Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

भ्रूण माउस ब्रेन में ट्रेसिंग सशर्त जेनेटिक Transsynaptic

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52487
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Saarland School of Medicine

Introduction

शारीरिक पथ अनुरेखण मस्तिष्क और व्यवहार एक के बीच के रिश्ते को समझने के लिए सबसे अधिक उपयोग किया उपकरणों में से एक है। तंत्रिका सर्किट अनुरेखण प्रौद्योगिकियों में उन्नति चूहों 2 में आनुवंशिक रूप से पहचान न्यूरॉन आबादी से तंत्रिका सर्किट का पता लगाने की क्षमता के साथ neuroscientists दिया गया है। इन तकनीकी प्रगति के बावजूद यह विशेष रूप से भ्रूण परिपक्वता के दौरान तंत्रिका सर्किट के गठन को जानने के लिए चुनौती बनी हुई है। तिथि करने के लिए विकसित की अनुरेखण तरीकों में से सबसे transsynaptic tracers का stereotaxic इंजेक्शन या आनुवंशिक रूप से संशोधित neurotropic वायरस (चित्रा 1) 2,3 पर आधारित हैं क्योंकि यह है। इन तकनीकों कनेक्टिविटी के स्थानिक और लौकिक संकल्प, ऐसे विकासशील मस्तिष्क, इंजेक्शन साइट और सबसे महत्व पर इंजेक्शन के स्थल के reproducibility, संभावित सूजन में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण ट्रेसर इंजेक्शन के रूप में कई निहित सीमाओं को प्राप्त करते समयneurotropic वायरस के कारण होता tantly cytotoxicity उनके उपयोग 4 की सीमा।

एक वैकल्पिक तरीका आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों में transgenes रूप transsynaptic ट्रेसर व्यक्त करने के लिए है। हमने हाल ही में इस तकनीक को संशोधित करने और किसी भी आनुवंशिक रूप से पहचान न्यूरोनल जनसंख्या 5 की तंत्रिका सर्किट नक्शा करने के लिए एक द्विआधारी आनुवंशिक transsynaptic अनुरेखण प्रणाली विकसित की है। Cre की मध्यस्थता के बाद हमारी प्रयोगात्मक रणनीति द्विदिश ट्रेसर जौ लेक्टिन (बीएल) 6 या रोजा 26 ठिकाना से GFP (GTT) के 7 से जुड़े हुए प्रतिगामी अनुरेखक टेटनस विष टुकड़ा सी या तो व्यक्त जो दो नए तोड़े में माउस उपभेदों पर आधारित है, पुनर्संयोजन। यहाँ हम चुनिंदा kisspeptin कि उत्पादन न्यूरॉन्स में बीएल और GTT, प्रजनन अक्ष 8,9 की परिपक्वता को विनियमित करने में फंसा है कि एक न्यूरोपेप्टाइड व्यक्त करने के लिए इन माउस उपभेदों का इस्तेमाल किया। हम इस तकनीक चुंबन के विकास और परिपक्वता कल्पना करने के लिए उपयुक्त है कि दिखानामहिला माउस मस्तिष्क 5 से भ्रूण के विकास के दौरान peptin तंत्रिका circuitry।

ब्रीडिंग रणनीति

R26-बीएल IRES-τlacZ (बिज़) और R26-GFP-टीटीसी (GTT) के दरियाफ्त लाइनों तोड़े में पुनः संयोजक ROSA26 एलील ले कि उपभेदों 5 हैं। R26-बिज़ और R26-GTT alleles के कारण दो loxP साइटों 5 द्वारा flanked है जो एक मजबूत ट्रांसक्रिप्शनल रोक संकेत, की उपस्थिति के लिए transcriptionally चुप हैं। बिज़ और GTT transgene की अभिव्यक्ति ट्रांसक्रिप्शनल रोक संकेत के Cre की मध्यस्थता हटाने से सक्रिय है। R26-बिज़ और R26-GTT alleles के लिए बस एक रचनात्मक चालक लाइन के साथ पार करके स्वतंत्र रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है। संबंधित रचनात्मक और R26 alleles के लिए विश्लेषण जानवरों विषमयुग्मजी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक रचनात्मक या एक R26 एलील ले जाने littermates, क्रमशः नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, यह टी उत्पन्न करने के लिए भी संभव हैतोड़े में riple रचनात्मक, R26-बिज़ और R26-GTT एलील ले जाने जानवर, लेकिन यह एक अतिरिक्त पार की आवश्यकता होगी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: आचार कथन: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाएं हैम्बर्ग विश्वविद्यालय और सारलैंड विश्वविद्यालय के पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. तैयारी और भ्रूण ऊतक के फिक्सेशन

