Introduction
מעקב נתיב האנטומי הוא אחד הכלים הנפוצים ביותר בשימוש לפענח את הקשר בין המוח והתנהגות 1. קידום בטכנולוגיות מעגל התחקות עצביות העניק מדעני מוח עם היכולת לעקוב אחר מעגלים עצביים מאוכלוסיות נוירון זיהו גנטי בעכברים 2. למרות התקדמות הטכנולוגית אלה נותרים מאתגרים לפענח את היווצרותם של מעגלים עצביים במיוחד בתקופת התבגרות עוברית. סיבה לכך הוא שרוב שיטות המעקב שפותחו עד היום מבוססים על הזרקת stereotaxic של קליעים נותבים transsynaptic או וירוסי neurotropic מהונדסים גנטי (איור 1) 2,3. בעוד טכניקות אלה להשיג רזולוציה מרחב ובזמן של קישוריות, כמה מגבלות מובנות כגון זריקות נותב מאתגרות מבחינה טכנית למוח המתפתח, שחזור של אתר הזרקה, דלקת פוטנציאלית במקום ההזרקה וimpor ביותרcytotoxicity tantly נגרמת על ידי וירוסי neurotropic להגביל את השימוש בם 4.
שיטה חלופית היא להביע קליעים נותבים transsynaptic כtransgenes בעכברים שעברו מוטציה גנטית. יש לנו לאחרונה שונו בטכניקה זו ופיתחתי מערכת בינארית transsynaptic גנטי התחקות למפות את המעגלים העצביים של כל אוכלוסייה עצבית מזוהה גנטי 5. האסטרטגיה הניסיונית שלנו מבוססת על שני זנים חדשים לדפוק בעכבר, המבטאים גם לקטינים שעורה נותב דו-כיווני (BL) 6 או בר רעלנים נותב מדרדר C התמזג GFP (GTT) 7 מלוקוס ROSA 26 לאחר Cre תיווך רקומבינציה. כאן אנו משמשים זני עכבר אלו כדי להביע את BL וGTT בתאי עצב המייצרים kisspeptin, neuropeptide שמעורב בויסות ההתבגרות של ציר הרבייה 8,9 באופן סלקטיבי. אנו מראים כי טכניקה זו היא מתאימה כדי לחזות את ההתפתחות והתבגרות של נשיקהמעגלים עצביים peptin במהלך התפתחות עוברית של מוח העכבר נקבת 5.
אסטרטגית רבייה
R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) והקווים נותב R26-GFP-TTC (GTT) הם לדפוק בזנים 5 שנושאים אללים ROSA26 רקומביננטי. R26-BIZ ואללים R26-GTT הם תעתיק שקטים בשל נוכחותם של איתות חזקה תעתיק תחנה, שמעוטרת בשני אתרי loxP 5. ביטוי של transgene BIZ וGTT מופעל על ידי ההסרה בתיווך Cre של אות תחנת תעתיק. ניתן להשתמש אללים R26-BIZ וR26-GTT באופן עצמאי על ידי פשוט חצייה עם קו נהג Cre. להטרוזיגוטיים בעלי חיים ניתוח לאללים Cre וR26 המתאימים ניתן להשתמש. המלטת ביצוע Cre אחד או אחת אלל R26, בהתאמה, צריכה לשמש כקבוצת ביקורת. לחלופין, אפשר גם ליצור triple לדפוק בבעלי חיים שנשאו את אללים Cre, R26-BIZ וR26-GTT, אולם זה יחייב צלב אחד נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: אתיקה הצהרה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים של אוניברסיטת המבורג ובאוניברסיטת Saarland.
1. הכנה וקיבוע של רקמה העוברית
- מסדרים את כל הציוד הדרוש ללנתח את העוברים ולהכין פתרונות לקיבעון הבא של הרקמה לפני להקריב בעלי החיים.
