgrund der Gegenwart einer starken Transkriptionsstoppsignal, das von zwei loxP-Stellen flankiert ist 5. Expression des BIZ und GTT Transgen durch Cre-vermittelte Entfernung des transkriptionellen Stop-Signal aktiviert. Die R26-BIZ und R26 GTT-Allele können unabhängig voneinander einfach durch Kreuzung mit einem Cre Fahrer verwendet werden. Zur Analyse Tiere, die heterozygot für die jeweiligen Cre und R26 Allele verwendet werden. Wurf Durchführung einer Cre oder ein Allel R26 jeweils als Kontrollen verwendet werden. Alternativ ist es auch möglich, zu erzeugen triple Knock-in Tiere, die die Cre, R26 und R26-BIZ-GTT-Allele jedoch wird dies eine zusätzliche Quer erfordern.
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Protocol
HINWEIS: Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Tierschutzkommission der Universität Hamburg und der Universität des Saarlandes genehmigt.
1. Vorbereitung und Fixierung von embryonalem Gewebe
- Vereinbaren Sie alle mussten sezieren die Embryonen und die Lösungen für die anschließende Fixierung des Gewebes vor dem Töten der Tiere Ausrüstung.
HINWEIS: Immer eine frische 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung (4% PFA in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert auf 7,4). - Euthanize zeitlich schwangere Frau Maus mit einer ethisch genehmigten Verfahren.
- Übertragen Sie die Maus auf eine Plattform. Befeuchten Sie die Bauchseite des Bauches mit 70% Ethanol und einen vertikalen Schnitt mit scharfen Schere, um die Bauchhöhle aus.
- Identifizieren Sie die embryonalen Kette und ziehen Sie sie vorsichtig mit stumpfen Pinzette und legen Sie sie in eiskaltem PBS.
- Holen Sie die einzelnen Embryonen ausdie embryonalen Kette mit einer feinen Schere und Pinzette. Entfernen Sie die zusätzlichen Gewebe um die Embryonen und waschen Sie sie in eiskaltem PBS.
- Nehmen Sie eine kleine Schwanzbiopsie (vor der Übertragung des Embryos in PFA) und Inkubation in Schwanz Lysepuffer für die Geschlechteridentifikation und Tracer-Allel Genotypisierung PCR.
- Starten Sie aus dem Embryo am meisten lateralen Seite und übertragen jedes Embryo getrennt in ein Röhrchen mit eiskaltem 4% PFA auf Eis auf einem Schüttler.
- Weichen Sie die Embryonen im Alter von E13.5 oder jünger 1,5 h auf Eis mit konstantem Schütteln. Weichen Sie die Embryonen im Alter von E14.5 und E15.5 2,5 h auf Eis mit konstantem Schütteln.
- Für Embryonen Alter E16.5 oder älter, enthaupten und entfernen Sie die Außenhaut vor dem Eintauchen des Kopfes in PFA-Lösung. Leiter der E16.5 Embryonen 4,5 h auf Eis mit konstantem Schütteln eingeweicht werden.
- Nach entsprechender Fixierung, waschen Sie die Embryonen dreimal mit eiskaltem PBS. Übertragen Sie die Embryonen in 30% Saccharose in PBS-Lösung bei 4 ° C, bis sie sinkennach unten.
2. Einfrieren
- Vereinbaren Sie alle vor dem Start des Gefrierprozesses benötigten Materialien: Kryo-Schimmel, Kryo-Handschuhe, Feder Entomologie Zangen, Textmarker und optimale Schnitttemperatur Verbindung (OCT)
- Beschriften Sie die Kryo-Form mit einem permanenten alkoholbeständigen Marker (erwähnen Sie die Ausrichtung des Gewebes, das Datum und Genotyp). Bereiten Sie eine Matsch zerstoßenes Trockeneis und 100% Ethanol in einem Eiskübel. Stellen Sie ein Becherglas innen Isopentan enthält. Nach 10 min für die Isopentan abkühlen.
- In der Zwischenzeit nehmen Sie die Gewebe aus dem Saccharoselösung, wischen Sie überschüssige Saccharose um das Gewebe mit Hilfe von Labortücher. Übertragen Sie das Gewebe in eine vorge beschriftet Kryo-Form mit ausreichend Oktober, um das Gewebe zu bedecken. Vermeiden Sie Luftblasen im Oktober; vor allem rund um das Gewebe.