  1. भ्रूण काटना और जानवरों के त्याग से पहले ऊतक के बाद के निर्धारण के लिए समाधान तैयार करने की जरूरत सभी उपकरणों की व्यवस्था।
    नोट: हमेशा (7.4 पीएच को समायोजित, 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 4% पीएफए) के एक ताजा 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान तैयार है।
  2. एक नैतिकता की दृष्टि से अनुमोदित प्रक्रिया के साथ समय पर गर्भवती महिला माउस euthanize।
  3. एक मंच पर माउस स्थानांतरण। 70% इथेनॉल के साथ पेट के उदर पक्ष गीले और उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए तेज कैंची का उपयोग कर एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाते हैं।
  4. भ्रूण श्रृंखला को पहचानें और ध्यान का उपयोग कर कुंद संदंश इसे बाहर खींचने के लिए और ठंडा पीबीएस में जगह।
  5. से व्यक्तिगत भ्रूण निकालेंठीक कैंची और संदंश का उपयोग भ्रूण श्रृंखला। भ्रूण के आसपास अतिरिक्त ऊतक निकालें और ठंडा पीबीएस में उन्हें धोने।
  6. (पीएफए ​​में भ्रूण स्थानांतरित करने से पहले) एक छोटी सी पूंछ बायोप्सी लो और लिंग की पहचान और दरियाफ्त एलील जीनोटाइपिंग पीसीआर के लिए पूंछ lysis बफर में यह सेते हैं।
  7. सबसे पार्श्व पक्ष में भ्रूण से शुरू करें और एक प्रकार के बरतन पर बर्फ पर ठंडा 4% पीएफए ​​युक्त एक ट्यूब में अलग से प्रत्येक भ्रूण हस्तांतरण।
  8. लगातार झटकों के साथ E13.5 की उम्र या बर्फ पर 1.5 घंटे के लिए युवा में भ्रूण भिगोएँ। लगातार झटकों के साथ बर्फ पर 2.5 घंटे के लिए उम्र E14.5 और E15.5 में भ्रूण भिगोएँ।
  9. भ्रूण उम्र E16.5 या पुराने के लिए, सिर काटना और पीएफए ​​समाधान में सिर भिगोने से पहले बाहरी त्वचा को हटा दें। E16.5 भ्रूण के प्रमुखों लगातार झटकों के साथ बर्फ पर 4.5 घंटे के लिए भिगो जा सकता है।
  10. उचित निर्धारण के बाद, ठंडा पीबीएस के साथ भ्रूण तीन बार धोएं। वे सिंक तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस समाधान में 30% सूक्रोज में भ्रूण स्थानांतरणनीचे करने के लिए।

2. बर्फ़ीली

  1. जमने की प्रक्रिया शुरू करने से पहले सभी आवश्यक सामग्री की व्यवस्था: क्रायो-मिट्टी, क्रायो दस्ताने, फेदरवेट कीटविज्ञान संदंश, मार्कर पेन और इष्टतम काटने तापमान यौगिक (अक्टूबर)
  2. एक स्थायी शराब प्रतिरोधी मार्कर के साथ क्रायो-ढालना लेबल (ऊतक, तारीख और जीनोटाइप के उन्मुखीकरण का उल्लेख)। एक बर्फ की बाल्टी में कुचल सूखी बर्फ और 100% इथेनॉल के एक कीचड़ तैयार करें। Isopentane युक्त अंदर एक गिलास बीकर रखें। Isopentane शांत करने के लिए 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  3. इस बीच, sucrose के समाधान से ऊतक निकालने प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग ऊतक के आसपास अतिरिक्त सूक्रोज मिटा। ऊतक को कवर करने के लिए पर्याप्त अक्तूबर के साथ एक पूर्व लेबल क्रायो-मोल्ड में ऊतक स्थानांतरण। अक्टूबर में किसी भी हवाई बुलबुले से बचने; विशेष रूप से ऊतक के आसपास।
  4. ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए फेदरवेट कीटविज्ञान संदंश का उपयोग अक्टूबर में ऊतक पूरबी। क्रायो-मोल के हस्तांतरण से ठंड शुरू करेंपूर्व ठंडा isopentane स्नान में डी। यह ठीक से फ्रीज नहीं होगा के रूप में अक्टूबर में isopentane छप न करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान में नमूने लपेटें।

3. Cryosectioning

  1. एक cryostat का उपयोग कर पांच की श्रृंखला 'में 14 माइक्रोन से पतली धारावाहिक वर्गों में कटौती और immunofluorescence (यदि) के विश्लेषण के लिए SuperFrost® प्लस गिलास स्लाइड पर इकट्ठा। उपयोग किया जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर।