הערה: תמיד להכין פתרון paraformaldehyde 4% טריים (PFA) (4% PFA ב 0.1 M מלוח פוספט (PBS), להתאים את ה- pH 7.4). - להרדים נקבת עכבר בהריון בעיתוי בנוהל שאושר מבחינה אתית.
- העבר את העכבר על גבי פלטפורמה. להרטיב את הצד הגחוני של הבטן עם 70% אתנול ו לעשות חתך אנכי באמצעות מספריים חדים לחשוף את חלל הבטן.
- זהה את השרשרת העוברית ולמשוך אותו החוצה מלקחיים בוטים באמצעות זהירות ולמקם אותו לתוך PBS קר כקרח.
- הסר את העוברים הבודדים מהשרשרת העוברית באמצעות מספריים ומלקחיים בסדר. הסרה של רקמה נוספת סביב העוברים ולשטוף אותם בPBS קר כקרח.
- לקחת ביופסיה זנב קטנה (לפני העברת העובר לPFA) ודגירה אותו במאגר תמוגה זנב לזיהוי המין וgenotyping אלל נותב PCR.
- תתחיל מהעובר בצד לרוחב ביותר ולהעביר כל עובר בנפרד לתוך צינור המכיל 4% PFA קר כקרח על קרח על שייקר.
- משרים את העוברים בגיל צעיר יותר E13.5 או עבור 1.5 שעות על קרח עם רעד קבוע. משרים את העוברים בE14.5 הגיל וE15.5 תמורת 2.5 שעות על קרח עם רעד קבוע.
- לE16.5 גיל עוברים או יותר, לערוף ולהסיר את העור החיצוני לפני השריית הראש בפתרון PFA. ראשי עוברי E16.5 יכולים להיות טבולים תמורת 4.5 שעות על קרח עם רעד קבוע.
- לאחר הקיבוע מתאים, לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח. מעביר את העוברים לתוך סוכרוז 30% בפתרון PBS על 4 מעלות צלזיוס עד שהם שוקעיםלתחתית.
2. הקפאה
- לסדר את כל החומרים הדרושים לפני שמתחיל את תהליך ההקפאה: cryo-עובש, cryo-כפפות, מלקחיים אנטומולוגיה במשקל הנוצה, בטוש ומתחם טמפרטורה אופטימלי חיתוך (אוקטובר)
- תווית cryo-העובש עם סמן אלכוהול עמיד קבוע (להזכיר את הכיוון של רקמות, תאריך וגנוטיפ). הכן רפש של קרח יבש כתוש ו 100% אתנול בדלי קרח. מניחים כוס זכוכית בתוך המכיל איזופנטאן. חכה 10 דקות לאיזופנטאן להתקרר.
- בינתיים להסיר את הרקמה מפתרון סוכרוז, נגב את סוכרוז העודף סביב הרקמות באמצעות מגבוני מעבדה. העברת הרקמה לתוך cryo-עובש שכותרתו מראש עם אוקטובר מספיק כדי לכסות את הרקמה. הימנע מכל בועות אוויר ב- OCT; במיוחד סביב הרקמה.
- כוון את הרקמה ב אוקטובר באמצעות מלקחיים אנטומולוגיה במשקל נוצה, כדי למנוע נזק לרקמות. התחל הקפאה על ידי העברת cryo-molד לאמבטיה איזופנטאן מקורר מראש. לא להתיז איזופנטאן ל- OCT כפי שהוא לא להקפיא כראוי. עטוף את הדגימות ברדיד אלומיניום ולאחסן ב -80 ° C.
3. Cryosectioning
- לחתוך 14 מיקרומטר חלקים סידוריים דקים בסדרה "חמש באמצעות cryostat ולאסוף בשקופיות זכוכית SuperFrost® פלוס עבור immunofluorescence ניתוח (IF). אחסן את השקופיות ב -80 ° C עד מנוצל.
4. הדמיה Tracer שימוש בפרוטוקול Tyramide איתותים ההגברה (TSA)
- הכן את המאגרים וחומרים כימיים הנדרשים לצביעה. תמיד טרי להכין את חיץ טריס-NaCl-Tween (TNT) ביום השימוש.