- Richten Sie das Gewebe in OCT mit Feder Entomologie Pinzette zu Gewebeschäden zu vermeiden. Starten Sie das Einfrieren durch die Übertragung der Kryo-mold in das vorgekühlte Isopentan Badewanne. Isopentan in den Oktober spritzen Sie nicht, da es nicht richtig einfrieren. Wickeln Sie die Proben in Aluminiumfolie und bei -80 ° C.
3. Kryoschneiden
- Cut 14 um dünne Schnittserien in Serie von fünf mit einem Kryostaten und sammeln auf SuperFrost® Plus-Glasobjektträger für Immunfluoreszenz (IF) Analyse. Bewahren Sie die Objektträger bei -80 ° C bis genutzt.
4. Tracer Visualisierung Mit dem Tyramid Signalverstärkung (TSA) Protokoll
- Bereiten Sie die Puffer und Reagenzien für die Färbung erforderlich. Immer frisch und die Tris-NaCl-Tween (TNT) Puffer vorzubereiten am Tag der Nutzung.
- Bereiten TNT Puffer unter Verwendung von 100 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml 5 M NaCl und ddH 2 O bis zu einem Endvolumen von 1 l In 500 ul Tween 20 unter Verwendung einer 1 ml Pipette. Fügen Sie die Tween 20 langsam und spülen Sie die Pipette auf und ab mehrmals, um sicherzustellen, dass alle Tween 20 ist inLösung.
- Bereiten Tris-NaCl-Blocking (TNB) Puffer mit 100 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5, 30 ml 5 M NaCl und ddH 2 O bis zu einem Gesamtvolumen von 1 l 5 g Blocking Reagenz (mit der vorgesehenen Kit) langsam in kleinen Schritten an den Puffer unter Rühren. Die Lösung wird langsam auf 55 ° C unter kontinuierlichem Rühren, um das Blockierungsmittel vollständig zu lösen (dies sollte nicht länger als 30-60 Minuten). Um dies zu erreichen homogene Erwärmung mit einem Wasserbad bei 55 ° C. Die Lösung wird milchig erscheinen. Bringen Sie die Lösung auf Raumtemperatur, bevor Sie. Aliquotieren und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung.
- Rekonstituieren Biotin Tyramid Reagenz (im Kit enthalten) in Molecular Biology / HPLC-Qualität DMSO. Je nachdem, welcher Kit verwendet die entsprechende Menge DMSO kann variieren. Bewahren Sie die Stammlösung bei 4 ° C.
HINWEIS: Teile von Tieren, die heterozygot für die jeweiligen Cre und R26 Allele für die Schaltungsanalyse verwendet werden. Mit sReflexionen von Wurf Durchführung einer Cre oder ein Allel R26 jeweils als negative Kontrollen. Gönnen negativen Kontrollobjektträger genau wie Folien aus doppelt heterozygote Tiere. Darüber hinaus sind in einem Steuerschieber aus einem Doppel heterozygoten Tier, sondern lassen Sie das TSA-Reagenz (nicht verstärkte Kontrolle).
- Mit einem scharfen frische Skalpell entfernen überschüssiges Oktober die Gewebeschnitte Umgebung und markieren die Grenze um die Abschnitte mit einem PAP Stift.
- Trocknen Sie die Objektträger für 2-3 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Für jede 5 min Waschen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur 3x mit TNT. Die Folien bei RT Inkubation 30 min in 0,3% H 2 O 2 -Lösung in eiskaltem Methanol, um endogene Peroxidase-Aktivität zu quenchen.
- Jeweils 3x mit PBS für jeweils 5 min bei RT. Inkubieren für 10 min in 0,5% Triton-X-100 in PBS für Gewebe Permeabilisierung. Für jede 5 min Waschen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur 3x mit TNT.
- Block mit TNB (Blockierungslösung, 200 bis 300 & mgr; l pro Folie) 30min bei RT in einer feuchten Kammer. Sicherstellen, dass alle Teile vollständig von TNB bedeckt. Lassen Sie die Objektträger trocknen in den Zwischenbereichen.