Tyramide संकेत प्रवर्धन (टीएसए) प्रोटोकॉल का उपयोग 4. अनुरेखक दृश्य

  1. धुंधला के लिए आवश्यक buffers और अभिकर्मकों तैयार करें। हमेशा हौसले उपयोग की दिन पर Tris-nacl-बीच (टीएनटी) बफर तैयार करते हैं।
    1. 1 एल के अंतिम मात्रा अप करने के लिए एक एक एमएल पिपेट का उपयोग बीच 20 के 500 μl जोड़ें 1 एम Tris-एचसीएल का पीएच 7.5, 5 एम NaCl के 30 मिलीग्राम और DDH 2 हे 100 मिलीलीटर का उपयोग कर टीएनटी बफर तैयार करें। धीरे-धीरे बीच 20 जोड़ें और सभी बीच 20 में है कि यह सुनिश्चित करने के लिए और कई बार नीचे पिपेट फ्लशसमाधान।
    2. Tris-nacl-अवरुद्ध 1 एल के अंतिम मात्रा पीएच 7.5, 5 एम NaCl के 30 मिलीग्राम और DDH 2 हे 1 एम Tris-एचसीएल के 100 मिलीलीटर का उपयोग कर (TNB) बफर अभिकर्मक को अवरूध्द 5 ग्राम जोड़ें तैयार करें (के साथ प्रदान की धीरे-धीरे बफर करने के लिए छोटे वेतन वृद्धि में किट) सरगर्मी है। (यह 30-60 मिनट से अधिक समय नहीं लेना चाहिए) पूरी तरह से अवरुद्ध अभिकर्मक भंग करने के लिए निरंतर क्रियाशीलता के साथ 55 डिग्री सेल्सियस के लिए धीरे-धीरे समाधान हीट। समरूप हीटिंग 55 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान का उपयोग हासिल करने के लिए। समाधान दूधिया दिखाई देगा। उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान का हल लाओ। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान।
    3. आण्विक जीव विज्ञान / एचपीएलसी ग्रेड DMSO में (किट के साथ प्रदान की) बायोटिन tyramide अभिकर्मक पुनर्गठित। जिस पर निर्भर करता है कि किट DMSO के उचित मात्रा में भिन्न हो सकते हैं प्रयोग किया जाता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान स्टोर।
      नोट: संबंधित रचनात्मक और R26 alleles के लिए विषमयुग्मजी जानवरों से धारा सर्किट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उपयोग हैections नकारात्मक नियंत्रण के रूप में क्रमश: एक रचनात्मक या एक R26 एलील, ले जाने littermates से। वास्तव में डबल विषमयुग्मजी जानवरों से स्लाइड की तरह नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड समझो। इसके अलावा, एक डबल विषमयुग्मजी जानवर से एक नियंत्रण स्लाइड शामिल हैं, लेकिन टीएसए अभिकर्मक (unamplified नियंत्रण) बाहर छोड़ दें।
  2. एक तेज ताजा स्केलपेल ऊतक वर्गों के आसपास के अतिरिक्त अक्टूबर को हटाने और एक पैप कलम के साथ वर्गों के आसपास सीमा चिह्न का उपयोग करना।
  3. कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट (आरटी) के लिए स्लाइड सूखी। 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीएनटी के साथ आर टी 3x पर स्लाइड धो लें। अंतर्जात peroxidase गतिविधि बुझाने के लिए 0.3% में 30 मिनट के लिए ठंडा मेथनॉल में एच 2 ओ 2 समाधान आरटी पर स्लाइड सेते हैं।
  4. 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ धो 3x आरटी पर प्रत्येक। ऊतक permeabilization के लिए पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स 100 में 10 मिनट के लिए सेते हैं। 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीएनटी के साथ आर टी 3x पर स्लाइड धो लें।
  5. TNB के साथ ब्लॉक 30 के लिए (स्लाइड प्रति, 200-300 μl अवरुद्ध समाधान)एक humidified कक्ष में आरटी पर मि। सभी वर्गों के लिए पूरी तरह से TNB द्वारा कवर कर रहे हैं सुनिश्चित करें। स्लाइड कदम के बीच में बाहर सूखी मत देना।
  6. अतिरिक्त अवरुद्ध बफर बंद नाली और दरियाफ्त पहचानने प्राथमिक सीरमरोधी लागू आरटी पर या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए TNB में पतला (1: GTT के लिए 15,000 खरगोश विरोधी GFP: बीएल के लिए 1000 बकरी विरोधी WGA, 1)। पूरी तरह से ऊतक खंड (स्लाइड प्रति 200-300 μl) को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।
    नोट: यहाँ सिफारिश की प्राथमिक antisera dilutions के लिए समायोजित किया जा सकता है।
  7. 5 मिनट के आंदोलन के साथ प्रत्येक के लिए टीएनटी के साथ आर टी 3x पर स्लाइड धो लें।
  8. (एंटी WGA के लिए 500 घोड़े विरोधी बकरी आईजीजी, 1: आरटी पर 1 घंटे के लिए TNB में विरोधी GFP के लिए 5000 बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी 1) पहली सीरमरोधी के मेजबान पहचानने biotinylated माध्यमिक सीरमरोधी के साथ वर्गों सेते हैं।
  9. 5 मिनट के आंदोलन के साथ प्रत्येक के लिए आरटी पर टीएनटी के साथ धोने 3x। 100 streptavidin (एसए) संयुग्मित हॉर्सरैडिश peroxidase (एसए एचआरपी, बशर्ते वाई: 1 में सेतेएक humidified कक्ष में आरटी पर 30 मिनट के लिए TNB में किट) वें। 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीएनटी के साथ आर टी 3x पर स्लाइड धो लें। इस बीच टीएसए पिघलना।
  10. (किट के साथ प्रदान; बीएल के दृश्य और GTT के लिए टीएसए + किट के लिए टीएसए किट का उपयोग करें) टीएसए प्रवर्धन मंदक में टीएसए 01:50 पतला। आरटी पर ठीक 10 मिनट के लिए पतला टीएसए में ऊतक वर्गों सेते हैं। भविष्य प्रयोगों के लिए किसी भी शेष पतला टीएसए अभिकर्मक का उपयोग नहीं करते, आदर्श पिछले धोने कदम के दौरान, बस का उपयोग करने से पहले टीएसए पतला; हमेशा ताजा तैयार करते हैं।
  11. 5 मिनट के आंदोलन के साथ प्रत्येक के लिए टीएनटी के साथ आर टी 3x पर स्लाइड धो लें। आरटी पर 30 मिनट के लिए TNB में 500 एलेक्सा Fluor® 546 streptavidin संयुग्म: 1 के साथ सेते हैं। 5 मिनट के आंदोलन के साथ प्रत्येक के लिए टीएनटी के साथ आर टी 3x पर स्लाइड धो लें।
  12. परमाणु धुंधला के लिए आरटी पर पीबीएस में 5% bisbenzimide समाधान में 10 मिनट के लिए सेते हैं। 5 मिनट के आंदोलन के साथ प्रत्येक के लिए टीएनटी के साथ आर टी 3x पर स्लाइड धो लें। Fluromount जी के साथ माउंट और epifluorescence या confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करते हैं।
    ROSA26 ठिकाना की अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करती है और तंत्रिका सर्किट पर (ट्रेसर, अभिसरण आदि के उत्पादन न्यूरॉन्स की जैसे संख्या) का विश्लेषण किया जाएगा। इसलिए यहाँ की सिफारिश की प्राथमिक antisera dilutions के कम या अधिक संकेत को रोकने के लिए समायोजित किया जा सकता है। पृष्ठभूमि हमेशा उचित नियंत्रण स्लाइड्स (ऊपर देखें) का उपयोग कर विश्लेषण किया जाना चाहिए।