- הכן חיץ TNT באמצעות 100 מיליליטר של 1 M טריס- HCl pH 7.5, 30 מיליליטר של 5 M NaCl וDDH 2 O עד נפח סופי של 1 ל הוסף 500 μl של Tween 20 בעזרת פיפטה 1 מיליליטר. הוסף את Tween 20 לאט ולשטוף את פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לוודא שכל Tween 20 הוא בפתרון.
- הכן טריס-NaCl-חסימת חיץ (TNB) באמצעות של 1 M טריס-HCl 100 מיליליטר 7.5 pH, 30 מיליליטר של 5 M NaCl וDDH 2 O עד נפח סופי של 1 ל הוסף 5 גרם חסימה מגיב (מסופק עם ערכה) לאט במרווחים קטנים למאגר תוך ערבוב. מחממים את הפתרון בהדרגה ל -55 מעלות צלזיוס עם ערבוב רציף לפזר מגיב חסימה לחלוטין (זה לא צריך לקחת יותר מ30-60 דקות). כדי להשיג חימום אחיד להשתמש אמבט מים ב 55 ° C. הפתרון יופיע חלבי. להביא את הפתרון לטמפרטורת חדר לפני השימוש. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
- מחדש מגיב ביוטין tyramide (מצורף לערכה) בכיתה HPLC-ביולוגיה מולקולרית / DMSO. תלוי איזה ערכה משמשת את הכמות המתאימה של DMSO עשויה להשתנות. אחסן את פתרון המניות ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: סעיפים מבעלי חיים הטרוזיגוטיים לאללים Cre וR26 המתאימים יכולים לשמש לניתוח מעגל. שימוש שלections מהמלטת ביצוע Cre אחד או אחת אלל R26, בהתאמה, כפקדים שליליים. פנק את שקופיות בקרה שליליות בדיוק כמו שקופיות מבעלי חיים כפולים הטרוזיגוטיים. בנוסף, כולל שקופיות שליטה אחד מבעלי חיים כפולים הטרוזיגוטיים אבל להשאיר את מגיב TSA (שליטת unamplified).
- באמצעות אזמל טרי חד להסיר אוקטובר העודף המקיף את חלקי רקמות ולסמן את הגבול סביב החלקים עם עט PAP.
- ייבש את השקופיות במשך 2-3 דקות בטמפרטורת חדר (RT). שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד. דגירה השקופיות ב RT למשך 30 דקות בשיעור של 0.3% פתרון H 2 O 2 במתנול קר כקרח כדי להרוות את פעילות peroxidase אנדוגני.
- 3x לשטוף עם PBS במשך 5 דקות כל אחד ב RT. דגירה של 10 דקות ב 0.5% Triton-X 100 בPBS לpermeabilization רקמות. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד.
- בלוק עם TNB (חסימת פתרון, 200-300 μl לכל שקופית) במשך 30דקות ב RT בתא humidified. ודא שכל החלקים מכוסים לחלוטין על ידי TNB. אל תתנו לשקופיות להתייבש בין הצעדים.
- מסננים את חיץ חסימת עודף ולהחיל antiserum העיקרי הכרה נותב (1: 1,000 העז נגד WGA לBL, 1: 15,000 ארנב נגד GFP לGTT) מדולל בTNB לשעה 2 ב RT או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הקפד להשתמש נפח מספיק כדי לכסות את קטע הרקמה (200-300 μl לכל שקופית) לחלוטין.
הערה: דילולים antisera העיקריים המומלצים כאן עשויים להיות מותאמים. - שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה.
- דגירה הקטעים עם antiserum המשני biotinylated הכרה בשורה של antiserum הראשון (1: IgG 500 הסוס האנטי-העז לאנטי-WGA, 1: IgG נגד ארנב העז 5,000 לאנטי-GFP בTNB עבור שעה 1 ב RT).