- Abfließen überschüssiges Blockierungspuffers und Anwendung des primären Antiserum erkennt den Tracer (1: 1.000 Ziegen-Anti-WGA für BL, 1: 15.000 Kaninchen-Anti-GFP für GTT) in TNB für 2 h bei RT, verdünnt oder über Nacht bei 4 ° C. Achten Sie darauf, genug Volumen, um den Gewebeschnitt (200 bis 300 & mgr; l pro Folie) vollständig bedecken.
HINWEIS: Die primären Antiseren Verdünnungen hier empfohlen werden, können angepasst werden. - Jeweils unter Rühren 5 Minuten waschen Sie die Folien bei RT 3x mit TNT.
- Inkubieren der Schnitte mit biotinylierten sekundären Antiserum erkennt den Host des ersten Antiserum (1: 500 Pferd-Anti-Ziegen-IgG Anti-WGA, 1: 5.000 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-anti-GFP in TNB für 1 h bei RT).
- Jeweils 3x mit TNT bei RT jeweils unter Rühren 5 min. Inkubation in 1: 100 Streptavidin (SA) konjugierte Meerrettichperoxidase (SA-HRP, sofern with das Kit) in TNB für 30 min bei RT in einer feuchten Kammer. Für jede 5 min Waschen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur 3x mit TNT. Unterdessen tauen die TSA.
- Verdünnen TSA 01.50 in TSA Verstärkung Verdünnungsmittel (im Kit enthalten, verwenden Sie das TSA-Kit für die Visualisierung von BL und der TSA + Kit für GTT). Die Gewebeschnitte in verdünnter TSA inkubieren genau 10 min bei RT. Verdünnen TSA kurz vor der Verwendung, im Idealfall während der vorhergehenden Waschschritt, verwenden Sie keine verbleibenden verdünnten TSA Reagenz für zukünftige Experimente; immer frisch zubereiten.
- Jeweils unter Rühren 5 Minuten waschen Sie die Folien bei RT 3x mit TNT. Inkubieren mit 1: 500 Alexa Fluor ® 546-Streptavidin-Konjugat in TNB für 30 min bei RT. Jeweils unter Rühren 5 Minuten waschen Sie die Folien bei RT 3x mit TNT.
- Inkubieren für 10 min in 5% Bisbenzimid-Lösung in PBS bei RT für die Kernfärbung. Jeweils unter Rühren 5 Minuten waschen Sie die Folien bei RT 3x mit TNT. Montieren Sie mit Fluromount G und führen Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie.
5. τlacZ Färbung für Embryonale Bereiche
- Bereiten Sie die Puffer und Reagenzien für die Färbung erforderlich. Immer frisch bereiten die LacZ Puffer C vor dem Gebrauch.
- Bereiten 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) Stammlösung (40 mg / ml) durch Zugabe von 40 g X-gal zu 1 ml 70% Dimethylformamid (DMF). Mit Alufolie abdecken und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung.
- Bereiten Nitroblautetrazolium (NBT) stock-Lösung (50 mg / ml) durch Zugabe von 50 g NBT zu 1 ml 70% DMF. Mit Alufolie abdecken und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung.
- Bereiten LacZ Fixativ mit 80 ul 25% Glutaraldehyd, 5 ml einer 4% PFA, 20 ul 1 M MgCl 2, 100 & mgr; l 500 mM EGTA, 1 ml 1 M Phosphatpuffer pH 7,4 und ddH 2 O bis zu einem letzten Volumen von 10 ml.
- Bereiten LacZ Puffer A mit 1 ml von 1 M MgCl 2, 5 ml 500 mM EGTA, 50 ml 1 M Phosphatpuffer pH 7,4 und ddH 2 O bis zu einem Endvolumen von 500 ml.
- Bereiten LacZ Puffer B unter Verwendung von 1 ml von 1 M MgCl 2, 5 ml 500 mM EGTA, 5 ml 1% Natriumdeoxycholat, 100 ml 10% NP-40, 50 ml 1 M Phosphatpuffer pH 7,4 und ddH 2 O bis zu einem Endvolumen von 500 ml.
- Bereiten LacZ Puffer C durch Zugabe von 10 ul NBT-Stammlösung und 12,5 ul der X-gal-Stammlösung zu 1 ml LacZ Puffer B Stellen frisch kurz vor dem Gebrauch und mit Alufolie abdecken.