भ्रूण वर्गों के लिए 5. τlacZ धुंधला

  1. धुंधला के लिए आवश्यक buffers और अभिकर्मकों तैयार करें। हमेशा हौसले उपयोग करने से पहले lacZ बफर सी तैयार करते हैं।
    1. 1 मिलीलीटर 70% Dimethylformamide (DMF) के लिए एक्स-लड़की की 40 ग्राम जोड़कर 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-indolyl-β-डी-galactopyranoside (एक्स-लड़की) शेयर समाधान (40 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ कवर किया।
    2. तैयार करें नाइट्रो नीले tetrazolium (एनबीटी) सेंट1 मिलीलीटर 70% DMF के लिए एनबीटी की 50 ग्राम जोड़कर ock समाधान (50 मिलीग्राम / एमएल)। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ कवर किया।
    3. LacZ 25% glutaraldehyde के 80 μl, 4% की 5 मिलीलीटर पीएफए, एक मीटर के 20 μl का उपयोग कर 2 MgCl, 500 मिमी EGTA के 100 μl, एक अंतिम करने के लिए एक 1 एम फॉस्फेट बफर पीएच 7.4 मिलीलीटर और DDH 2 ओ लगानेवाला तैयार करें 10 मिलीलीटर की मात्रा।
    4. LacZ 500 मिमी EGTA के 5 मिलीलीटर, 500 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा अप करने के लिए 50 मिलीलीटर DDH फॉस्फेट बफर 7.4 पीएच 1 एम के और 2 हे, 2 MgCl एक मीटर की एक का उपयोग कर एक मिलीलीटर बफर तैयार।
    5. 1 मिलीलीटर 1 एम के 2 MgCl, 500 मिमी EGTA के 5 मिलीलीटर, 5 मिलीलीटर 1% की सोडियम deoxycholate, 10% एनपी-40 की 100 मिलीलीटर, 50 1 एम फॉस्फेट बफर पीएच 7.4 मिलीलीटर और DDH 2 ओ का उपयोग कर lacZ बफर बी तैयार करें 500 एमएल की अंतिम मात्रा पर निर्भर है।
    6. एनबीटी स्टॉक समाधान के 10 μl और lacZ बफर बी के 1 मिलीलीटर के लिए एक्स-लड़की शेयर समाधान के 12.5 μl बस का उपयोग करने से पहले ताजा बनाओ और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर जोड़कर lacZ बफर सी तैयार करें।
    7. (इस बीच एक पैप कलम के साथ स्लाइड तैयार) में कम से कम 10-15 मिनट के लिए आरटी पर स्लाइड सूखी।
    8. LacZ साथ खंड एक रासायनिक धूआं हुड के अंदर एक humidified कक्ष में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए लगानेवाला को ठीक करें। पीबीएस के साथ तीन बार धोएं 2 मिमी 2 MgCl के साथ पूरक।
    9. LacZ साथ स्लाइड आरटी पर 10 मिनट प्रत्येक के लिए एक 3 बार बफर धो lacZ बफर ए के साथ स्लाइड कुल्ला। 5 मिनट प्रत्येक के लिए lacZ बफर बी के साथ दो बार धोएं। एक humidified कक्ष में 6 घंटा या रात भर के लिए 30-37 डिग्री सेल्सियस पर lacZ बफर सी में स्लाइड्स सेते हैं।
      नोट: lacZ बफर सी की पर्याप्त मात्रा जोड़ें; स्लाइड ऊष्मायन के दौरान बाहर सूखी नहीं होना चाहिए।
    10. उपयुक्त ऊष्मायन के बाद पीबीएस के साथ स्लाइड 2 मिमी 2 MgCl के साथ पूरक धो लें। संक्षेप में DDH 2 ओ के साथ वर्गों कुल्ला मेयर के ग्लाइसिन जिलेटिन के साथ coverslip। एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) इमेजिंग सेट अप के साथ सुसज्जित एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए उपयुक्त है।