- 3x לשטוף עם TNT ב RT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. דגירה ב 1: 100 streptavidin (SA) peroxidase חזרת -conjugated (SA-HRP wi, ובלבדth הערכה) בTNB למשך 30 דקות ב RT בתא humidified. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד. בינתיים להפשיר TSA.
- לדלל TSA 01:50 בdiluent ההגברה TSA (מצורפת לערכה; להשתמש בערכת TSA להדמיה של BL וערכת TSA + לGTT). דגירה סעיפי הרקמות בTSA המדולל לבדיוק 10 דקות ב RT. לדלל TSA רק לפני השימוש, באופן אידיאלי בשלב הכביסה הקודם, לא להשתמש בכל מגיב TSA מדולל שנותר לניסויים עתידיים; תמיד להכין טרי.
- שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. דגירה עם 1: 500 המצומד Alexa Fluor® 546 streptavidin בTNB למשך 30 דקות ב RT. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה.
- דגירה של 10 דקות ב 5% פתרון bisbenzimide PBS ב RT עבור מכתים גרעיני. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. הר עם Fluromount G ולבצע epifluorescence או confocal.
5. τlacZ מכתים לסעיפים עובריים
- הכן את המאגרים וחומרים כימיים הנדרשים לצביעה. תמיד טרי להכין את חיץ C LacZ לפני השימוש.
- הכן 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) פתרון מניות (40 מ"ג / מיליליטר) על ידי הוספת 40 גרם של X-gal עד 1 dimethylformamide מיליליטר 70% (DMF). מכסה ברדיד האלומיניום ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
- הכן tetrazolium הכחול ניטרו (NBT) stפתרון Ock (50 מ"ג / מיליליטר) על ידי הוספת 50 גרם של NBT לDMF 1 מיליליטר 70%. מכסה ברדיד האלומיניום ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
- הכן LacZ קוֹבֵעַ באמצעות 80 μl של glutaraldehyde 25%, 5 מיליליטר של 4% PFA, 20 μl של 1 M MgCl 2, של 500 מ"מ EGTA 100 μl, 1 מיליליטר של חיץ pH M פוספט 1 7.4 וDDH 2 O עד גמר נפח של 10 מיליליטר.
- הכן LacZ חיץ 1 מיליליטר באמצעות של 1 M MgCl 2, 5 מיליליטר של 500 מ"מ EGTA, 50 מיליליטר של 1 M pH חיץ פוספט 7.4 וDDH 2 O עד נפח סופי של 500 מיליליטר.
- הכן B חיץ LacZ באמצעות 1 מיליליטר של 1 M MgCl 2, 5 מיליליטר של 500 מ"מ EGTA, 5 deoxycholate מיליליטר של 1% נתרן, 10% NP-40 100 מיליליטר, 50 מיליליטר של חיץ פוספט pH 1 M 7.4 וDDH 2 O עד נפח סופי של 500 מיליליטר.
- הכן חיץ C LacZ על ידי הוספת 10 μl של פתרון מניות NBT ו12.5 μl של מניות פתרון X-gal עד 1 מיליליטר של חיץ B. LacZ הפוך טרי רק לפני השימוש ומכסים ברדיד אלומיניום.
- ייבש את השקופיות ב RT לפחות במשך 10-15 דקות (בינתיים להכין שקופיות עם עט PAP).
- לתקן את הסעיף עם LacZ קוֹבֵעַ למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר בתא humidified בתוך קטר-מנדף כימי. לשטוף 3 פעמים עם PBS בתוספת 2 מ"מ MgCl 2.
- יש לשטוף את השקופיות עם א 'חיץ LacZ שטוף את השקופיות עם LacZ חיץ 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד ב RT. לשטוף 2 פעמים עם החיץ B LacZ במשך 5 דקות כל אחד. דגירה השקופיות בC חיץ LacZ ב30-37 מעלות צלזיוס במשך שעה 6 או לילה בתא humidified.