- Trocknen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur mindestens 10-15 min (mittlerweile die Folien mit einem PAP Pen vorzubereiten).
- Fixieren der Abschnitt mit LacZ Fixiermittel für 2 min bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer innerhalb einer chemischen Abzugshaube. Waschen 3x mit PBS, ergänzt mit 2 mM MgCl 2.
- Spülen Sie die Folien mit LacZ Puffer A waschen die Dias mit LacZ Puffer A 3 mal für 10 Minuten jeweils bei RT. Für jede 5 min Waschen 2 mal mit LacZ Puffer B. Die Folien in LacZ Puffer C Inkubieren bei 30-37 ° C für 6 Stunden oder über Nacht in einer befeuchteten Kammer.
HINWEIS: In ausreichendes Volumen an LacZ-Puffer C; Folien sollten nicht austrocknen während der Inkubation. - Nach entsprechender Inkubation die Objektträger mit PBS, ergänzt mit 2 mM MgCl 2. Kurz mit ddH 2 O spülen Abschnitte Deckglas mit Mayers Glycin Gelatine. Geeignet für ein Lichtmikroskop mit einem Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bild Einrichtung ausgestattet.
6. Gender und Tracer-Genotypisierung
- Bereiten Schwanz Lysepuffer mit 1 ml 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 ul 500 mM EGTA, 200 ul 10% SDS, 400 & mgr; l 5 M NaCl und ddH 2 O, um ein Endvolumen von 10 ml.
- Fügen Sie 500 ul Lysepuffer Schwanz zu jedem Eppendorf-Röhrchen, die einen Schwanz Biopsie. Hinzufügen Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 100 mg / ml. Inkubieren über Nacht auf einem Schüttler bei 55 ° C.
- Zentrifuge Proben bei 17.000 xg für 10 min bei RT. Den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen. Gib 500 ul Isopropanol zu dem Überstand. Mischen Sie für mindestens 5 Minuten mit dem Umdrehen der Röhrchen auf und ab.
- Spin in Zentrifuge bei 17.000 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie den Überstand. Nach Zugabe von 200 ul 70% Ethanol. Schütteln für mindestens 5 min.
- Zentrifugieren bei 17.000 × g für 5 min. Überstand entfernen mit einem Pipetman (nicht gießen nicht aus). Trocknen des Pellets in einer warmen Kammer (37 ° C) für 15-30 min.
- Pellet in 100 & mgr;niedriger TE pH 8,0 oder Wasser mit weiter Bohrung Filterspitzen. In 55 ° C Setzen Sie für 1 Stunde und bei 37 ° C über Nacht für die richtige Lösung. Lagerung bei 4 ° C.
- Verwenden 1 ul DNA für die PCR-Reaktion (50 & mgr; l Reaktionsgemisch, enthaltend 1 ul Schwanz-DNA, 2,5 & mgr; l DMSO, 10 pM jedes Primers, 25 & mgr; M von jedem dNTP und 1 M Betain). PCR-Primer für die Genotypisierung und Geschlechtsidentität sind in der Tabelle aufgeführten Materialien.
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Representative Results
Dieser Abschnitt zeigt repräsentative Ergebnisse, die erhalten wird, kann die Arbeit mit dem R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) und der R26-GTT (G FP TT C) Allele werden. Hier verwenden wir die R26-BIZ und der R26-GTT-Allele, die Reifung der neuronalen Schaltkreise Regulierung der reproduktiven Achse analysieren. Die Vervielfältigung in Wirbeltieren wird zentral von einer kleinen Untergruppe von Neuronen im Hypothalamus, die Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) absondern gesteuert. Kisspeptin, ein potenter Aktivator von GnRH Neuronen in der Regulierung der Aktivität von GnRH-Neuronen in Verbindung gebracht worden, aber wenn die neuronalen Schaltkreise zwischen GnRH und kisspeptin Neuronen im sich entwickelnden Gehirn weiblichen Maus etabliert war nicht bekannt, 5. Zuerst zeigen wir, dass die Expression der BIZ und GTT-Transgene werden spezifisch durch Cre-abhängige Rekombination in embryonalen aktiviertkisspeptin Neuronen in der bogenförmigen Kern (ARC) (Abbildung 2) mit einem kisspeptin spezifische Cre Treiberleitung 10. Wir zeigen, dass dann kisspeptin Neuronen im ARC bereits mit einer spezifischen Teilmenge von GnRH Neuronen in utero (3A, B) kommunizieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass ARC kisspeptin Neuronen vor der GnRH-Neuronen (3A, C). Zusammengenommen unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die neuronalen Schaltkreise zwischen kisspeptin und GnRH-Neuronen sind komplett eingerichtet und betrieben wird das weibliche Gehirn der Maus vor der Geburt.