    6. Gendएर और अनुरेखक जीनोटाइपिंग

    1. 1 एम Tris-एचसीएल का पीएच 8.5, 500 मिमी EGTA के 100 μl 1 मिलीलीटर का उपयोग कर पूंछ lysis बफर तैयार, 10% एसडीएस के 200 μl, 5 एम NaCl और DDH 2 ओ के 400 μl 10 एमएल की अंतिम मात्रा को बनाने के लिए।
    2. एक पूंछ बायोप्सी युक्त प्रत्येक Eppendorf ट्यूब पूंछ lysis बफर के 500 μl जोड़ें। 100 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता proteinase कश्मीर जोड़ें। 55 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन पर रातोंरात सेते हैं।
    3. आरटी पर 10 मिनट के लिए 17,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने हैं। एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। सतह पर तैरनेवाला को isopropanol के 500 μl जोड़ें। ऊपर और नीचे ट्यूब inverting से कम से कम 5 मिनट के लिए मिश्रण।
    4. आरटी पर 5 मिनट के लिए 17,000 XG पर अपकेंद्रित्र में स्पिन। सतह पर तैरनेवाला बंद डालो। 70% इथेनॉल के 200 μl जोड़ें। कम से कम 5 मिनट के लिए हिला।
    5. 5 मिनट के लिए 17,000 XG पर अपकेंद्रित्र। एक Pipetman (टपकना नहीं है) के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें। 15-30 मिनट के लिए एक गर्म चैम्बर (37 डिग्री सेल्सियस) में गोली सूखी।
    6. 100 μl में resuspend गोलीविस्तृत बोर फ़िल्टर्ड सुझावों का उपयोग करने का कम ते पीएच 8.0 या पानी। उचित भंग के लिए रात भर सी 1 घंटे के लिए और 37 डिग्री पर 55 डिग्री सेल्सियस में डाल दिया। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    7. पीसीआर प्रतिक्रिया (पूंछ डीएनए के एक μl, प्रत्येक प्राइमर के 2.5 μl DMSO के, 10 बजे, 25 प्रत्येक dNTP की माइक्रोन, और 1M betaine युक्त 50 μl प्रतिक्रिया मिश्रण) के लिए डीएनए के एक μl का प्रयोग करें। जीनोटाइपिंग और लिंग की पहचान के लिए पीसीआर प्राइमरों सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यह खंड R26-बिज़ (बी एल मैं आरईएस-τlac जेड) और R26-GTT (जी FP- टीटी सी) alleles के साथ काम कर प्राप्त किया जा सकता है कि प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है। यहाँ हम प्रजनन धुरी के विनियमन तंत्रिका सर्किट की परिपक्वता का विश्लेषण करने के लिए R26-बिज़ और R26-GTT एलील का उपयोग करें। रीढ़ में प्रजनन केन्द्र gonadotropin हार्मोन जारी (GnRH) का स्राव जो हाइपोथेलेमस में न्यूरॉन्स, के एक छोटे सबसेट द्वारा नियंत्रित किया जाता है। Kisspeptin, GnRH न्यूरॉन्स की एक शक्तिशाली उत्प्रेरक, GnRH और kisspeptin न्यूरॉन्स के बीच तंत्रिका सर्किट 5 ज्ञात नहीं था विकासशील महिला माउस मस्तिष्क में स्थापित कर रहे हैं, लेकिन जब GnRH न्यूरॉन्स की गतिविधियों को विनियमित करने में फंसा दिया गया है। पहले हम बिज़ और GTT transgenes की अभिव्यक्ति विशेष रूप से भ्रूण में Cre निर्भर पुनर्संयोजन द्वारा सक्रिय कर रहे हैं बताते हैं किएक kisspeptin-विशिष्ट रचनात्मक चालक लाइन 10 का उपयोग कर धनुषाकार नाभिक (एआरसी) (चित्रा 2) में kisspeptin न्यूरॉन्स। हम तो पहले से ही एआरसी में है कि kisspeptin न्यूरॉन्स का प्रदर्शन utero में GnRH न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट सबसेट (चित्रा 3 ए, बी) के साथ संवाद। इसके अलावा, हम एआरसी kisspeptin न्यूरॉन्स GnRH न्यूरॉन्स (चित्रा 3 ए, सी) के अपस्ट्रीम दिखा रहे हैं। में ले ली एक साथ हमारे निष्कर्ष kisspeptin और GnRH न्यूरॉन्स के बीच तंत्रिका सर्किट पूरी तरह से स्थापित और महिला माउस मस्तिष्क में ऑपरेटिव जन्म से पहले कर रहे हैं कि संकेत मिलता है।