הערה: הוספת נפח מספיק של חיץ C LacZ; שקופיות לא צריכים להתייבש במהלך דגירה. - לאחר הדגירה מתאימה לשטוף את השקופיות עם PBS בתוספת 2 מ"מ MgCl 2. יש לשטוף את החלקים בקצרה עם DDH 2 O. Coverslip עם ג'לטין גליצין של מאיר. מתאים למיקרוסקופ אור מצויד בסט-אפ הדמיה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC).
6. Gendאה וGenotyping Tracer
- הכן מאגר תמוגה זנב באמצעות 1 מיליליטר של 1 M טריס- HCl pH 8.5, של 500 מ"מ EGTA 100 μl, 200 μl של 10% SDS, 400 μl של 5 M NaCl וDDH 2 O כדי לפצות נפח סופי של 10 מיליליטר.
- הוסף 500 μl של חיץ תמוגה זנב לכל צינור Eppendorf המכיל ביופסית זנב. להוסיף K proteinase לריכוז סופי של 100 מ"ג / מיליליטר. דגירה הלילה על שייקר ב 55 ° C.
- צנטריפוגה דגימות 17,000 XG במשך 10 דקות ב RT. מעביר את supernatant לצינור צנטריפוגות חדש. הוסף 500 μl של isopropanol לsupernatant. מערבבים במשך לפחות 5 דקות על ידי היפוך הצינורות למעלה ולמטה.
- ספין בצנטריפוגות ב 17,000 XG במשך 5 דקות בRT. יוצקים את supernatant. הוסף 200 μl של 70% אתנול. לנער במשך 5 דקות לפחות.
- צנטריפוגה ב17,000 XG במשך 5 דקות. הסר supernatant עם Pipetman (לא לשפוך את). ייבש את הכדור בתא חם (37 מעלות צלזיוס) במשך 15-30 דקות.
- גלולה גלולה ב100 μlpH הנמוך TE 8.0 או מים באמצעות טיפים רחבים נשא מסוננים. שים ב -55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ועל 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה להמסה נכונה. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- השתמש μl 1 של ה- DNA לתגובת PCR (תערובת תגובת 50 μl המכילה 1 μl של DNA זנב, 2.5 μl DMSO, 10:00 של כל צבע יסוד, 25 מיקרומטר של כל dNTP, וbetaine 1M). פריימרים PCR לgenotyping וזיהוי מין רשומים בטבלת חומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה מציג תוצאות נציג שניתן להשיג בעבודה עם R26-BIZ (Z RES-τlac L- אני B) וR26-GTT (G FP- TT C) אללים. כאן אנו משתמשים R26-BIZ ואללים R26-GTT לנתח את ההבשלה של המעגלים העצביים המסדירים את ציר הרבייה. הרבייה בבעלי החוליות נשלטת מרכזית על ידי קבוצה קטנה של תאי עצב בהיפותלמוס, שמפרישים הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH). Kisspeptin, activator חזק של נוירונים GnRH, היה מעורב בהסדרת פעילותם של נוירונים GnRH, עם זאת, כאשר המעגלים העצביים בין תאי עצב GnRH וkisspeptin הוקמו במוח העכבר הנקבה מתפתח לא היה ידוע 5. ראשית עלינו להראות שביטוי של transgenes BIZ וGTT מופעל במיוחד על ידי רקומבינציה Cre תלויה בעוברינוירונים kisspeptin בגרעין מקושת (ARC) (איור 2) באמצעות קו נהג Cre kisspeptin ספציפי 10. לאחר מכן, אנו מראים כי תאי עצב kisspeptin בARC כבר לתקשר עם תת-קבוצה ספציפית של נוירונים GnRH ברחם (איור 3 א ', ב'). יתר על כן, אנו מראים כי תאי עצב ARC kisspeptin הם במעלה הזרם של נוירונים GnRH (איור 3 א, ג). יחד נלקח הממצאים שלנו מצביעים על כך שהמעגלים העצביים בין תאי העצב וkisspeptin GnRH הוקמו ואופרטיבי במוח העכבר הנקבה לפני הלידה באופן מלא.