Fig. 1: transsynaptische Übertragung Tracer unter Verwendung herkömmlicher oder genetische Ansätze Bei dem herkömmlichen Ansatz wird ein transsynaptische Tracer wird von allen Neuronen an der Injektionsstelle damit potenziell Beschriftung unspezifische unabhängige Wege gemacht. Inder genetische Ansatz wird der Tracer selektiv durch genetisch definierten Neuronen so gezielt Visualisierung Neuronen auf die Tracer-exprimierenden Zellen verbunden ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2: Faithful Aktivierung der BIZ und GTT Transgen in embryonalen ARC kisspeptin Neuronen. (A) Zucht Strategie, BIZ und GTT Ausdruck in kisspeptin Neuronen zu aktivieren. Wir gezüchtet R26-BIZ und R26-GTT-Mäusen mit Kisspeptin-IRES-Cre (KissIC) Mäusen 10, wobei die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des Promotors exprimiert KISS1. (CE) β-gal Enzymaktivität identifiziert der Tracer-Herstellung Zellen und ist mit der ARC im Gehirn eines weiblichen KissIC / R eingeschränkt26-BIZ Embryo im embryonalen Tag (E) 18.5. (FG) Doppelimmunfluoreszenz für kisspeptin (grün) und BL (rot) (F) oder GTT (rot) (G) zeigt, treu Aktivierung BL oder GTT-Expression durch Cre-vermittelte Rekombination in kisspeptin Neuronen in KissIC / R26-BIZ oder KissIC / R26-GTT weiblichen Maus-Embryonen sind. Maßstabsbalken (C) 500 & mgr; m (D) 200 & mgr; m (F, G) 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: GnRH Neuronen synaptisch verbundenen und stromab kisspeptin Neuronen. (A) Kombinatorische genetische bidirektionale transsynaptische Verfolgung. Während τlaCZ ist die Cre-exprimierenden kisspeptin Neuronen beschränkt wird BL transsynaptically übertragen zu vor- (präsynaptischen) und stromabwärts (postsynaptischen) Neuronen in KissIC / R26-BIZ Mäusen. Im Gegensatz dazu wird GFP-TTC transsynaptically an präsynaptische, aber nicht postsynaptischen Neuronen in KissIC / R26-GTT-Mäuse transferiert. Postsynaptischen Neuronen τlacZ-positive Axon Fasern in ihrer näheren Umgebung (B, C) Doppelimmunfluoreszenz für BL (rot; B). Oder GTT (rot; C) und GnRH (grün) auf einem Sagittalschnitt durch den ganzen Kopf eines weiblichen KissIC / R26-BIZ oder KissIC / R26-GTT Embryo in E18.5. (B) Beachten Sie, dass einige, aber nicht alle GnRH-Neuronen enthalten BL. Diese Daten zeigen, dass eine Untergruppe von embryonalen GnRH Neuronen synaptisch zu kisspeptin Neuronen Bogen verbunden. (C) Man beachte, daß keiner der GnRH Neuronen GTT enthalten. Exklusive transsynaptische Übertragung von BL, aber nicht GTT zu GnRH-Neuronen zeigt, dass GnRH-Neuronengibt nachgeschaltet kisspeptin Neuronen. Maßstabsbalken (B, C) 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
| Eigenschaften | Transsynaptische Tracer | Neurotropen Viren |
| Art der Anwendung | Als Transgen exprimiert | Mechanisch injiziert |
| Ausbreitungsrichtung | Anterograde, retrograde & bidirektionale | Retrograde & anterograde |
| Synaptic Wirksamkeit | Multisynaptic | Multisynaptic oder monosynaptische (nur retrograd) |
| Die Signalstärke | Schwach, verringert sich bei jeder Synapse | Strong, Signalverstärkung bei jeder Synapse |
| Immunantwort | Keine; als endogene Protein exprimiert | Starke Immunantwort, tödlich |
| Räumliche und zeitliche Auflösung | Hängt davon ab, Promotor der Wahl | Hochselektive durch mechanische Injektionen an den einzelnen Standorten |
Tabelle 1: Vergleich der Eigenschaften von genetischen transsynaptische Tracer und gentechnisch veränderten neurotrope Viren
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Discussion
Ausdruck transsynaptische Tracer als Transgene, die neuronale Schaltkreise genetisch definierten neuronalen Populationen verfolgen hat mehrere Vorteile gegenüber dem stereotaktische Injektion von Tracern oder neurotopic Viren. Zuerst wird der Tracer als endogenes Protein erzeugt und daher keine Immunantwort hervorzurufen und eine selektive neuralen Weg kann in verschiedenen Tieren, die mit hoher Reproduzierbarkeit zu analysieren. Zweitens, weil dies eine nicht-invasive Methode kann verwendet werden, um die Schaltungen von Neuronen für stereotaktische Injektionen nicht leicht zugänglich in utero zu verfolgen, zum Beispiel. Einschränkungen umfassen eine allgemein niedrige Wirksamkeit bei transsynaptische Transfer, was zu Schwierigkeiten bei der Erfassung der Tracer zur Folge haben kann. Darüber hinaus wird der Tracer-Molekül an jeder Synapse verdünnt. Im Gegensatz dazu neurotropen Viren replizieren und die virale Replikation wiederum führt dann zur Signalverstärkung nach dem Überqueren der Synapse. Jedoch ist die virale Replikation auch ein Haupt BegrenzIonen der Verwendung von neurotropen Viren aufgrund intrinsischer viraler Cytotoxizität. Einige Merkmale des genetischen transsynaptische Tracer und gentechnisch veränderten neurotrope Viren sind in Tabelle 1 verglichen.
Die R26-BIZ und R26 GTT-Allele ergänzen sich und ermöglichen die Visualisierung der neuronalen Schaltkreise eines genetisch identifiziert neuronalen Population nach Cre-vermittelte Rekombination. Die R 26 Projektträger ist gut charakterisiert und vermittelt ubiquitäre Expression mit bescheidenen Stärke 11,12. Mit hochempfindlichen Verfahren zur Tracer-Nachweis wie Tyramid Signalverstärkungs (TSA) System ermöglicht die Identifizierung von selbst geringen Mengen an Tracermoleküle über die Synapsen übertragen. Ein weiterer wichtiger Vorteil der Verwendung des R26-Promotor Tracer Expression zu steuern, dass die exprimierenden Neuronen synthetisieren ständig der Tracer während ihrer gesamten Lebensdauer. Dies macht es möglich, Schaltungs Reifung analysiertfür längere Zeiträume 5. Im Gegensatz dazu ist dies nicht möglich, bei Verwendung von neurotropen Viren aufgrund ihrer Zytotoxizität. Wichtig ist, dass unsere binären genetischen Systems und die Verwendung des R26-Promotor entkoppelt Tracer Herstellung von potentiell stark reguliert endogene Promoantriebs Cre-Expression (in diesem Fall der KISS1 Promotor), die durch eine Vielzahl von genetischen und epigenetischen Faktoren 13, reguliert werden können. Daher transsynaptische Übertragung von BL und GTT spiegelt tatsächliche synaptische Kommunikation zwischen zwei neuronalen Populationen.
Cre-vermittelte Rekombination ein irreversibles Ereignis und damit wandelt sie entwicklungs transiente Genexpression in stabile Transgenexpression. Die Verwendung eines induzierbaren Cre-System 14 zu einem Entwicklungs Wirkung potentiell demaskieren aufgrund transienter Cre Expression.
Zusammenfassend lassen sich die beiden neuartigen R26-BIZ und R26 GTT-Mausstämme zur Analyse lokaler und lo werdenng Bereich neuronale Schaltkreise, die von verschiedenen Klassen und Arten von Neuronen aus jeder Region des Gehirns oder sogar aus dem Rückenmark in einem Cre-abhängigen Art und Weise Ursprung zusammengesetzt sein könnte.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
- Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
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