चित्रा 1
चित्रा 1:। पारंपरिक या आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग कर tracers का Transsynaptic स्थानांतरण परंपरागत दृष्टिकोण में, एक transsynaptic ट्रेसर इस प्रकार संभावित गैर विशिष्ट असंबंधित रास्ते लेबलिंग इंजेक्शन स्थल पर सभी न्यूरॉन्स द्वारा लिया जाता है। मेंआनुवंशिक दृष्टिकोण, ट्रेसर चुनिंदा इस प्रकार विशेष रूप से दरियाफ्त व्यक्त कोशिकाओं से जुड़ा न्यूरॉन्स visualizing आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरॉन्स द्वारा व्यक्त की है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2: भ्रूण एआरसी kisspeptin न्यूरॉन्स में बिज़ और GTT transgene की वफादारों सक्रियण। (ए) ब्रीडिंग रणनीति kisspeptin न्यूरॉन्स में बिज़ और GTT अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए। हम रचनात्मक-recombinase Kiss1 प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है, जिसमें Kisspeptin-IRES-Cre (KissIC) चूहों 10, के साथ R26-बिज़ और R26-GTT चूहों पैदा की। (सीई) β-लड़की enzymatic गतिविधि को पहचानती है ट्रेसर उत्पादक कोशिकाओं और एक महिला KissIC / आर के मस्तिष्क में एआरसी के लिए प्रतिबंधित हैभ्रूण दिन (ई) 18.5। (FG) kisspeptin (हरा) के लिए डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस और बीएल (लाल) (एफ) या GTT (लाल) (जी) के 26-बिज़ भ्रूण Cre की मध्यस्थता से बीएल या GTT अभिव्यक्ति के वफादार सक्रियण दर्शाता क्रमश: KissIC / R26-बिज़ या KissIC / R26-GTT महिला माउस भ्रूण में न्यूरॉन्स kisspeptin में पुनर्संयोजन। स्केल सलाखों (सी) 500 माइक्रोन, (डी) 200 माइक्रोन, (च, छ) 50 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3: GnRH न्यूरॉन्स synaptically से जुड़ा है और न्यूरॉन्स kisspeptin के बहाव कर रहे हैं। (ए) मिश्रित आनुवंशिक द्विदिश transsynaptic ट्रेसिंग। Τla जबकिCZ Cre व्यक्त kisspeptin न्यूरॉन्स तक ही सीमित है, बीएल transsynaptically (प्रीसानेप्टिक) नदी के ऊपर करने के लिए स्थानांतरित किया जाता है और KissIC / R26-बिज़ चूहों में नीचे की ओर (पोस्टअन्तर्ग्रथनी) न्यूरॉन्स। इसके विपरीत, GFP टीटीसी transsynaptically KissIC / R26-GTT चूहों में प्रीसानेप्टिक, लेकिन पोस्टअन्तर्ग्रथनी नहीं न्यूरॉन्स को सौंप दिया है। Postsynaptic न्यूरॉन्स उनके पास के इलाके में τlacZ पॉजिटिव अक्षतंतु फाइबर है (बी, सी) बीएल (लाल, बी) के लिए डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस।; एक महिला के पूरे सिर के माध्यम से एक बाण के समान खंड पर और GnRH (हरा) या GTT (सी लाल) KissIC / R26-बिज़ या E18.5 पर KissIC / R26-GTT भ्रूण। (बी) कि कुछ नोट नहीं, बल्कि सभी GnRH न्यूरॉन्स बीएल होते हैं। इन आंकड़ों भ्रूण GnRH न्यूरॉन्स की एक सबसेट synaptically kisspeptin न्यूरॉन्स चाप से जुड़ा है कि प्रदर्शित करता है। (सी) GnRH न्यूरॉन्स में से कोई भी GTT होते हैं कि ध्यान दें। GnRH न्यूरॉन्स के लिए बीएल लेकिन नहीं GTT के विशेष transsynaptic हस्तांतरण कि GnRH न्यूरॉन्स को दर्शाता हैkisspeptin न्यूरॉन्स के बहाव कर रहे हैं। स्केल सलाखों (बी, सी) 50 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विशेषताएं Transsynaptic ट्रेसर Neurotropic वायरस
आवेदन की विधि एक transgene के रूप में अभिव्यक्त यंत्रवत् इंजेक्ट
प्रसार की दिशा अग्रगामी, पतित और द्विदिश प्रतिगामी और अग्रगामी
Synaptic प्रभावकारिता Multisynaptic Multisynaptic या monosynaptic (केवल प्रतिगामी)
सिग्नल की शक्ति कमजोर, हर अन्तर्ग्रथन में कम हो जाती है हर अन्तर्ग्रथन में सशक्त, संकेत प्रवर्धन
प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कोई नहीं; अंतर्जात प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, घातक
स्थानिक और लौकिक संकल्प चुनाव के प्रमोटर पर निर्भर करता है कारण अलग-अलग स्थलों पर यांत्रिक इंजेक्शन के लिए अत्यधिक चयनात्मक