איור 1:. העברת Transsynaptic של קליעים נותבים בגישות קונבנציונליות או גנטיות בגישה הקונבנציונלית, נותב transsynaptic הוא נלקח על ידי כל תאי העצב באזור ההזרקה ובכך פוטנציאל תיוג מסלולים שאינם קשורים שאינם ספציפיים. בהגישה הגנטית, נותב באה לידי ביטוי באופן סלקטיבי על ידי תאי עצב מוגדרים גנטי ובכך במיוחד חזותי נוירונים מחוברים לתאי המבטאים-נותב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הפעלה נאמנה של BIZ וtransgene GTT בנוירונים ARC kisspeptin עובריים. (א) אסטרטגית רבייה כדי להפעיל BIZ וביטוי GTT בנוירונים kisspeptin. אנחנו גידלנו עכברי R26-BIZ וR26-GTT עם Kisspeptin-IRES-Cre עכברי 10 (KissIC), שבו Cre-recombinase בא לידי ביטוי בשליטה של אמרגן Kiss1. פעילות (CE) האנזימטית β-gal מזהה את הייצור נותב תאים ומוגבלים לARC במוח של KissIC / R נקבהעובר 26-BIZ ביום עוברי (E) 18.5. (FG) immunofluorescence זוגי לkisspeptin (ירוק) וBL (אדום) (F) או GTT (אדום) (G) מדגים הפעלה נאמן ביטוי BL או GTT על ידי תיווך Cre רקומבינציה בkisspeptin נוירונים בKissIC / R26-BIZ או KissIC / R26-GTT עוברי עכבר נקבה, בהתאמה. ברים סולם (C) 500 מיקרומטר, (D) 200 מיקרומטר, (F, G) 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: תאי עצב GnRH synaptically מחוברים ולמורד זרם של kisspeptin נוירונים. () מעקב קומבינטורית גנטי דו-כיווני transsynaptic. בעוד τlaCZ מוגבל לתאי עצב kisspeptin Cre להביע, BL מועבר transsynaptically במעלה הזרם (presynaptic) ותאי עצב במורד הזרם (postsynaptic) בעכברי KissIC / R26-BIZ. בניגוד לכך, GFP-TTC מועבר transsynaptically לתאי עצב presynaptic, אבל לא postsynaptic בעכברי KissIC / R26-GTT. יש נוירונים Postsynaptic סיבי האקסון τlacZ חיוביים בסביבתם הקרובה (B, C) immunofluorescence זוגי לBL (אדום; B). או GTT (אדום; C) וGnRH (ירוק) בסעיף sagittal דרך כל הראש של נקבה KissIC / R26-BIZ או עובר KissIC / R26-GTT בE18.5. (ב) שם לב כמה, אבל לא כל הנוירונים GnRH להכיל BL. נתונים אלה מראים כי תת-קבוצה של נוירונים GnRH עובריים מחוברת synaptically לקשת נוירונים kisspeptin. (ג) שים לב שאף אחד מתאי עצב GnRH להכיל GTT. העברת transsynaptic בלעדי של GTT BL אבל לא לנוירונים GnRH מוכיחה כי תאי עצב GnRHהם במורד הזרם של נוירונים kisspeptin. ברים סולם (B, C) 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| תכונות | קליעים נותבים Transsynaptic | וירוסי neurotropic |
| מצב של יישום | מבוטא transgene | הזריק מכאני |
| כיוון ההתפשטות | אנטרוגרדית, מדרדר ודו-כיווני | מדרדר ואנטרוגרדית |
| יעילות Synaptic | Multisynaptic | Multisynaptic או monosynaptic (מדרדר בלבד) |
| עוצמת אות | חלש, יורד בכל סינפסה | הגברה בכל סינפסה חזקה, אות |
| תגובה חיסונית | אף אחד; הביע כחלבון אנדוגני | תגובה חיסונית חזקה, קטלני |
| רזולוציה מרחב ובזמן | תלוי באמרגן של בחירה | מאוד סלקטיבית, בשל זריקות מכאניות באתרים בודדים |
טבלה 1: השוואה בין התכונות של קליעים נותבים transsynaptic הגנטיים ווירוסי neurotropic מהונדסים גנטי
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש להביע קליעים נותבים transsynaptic כtransgenes להתחקות המעגלים העצביים של אוכלוסיות נוירונים מוגדרות גנטי יש מספר יתרונות בהשוואה להזרקת stereotaxic של קליעים נותבים או וירוסי neurotopic. ראשית, נותב מופק כחלבון אנדוגני ולכן אינו מפיק כל תגובה חיסונית ומסלול עצבי סלקטיבית ניתן לנתח בבעלי חיים שונים עם שחזור גבוה. שנית, משום שזו שיטה לא פולשנית זה יכול להיות מנוצל כדי לאתר את המעגלים מתאי עצב אינו נגישים בקלות לזריקות stereotaxic, למשל ברחם. מגבלות כוללות יעילות נמוכה בדרך כלל בהעברת transsynaptic, אשר עלול לגרום לקשיים באיתור נותב. יתר על כן, המולקולה נותב מקבלת מדוללת בכל סינפסה. בניגוד לכך, וירוסי neurotropic לשכפל ושכפול נגיפי בתורו ואז מביא להגברת אות לאחר שחצה את סינפסה. עם זאת, שכפול נגיפי הוא גם limitat גדוליון של השימוש בוירוסי neurotropic בשל cytotoxicity ויראלי הפנימי. חלק מהתכונות של קליעים נותבים transsynaptic הגנטיים ווירוסי neurotropic מהונדסים גנטי הן בהשוואה בטבלה 1.
אללים R26-BIZ וR26-GTT משלימים אחד את השני ולהקל על ההדמיה של המעגלים העצביים של אוכלוסייה עצבית מזוהות גנטי על רקומבינציה בתיווך Cre. אמרגן R 26 הוא מאופיין היטב ומתווך ביטוי בכל מקום עם כוח צנוע 11,12. שימוש בשיטות רגישות מאוד לגילוי נותב כגון ההגברה אות tyramide מערכת (TSA) מאפשרת זיהוי של אפילו כמויות זעירות של מולקולות נותב מועברות על פני סינפסות. עוד יתרון גדול של שימוש במקדם R26 לנהוג ביטוי נותב הוא שנוירונים לבטא ברציפות לסנתז קליעים נותבים לאורך כל חייהם. זה מאפשר לנתח התבגרות מעגללתקופות זמן ממושכות 5. בניגוד לכך, זה לא אפשרי בעת שימוש בוירוסים neurotropic בשל cytotoxicity. חשוב לציין, המערכת שלנו בינארי הגנטית והשימוש של אמרגן R26 uncouples ייצור נותב מיזמים פוטנציאלי רגולציה כבדה אנדוגני נהיגה ביטוי Cre (במקרה זה, אמרגן Kiss1), אשר עשוי להיות מוסדר על ידי מגוון של גורמים גנטיים ואפיגנטיים 13. העברה מכאן transsynaptic של BL וGTT משקפת תקשורת הסינפטי בפועל בין שתי אוכלוסיות נוירונים.
רקומבינציה בתיווך Cre היא אירוע בלתי הפיך ולכן היא ממירה את ביטוי הגנים התפתחותית חולף לביטוי transgene יציב. השימוש במערכת Cre מושרה 14 עלולה לחשוף אפקט התפתחותי עקב ביטוי חולף Cre.
לסיכום, ניתן להשתמש בזני עכבר שני רומן R26-BIZ וR26-GTT לנתח הפלא ומקומימעגלי ng מגוון עצביים שעשויות להיות מורכב ממעמדות וסוגים של תאי עצב שמקורם בכל אזור במוח או אפילו מחוט השדרה באופן Cre תלוי שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
- Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
- Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
- Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
- De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
- Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
- Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67 (2005).
- Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
- Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).