तालिका 1: आनुवंशिक transsynaptic ट्रेसर की सुविधाओं की तुलना और आनुवंशिक रूप से संशोधित neurotropic वायरस

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

आनुवंशिक रूप से परिभाषित neuronal आबादी के तंत्रिका सर्किट का पता लगाने के लिए ट्रांसजीन रूप transsynaptic ट्रेसर जताते ट्रेसर या neurotopic वायरस के stereotaxic इंजेक्शन की तुलना में कई फायदे हैं। सबसे पहले, ट्रेसर एक अंतर्जात प्रोटीन के रूप में उत्पादन किया जाता है और इसलिए किसी भी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना नहीं करता है और एक चयनात्मक तंत्रिका मार्ग उच्च reproducibility के साथ विभिन्न जानवरों में विश्लेषण किया जा सकता है। यह एक गैर इनवेसिव विधि है, क्योंकि दूसरा, यह utero में, उदाहरण के लिए, stereotaxic इंजेक्शन के लिए आसानी से सुलभ नहीं न्यूरॉन्स से सर्किट का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है। सीमाएं ट्रेसर का पता लगाने में कठिनाइयों में हो सकता है, जो transsynaptic हस्तांतरण में एक आम तौर पर कम प्रभावकारिता, शामिल हैं। इसके अलावा, ट्रेसर अणु हर अन्तर्ग्रथन पर पतला हो जाता है। इसके विपरीत, neurotropic वायरस को दोहराने और बदले में वायरल प्रतिकृति तो अन्तर्ग्रथन पार करने के बाद प्रवर्धन का संकेत होता है। हालांकि, वायरल प्रतिकृति भी एक प्रमुख limitat हैकारण आंतरिक वायरल cytotoxicity को neurotropic वायरस के उपयोग की आयन। आनुवंशिक transsynaptic tracers और आनुवंशिक रूप से संशोधित neurotropic वायरस की कुछ विशेषताएं तालिका 1 में तुलना कर रहे हैं।

R26-बिज़ और R26-GTT alleles के एक दूसरे के पूरक और रचनात्मक मध्यस्थता पुनर्संयोजन पर एक आनुवंशिक रूप से पहचान न्यूरोनल जनसंख्या का तंत्रिका सर्किट के दृश्य की सुविधा। आर 26 प्रमोटर अच्छी तरह से पहचाना जाता है और मामूली ताकत 11,12 साथ सर्वव्यापक अभिव्यक्ति मध्यस्थता करता है। ऐसे tyramide संकेत प्रवर्धन के रूप में दरियाफ्त का पता लगाने के लिए अत्यधिक संवेदनशील विधियों का प्रयोग (टीएसए) प्रणाली अन्तर्ग्रथन भर में स्थानांतरित ट्रेसर अणुओं की भी मिनट मात्रा की पहचान के लिए अनुमति देता है। दरियाफ्त अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए R26 प्रमोटर का उपयोग करने का एक अन्य प्रमुख लाभ व्यक्त न्यूरॉन्स लगातार उनके जीवन भर ट्रेसर synthesize है। इस सर्किट परिपक्वता का विश्लेषण करने के लिए यह संभव बनाता हैलंबे समय तक समय अवधि 5 के लिए। उनके cytotoxicity के कारण neurotropic वायरस का उपयोग करते समय इसके विपरीत, यह संभव नहीं है। महत्वपूर्ण बात है, हमारे द्विआधारी आनुवंशिक प्रणाली और R26 प्रमोटर के उपयोग के आनुवंशिक और epigenetic 13 कारकों की एक किस्म के द्वारा विनियमित किया जा सकता है, जो रचनात्मक अभिव्यक्ति ड्राइविंग संभावित भारी विनियमित अंतर्जात प्रमोटरों (इस मामले में, Kiss1 प्रमोटर), से दरियाफ्त उत्पादन uncouples। बीएल और GTT की इसलिए transsynaptic हस्तांतरण दो neuronal आबादी के बीच वास्तविक अन्तर्ग्रथनी संचार को दर्शाता है।

रचनात्मक मध्यस्थता पुनर्संयोजन एक अपरिवर्तनीय घटना है और इसलिए यह स्थिर transgene अभिव्यक्ति में विकासात्मक क्षणिक जीन अभिव्यक्ति धर्मान्तरित। एक inducible Cre प्रणाली 14 के उपयोग के संभावित कारण क्षणिक रचनात्मक अभिव्यक्ति के लिए एक विकासात्मक प्रभाव नकाब उतारना कर सकते हैं।

अंत में, दो उपन्यास R26-बिज़ और R26-GTT माउस उपभेदों स्थानीय और लो का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैविभिन्न वर्गों और किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र से या यहां तक ​​कि एक रचनात्मक निर्भर तरीके से रीढ़ की हड्डी से होने वाले न्यूरॉन्स के प्रकार से बना हो सकता है कि एनजी सीमा तंत्रिका सर्किट।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) Sigma 14530-100MG
Ethanol Sigma 32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way) Polyscience Inc. 18646A-1 22 x 22 x 20mm
DMSO Sigma D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF) VWR Chemicals 23470,293
EGTA ROTH 3054.3
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glutaraldehyde Sigma G5882-50ML
Hydrogen peroxide Sigma 34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane) Sigma M32631-2.5L
Kaiser's glycine gelatin Merck 1092420100
Methanol Sigma 494437-1L
MgCl2 Sigma M2670-100G
NaCl ROTH HN00.2
NBT Sigma 298-83-9
Nonidet P40 substitute Fluka 743.85
OCT Leica 14020108926
PAP pen Dako S2002
Parafarmaldehyde Sigma P6148-1KG
Sodium deoxycholate Sigma D6750-25G
Sucrose Sigma S7903-1KG
Superfrost slides Thermo Scientific FT4981GLPLUS
TSA kit PerkinElmer NEL700
TSA plus kit PerkinElmer NEL749A001KT
Tris ROTH AE15.2
Triton-X 100 ROTH 3051.2
Tween 20 ROTH 9127.1
X-gal ROTH 2315.1
Cryostat Leica na
Light microscope equipped with DIC imaging Zeiss Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope Zeiss Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop Adobe PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL) Vector Laboatories AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG Vector Laboatories BA-9500
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboatories BA-1000
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) Invitrogen A11122
Rabbit anti-GnRH Affinity Bio Reagent PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG Thermo Scientific SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546 Life Technologies S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping) Eurofins MWG Operon ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (for BIZ genotyping) Eurofins MWG Operon AGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (for Cre genotyping) Eurofins MWG Operon GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (for Cre genotyping) Eurofins MWG Operon CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (for GTT genotyping) Eurofins MWG Operon AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (for GTT genotyping) Eurofins MWG Operon GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (for gender genotyping) Eurofins MWG Operon TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (for gender genotyping) Eurofins MWG Operon CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd Eurofins MWG Operon CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev Eurofins MWG Operon GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev Eurofins MWG Operon CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
  2. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  3. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  4. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
  5. Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
  6. Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
  7. Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
  8. De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
  9. Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
  10. Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
  11. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
  12. Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67 (2005).
  13. Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
  14. Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 94 तंत्रिका विज्ञान लक्षित कर विकासात्मक जीव विज्ञान तंत्रिका सर्किट transsynaptic ट्रेसिंग जौ लेक्टिन टेटनस विष टुकड़ा सी माउस भ्रूण जीन, kisspeptin GnRH प्रजनन
भ्रूण माउस ब्रेन में ट्रेसिंग सशर्त जेनेटिक Transsynaptic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, D., Boehm, U. Conditional… More

Kumar, D., Boehm, U. Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain. J. Vis. Exp. (94), e52487, doi:10.3791/52487 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter