Introduction
Anatomico percorso tracciato è uno degli strumenti più comunemente utilizzati per decifrare il rapporto tra cervello e comportamento 1. Avanzamento in tecnologie dei circuiti neurali tracciatura ha concesso neuroscienziati con la possibilità di ricostruire i circuiti neurali da popolazioni di neuroni geneticamente identificati nei topi 2. Nonostante questi progressi tecnici rimane difficile da svelare la formazione dei circuiti neurali soprattutto durante la maturazione embrionale. Questo perché la maggior parte dei metodi di tracciamento sviluppati fino ad oggi sono basate su iniezione stereotassica di rivelatori transsynaptic o virus neurotropici geneticamente modificati (Figura 1) 2,3. Mentre queste tecniche raggiungono risoluzione spaziale e temporale della connettività, alcuni limiti intrinseci, come tecnicamente impegnativi iniezioni traccianti nel cervello in via di sviluppo, la riproducibilità del sito di iniezione, potenziale infiammazione al sito di iniezione e più importanza citotossicità causata da virus neurotropici limitare il loro utilizzo 4.
Un metodo alternativo è quello di esprimere i traccianti transsynaptic come transgeni in topi geneticamente modificati. Abbiamo recentemente modificato questa tecnica e sviluppato un sistema binario transsynaptic genetico analisi per mappare i circuiti neurali di qualsiasi popolazione neuronale geneticamente identificato 5. La nostra strategia sperimentale si basa su due nuovi ceppi di topi knock-in, che esprimono sia la lectina bidirezionale tracciante orzo (BL) 6 o il tracciante retrogrado tossina tetanica frammento C fusa a GFP (GTT) 7 dalla ROSA 26 locus dopo Cre-mediata ricombinazione. Qui abbiamo usato questi ceppi di topi per esprimere selettivamente BL e GTT in neuroni che producono kisspeptin, un neuropeptide che è implicato nella regolazione della maturazione dell'asse riproduttivo 8,9. Dimostriamo che questa tecnica è adatta per visualizzare lo sviluppo e la maturazione del baciopeptin circuiti neurali durante lo sviluppo embrionale del topo cervello femminile 5.
Strategia di allevamento
La R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) e R26-GFP-TTC (GTT) linee traccianti sono knock-in ceppi 5 che portano alleli ROSA26 ricombinanti. La R26-BIZ e gli alleli R26-GTT sono trascrizionalmente silente a causa della presenza di un forte segnale di arresto della trascrizione, che è affiancato da due siti loxP 5. Espressione del transgene BIZ e GTT è attivato dalla rimozione Cre-mediata del segnale di arresto trascrizionale. Gli alleli R26-BIZ e R26-GTT possono essere utilizzati indipendentemente attraversando semplicemente con una linea pilota Cre. Per gli animali di analisi eterozigoti per i rispettivi alleli Cre e R26 può essere utilizzato. Nidiata che trasportano una Cre o un allele R26, rispettivamente, dovrebbero essere utilizzati come controlli. In alternativa, è anche possibile generare tRiple knock-in animali portatori degli alleli Cre, R26-BIZ e R26-GTT, tuttavia ciò richiederà una croce supplementare.
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Protocol
NOTA: Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato il benessere degli animali dell'Università di Amburgo e l'Università di Saarland.
1. Preparazione e fissaggio del tessuto embrionale
- Disporre tutte le attrezzature necessarie per sezionare gli embrioni e preparare soluzioni per il successivo fissaggio del tessuto prima di sacrificare gli animali.
NOTA: preparare sempre una soluzione fresca 4% paraformaldeide (PFA) (4% PFA in 0.1 M tampone fosfato salino (PBS), regolare il pH a 7,4). - Euthanize cronometrato femmina incinta mouse con una procedura eticamente approvati.
- Trasferire il mouse su una piattaforma. Bagnare la parte ventrale dell'addome con il 70% di etanolo e fare una incisione verticale usando forbici affilate per esporre la cavità addominale.
- Identificare la catena embrionale ed estrarlo con cautela utilizzando una pinza smussato e metterlo in ghiaccio freddo PBS.
- Rimuovere i singoli embrioni dala catena embrionale con le forbici sottili e pinze. Rimuovere il tessuto in più intorno gli embrioni e lavarli in ghiacciata PBS.
- Prendete una piccola biopsia coda (prima di trasferire l'embrione in PFA) e incubare in coda tampone di lisi per l'identificazione di genere e tracciante allele genotipizzazione PCR.
- Avviare dall'embrione al lato più laterale e trasferire ogni embrione separatamente in una provetta contenente ghiacciata 4% PFA su ghiaccio su un agitatore.
- Immergere gli embrioni all'età di E13.5 o più giovani per 1,5 ore sul ghiaccio con costante agitazione. Immergere gli embrioni a E14.5 età e E15.5 per 2,5 ore sul ghiaccio con costante agitazione.
- Per E16.5 embrioni età o più anziani, decapitate e togliere la pelle esterna prima immersione della testa in soluzione PFA. Capi di embrioni E16.5 possono essere messi a bagno per 4,5 ore sul ghiaccio con costante agitazione.
- Dopo la fissazione del caso, lavare gli embrioni tre volte con PBS freddo. Trasferire gli embrioni in 30% di saccarosio in soluzione PBS a 4 ° C fino affondanoal fondo.
2. Congelamento
- Disporre tutti i materiali necessari prima di iniziare il processo di congelamento: crio-muffa, crio-guanti, pinze piuma entomologia, pennarello e composti temperatura di taglio ottimale (OCT)
- Etichettare la crio-stampo con un pennarello resistente all'alcool permanente (citare l'orientamento del tessuto, la data e il genotipo). Preparare una granita di ghiaccio secco tritato e il 100% di etanolo in un secchio di ghiaccio. Posizionare un bicchiere di vetro all'interno contenente isopentano. Attendere 10 minuti per il isopentano raffreddare.
- Nel frattempo rimuovere il tessuto dalla soluzione di saccarosio, eliminare l'eccesso di saccarosio in tutto il tessuto con salviette di laboratorio. Trasferire il tessuto in una pre-etichettati crio-stampo con sufficiente ottobre per coprire il tessuto. Evitare eventuali bolle d'aria nel ottobre; soprattutto intorno il tessuto.
- Orientare il tessuto in ottobre con pinze entomologia piuma per evitare danni ai tessuti. Inizia congelamento trasferendo la crio-mold nel bagno isopentano pre-raffreddato. Non schizzare isopentano in ottobre in quanto non congelerà correttamente. Avvolgere i campioni in un foglio di alluminio e conservare a -80 ° C.
3. criosezionamento
- Tagliare 14 micron sezioni seriali sottili in serie 'di cinque con un criostato e raccogliere su SuperFrost® Plus Il vetrini per immunofluorescenza (IF) analisi. Conservare i vetrini a -80 ° C fino utilizzato.
4. Tracer visualizzazione Utilizzando la (TSA) Protocol Tyramide amplificazione del segnale
- Preparare i tamponi e reagenti necessari per la colorazione. Sempre fresco preparare il tampone Tris-NaCl-Tween (TNT) il giorno di utilizzo.
- Preparare tampone TNT usando 100 ml di 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml di NaCl 5 M e DDH 2 O fino ad un volume finale di 1 L. Aggiungere 500 ml di Tween 20 con una pipetta 1 ml. Aggiungere il Tween 20 lentamente e lavare la pipetta su e giù più volte per garantire che tutti Tween 20 è insoluzione.
- Preparare Tris-NaCl-bloccante (TNB) tampone con 100 ml di 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml di NaCl 5 M e DDH 2 O fino ad un volume finale di 1 L. Aggiungere 5 g Blocking Reagent (disponibile con il kit) lentamente in piccoli incrementi nel buffer agitando. Riscaldare la soluzione gradualmente a 55 ° C con agitazione continua per sciogliere completamente i reagenti blocco (non dovrebbe richiedere più di 30-60 min). Per ottenere il riscaldamento omogeneo utilizzare un bagno d'acqua a 55 ° C. La soluzione appare lattiginosa. Portare la soluzione a temperatura ambiente prima dell'uso. Aliquota e conservare a -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
- Ricostituire biotina reagente tiramide (fornito con il kit) in Biologia Molecolare / HPLC-grade DMSO. A seconda del kit viene utilizzato l'appropriata quantità di DMSO può variare. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
NOTA: Sezioni di animali eterozigoti per i rispettivi alleli Cre e R26 possono essere utilizzati per l'analisi del circuito. Usa sessioni da littermates trasportano una Cre o un allele R26, rispettivamente, come controlli negativi. Trattare vetrini di controllo negativi esattamente come diapositive di animali doppi eterozigoti. Inoltre, include una diapositiva di controllo da una doppia animale eterozigote, ma lasciare fuori il reagente TSA (controllo non amplificato).
- Usando un bisturi affilato fresco rimuovere l'eccesso di ottobre che circonda le sezioni di tessuto e segnare il confine intorno sezioni con una penna PAP.
- Essiccare i vetrini per 2-3 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuna. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti a 0,3% H soluzione 2 O 2 in metanolo ghiacciata per placare la perossidasi endogena.
- Lavare 3x con PBS per 5 minuti ciascuna a RT. Incubare per 10 minuti a 0,5% Triton X-100 in PBS per permeabilizzazione tessuto. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuna.
- Block con TNB (soluzione bloccante, 200-300 ml per vetrino) per 30min a RT in una camera umidificata. Assicurarsi che tutte le sezioni sono completamente coperti da TNB. Non lasciate che le diapositive asciugare tra le fasi.
- Scolare il tampone di blocco in eccesso e applicare l'antisiero primario riconoscere il tracciante (1: 1.000 capra anti-WGA per BL, 1: 15.000 coniglio anti-GFP per GTT) diluito in TNB per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Assicurarsi di utilizzare un volume sufficiente per coprire completamente la sezione di tessuto (200-300 ml per vetrino).
NOTA: Le diluizioni sieri specifici primari raccomandati qui possono avere da regolare. - Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione.
- Incubare le sezioni con biotinilato antisiero secondario riconoscono l'ospite della prima dell'antisiero (1: 500 cavalli IgG anti-capra anti-WGA, 1: IgG anti-coniglio di capra 5.000 per anti-GFP in TNB per 1 ora a RT).
- Lavare 3x con TNT a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuno con agitazione. Incubare in 1: 100 streptavidina (SA) -conjugated perossidasi (SA-HRP, fornito with kit) in TNB per 30 minuti a RT in una camera umidificata. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuna. Intanto scongelare il TSA.
- Diluire TSA 1:50 TSA amplificazione diluente (fornito con il kit; utilizzare il kit TSA per la visualizzazione di BL e il kit + TSA per GTT). Incubare le sezioni di tessuto in diluita TSA proprio per 10 minuti a temperatura ambiente. Diluire TSA al momento dell'uso, ideale durante la fase di lavaggio precedente, non utilizzare alcun residuo reattivo TSA diluito per futuri esperimenti; sempre preparare fresco.
- Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione. Incubare con 1: 500 Alexa Fluor® 546 streptavidina coniugato in TNB per 30 minuti a RT. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione.
- Incubare per 10 min in soluzione Bisbenzimide 5% in PBS a temperatura ambiente per colorazione nucleare. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione. Montare con Fluromount G ed eseguire epifluorescenza o microscopia confocale.
5. τlacZ colorazione per sezioni embrionali
- Preparare i tamponi e reagenti necessari per la colorazione. Sempre fresco preparare il LacZ tampone C prima dell'uso.
- Preparare 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-gal) soluzione madre (40 mg / ml) aggiungendo 40 g di X-gal a 1 ml 70% dimetilformammide (DMF). Coprire con un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
- Preparare nitro blu tetrazolio (NBT) stock soluzione (50 mg / ml) aggiungendo 50 g di NBT per 1 ml 70% DMF. Coprire con un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
- Preparare LacZ fissativo utilizzando 80 ml di 25% glutaraldeide, 5 ml di 4% PFA, 20 ml di 1 M MgCl 2, 100 ml di EGTA 500 mM, 1 ml di 1 M tampone fosfato pH 7,4 e DDH 2 O fino a un finale volume di 10 ml.
- Preparare tampone LacZ A con 1 ml di 1 M MgCl 2, 5 ml di EGTA 500 mM, 50 ml di 1 M tampone fosfato pH 7,4 e DDH 2 O fino ad un volume finale di 500 ml.
- Preparare LacZ tampone B con 1 ml di 1 M MgCl 2, 5 ml di EGTA 500 mm, 5 ml di 1% sodio desossicolato, 100 ml di 10% NP-40, 50 ml di 1 M tampone fosfato pH 7,4 e DDH 2 O fino ad un volume finale di 500 ml.
- Preparare LacZ tampone C con l'aggiunta di 10 ml di soluzione madre NBT e 12,5 ml di soluzione madre X-gal a 1 ml di LacZ tampone B. Trucco fresco appena prima dell'uso e coprire con un foglio di alluminio.
- Asciugare i vetrini a RT almeno per 10-15 minuti (nel frattempo preparare i vetrini con una penna PAP).
- Fissare la sezione con LacZ fissante per 2 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata all'interno di una sostanza chimica fumi-cappuccio. Lavare 3 volte con PBS completato con 2 mM MgCl 2.
- Sciacquare i vetrini con LacZ tampone A. Lavare i vetrini con LacZ tampone A 3 volte per 10 minuti ciascuno a RT. Lavare 2 volte con LacZ tampone B per 5 minuti ciascuno. Incubare i vetrini in LacZ tampone C a 30-37 ° C per 6 ore o durante la notte in una camera umidificata.
NOTA: Aggiungere un volume sufficiente di LacZ buffer di C; scivoli non devono asciugare durante l'incubazione. - Dopo adeguata incubazione lavare i vetrini con PBS integrato con 2 mM MgCl 2. Sciacquare sezioni brevemente con DDH 2 O. Coverslip con glicina gelatina di Mayer. Adatta per un microscopio ottico equipaggiato con un contrasto interferenziale differenziale (DIC) di imaging set-up.
6. Gender e Tracer genotipizzazione
- Preparare coda tampone di lisi utilizzando 1 ml di 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 ml di EGTA 500 mM, 200 ml di 10% SDS, 400 ml di NaCl 5 M e DDH 2 O per fare un volume finale di 10 ml.
- Aggiungere 500 pl di tampone di lisi coda a ciascuna provetta Eppendorf contenente una biopsia coda. Aggiungere proteinasi K ad una concentrazione finale di 100 mg / ml. Incubare per una notte su un agitatore a 55 ° C.
- Centrifugare i campioni a 17.000 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga. Aggiungere 500 ml di isopropanolo al supernatante. Mescolare per almeno 5 minuti invertendo i tubi su e giù.
- Spin in centrifugare a 17.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante. Aggiungere 200 ml di etanolo al 70%. Agitare per almeno 5 minuti.
- Centrifugare a 17.000 g per 5 min. Rimuovere il surnatante con una Pipetman (non versare off). Essiccare il pellet in una camera calda (37 ° C) per 15-30 min.
- Risospendere pellet in 100 mlbassa TE pH 8,0 o acqua con punte ampio tunnel filtrata. Mettere in 55 ° C per 1 ora ea 37 ° C per una notte per una corretta dissoluzione. Conservare a 4 ° C.
- Usare 1 ml di DNA per reazione PCR (miscela di reazione 50 microlitri contenente 1 ml di DNA coda, 2,5 microlitri DMSO, 10:00 di ciascun primer, 25 mM di ciascun dNTP, e betaina 1M). Primer PCR per la genotipizzazione e l'identificazione di genere sono elencati nella tabella dei materiali.
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Representative Results
Questa sezione mostra i risultati rappresentativi che possono essere ottenuti lavorando con la R26-BIZ (B L- I RES-τlac Z) e la R26-GTT (G FP TT C) alleli. Qui usiamo la R26-BIZ e gli alleli R26-GTT per analizzare la maturazione dei circuiti neurali che regolano l'asse riproduttivo. La riproduzione in vertebrati è controllata centralmente da un piccolo sottogruppo di neuroni dell'ipotalamo, che secernono l'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH). Kisspeptin, un potente attivatore di neuroni GnRH, è stato implicato nella regolazione dell'attività dei neuroni GnRH, tuttavia quando i circuiti neurali tra GnRH e neuroni kisspeptin sono stabiliti nello sviluppo di cervello femminile mouse non era nota 5. Prima abbiamo dimostrato che l'espressione dei transgeni BIZ e GTT sono specificatamente attivati dalla ricombinazione Cre-dipendente in embrionalineuroni kisspeptin nel nucleo arcuato (ARC) (Figura 2) utilizzando una Cre linea driver specifico kisspeptin 10. Abbiamo poi dimostrare che i neuroni kisspeptin nel ARC già comunicare con uno specifico sottogruppo di neuroni GnRH in utero (Figura 3A, B). Inoltre, dimostriamo che ARC kisspeptin neuroni sono a monte del GnRH neuroni (Figura 3A, C). Nel loro insieme i nostri risultati indicano che i circuiti neurali tra kisspeptin e neuroni GnRH sono completamente stabiliti e operativa nel cervello femminile del mouse prima della nascita.
Figura 1:. Transsynaptic trasferimento di traccianti utilizzando approcci convenzionali o genetici Nell'approccio tradizionale, un tracciante transsynaptic è ripreso da tutti i neuroni al sito di iniezione quindi potenzialmente etichettatura non specifici percorsi indipendenti. Inl'approccio genetico, il tracciante è selettivamente espresso dai neuroni geneticamente definite così specificamente visualizzando neuroni collegati alle cellule-traccianti esprimono. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: attivazione Fedele della BIZ e GTT transgene in ARC kisspeptin neuroni embrionali. (A) Strategia di allevamento per attivare BIZ ed espressione GTT in neuroni kisspeptin. Abbiamo allevato R26-BIZ e R26-GTT topi con Kisspeptin-IRES-Cre (KissIC) topi 10, in cui Cre-ricombinasi è espressa sotto il controllo del promotore Kiss1. (CE) l'attività β-gal enzimatica identifica il-tracciante produzione cellule e si limita alla ARC nel cervello di una femmina KissIC / R26-BIZ embrione al giorno embrionale (E) 18.5. (FG) Doppia immunofluorescenza per kisspeptin (verde) e BL (rosso) (F) o GTT (red) (G) mostra l'attivazione fedeli di espressione BL o GTT da Cre-mediata ricombinazione in kisspeptin neuroni in KissIC / R26-BIZ o KissIC / R26-GTT embrioni di topo femmina, rispettivamente. Barre di scala (C) 500 micron, (D) 200 micron, (F, G) 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: GnRH neuroni sono connessi al sinapticamente ea valle kisspeptin neuroni. (A) Combinatoria genetica tracing transsynaptic bidirezionale. Mentre τlacZ è limitata ai Cre-esprimono neuroni kisspeptin, BL è via trans trasferito a monte (presinaptica) ea valle (post-sinaptici) neuroni nei topi KissIC / R26-BIZ. Al contrario, GFP-TTC è via trans trasferito ai neuroni presinaptici, ma non post-sinaptici in topi KissIC / R26-GTT. Neuroni postsinaptici hanno fibre assone τlacZ positivi nelle loro immediate vicinanze (B, C) Doppia immunofluorescenza per BL (rosso; B). O GTT (rosso, C) e GnRH (verde) su una sezione sagittale attraverso tutta la testa di una femmina KissIC / R26-BIZ o KissIC / R26-GTT embrione E18.5. (B) Si noti che alcuni, ma non tutti i neuroni GnRH contengono BL. Questi dati dimostrano che un sottoinsieme di neuroni GnRH embrionali è sinapticamente collegato ad arco neuroni kisspeptin. (C) Si noti che nessuno dei neuroni GnRH contiene GTT. Esclusiva trasferimento transsynaptic di BL, ma non GTT di neuroni GnRH dimostra che i neuroni GnRHsono a valle di neuroni kisspeptin. Barre di scala (B, C) 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Caratteristiche | Traccianti Transsynaptic | Virus neurotropici |
| Modalità di applicazione | Espresso in un transgene | Meccanicamente iniettato |
| Direzione di diffusione | Anterograda, retrograda e bidirezionale | Retrograde & anterograda |
| Efficacia Synaptic | Multisynaptic | Multisynaptic o monosinaptico (retrograda solo) |
| Potenza del segnale | Debole, diminuisce ad ogni sinapsi | Forte, amplificazione del segnale in ogni sinapsi |
| Risposta immunitaria | Nessuno; espressa come proteina endogena | Forte risposta immunitaria, letale |
| Risoluzione spaziale e temporale | Dipende promotore di scelta | Altamente selettiva per iniezioni meccaniche a singoli siti |
Tabella 1: Confronto delle caratteristiche di traccianti transsynaptic genetiche e virus neurotropici geneticamente modificati
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Discussion
Esprimendo traccianti transsynaptic come transgeni per rintracciare i circuiti neurali di popolazioni di neuroni geneticamente definiti ha diversi vantaggi rispetto alla iniezione stereotassica di traccianti o virus neurotopic. Innanzitutto, il tracciante viene prodotta come proteina endogena e pertanto non suscitare una risposta immunitaria e un percorso neurale selettiva può essere analizzato in diversi animali con elevata riproducibilità. In secondo luogo, perché questo è un metodo non invasivo può essere utilizzato per tracciare i circuiti di neuroni non facilmente accessibili per iniezioni stereotassica, per esempio in utero. Limitazioni includono generalmente bassa efficacia nel trasferimento transsynaptic, che può provocare difficoltà di rilevare il tracciante. Inoltre, la molecola tracciante viene diluito ad ogni sinapsi. Al contrario, i virus neurotropici replicano e la replicazione virale, a sua volta poi porta a segnalare l'amplificazione dopo aver attraversato la sinapsi. Tuttavia, la replicazione virale è anche un importante limitation dell'uso di virus neurotropi causa citotossicità intrinseca virale. Alcune caratteristiche di traccianti transsynaptic genetiche e virus neurotropici geneticamente modificati sono confrontati nella tabella 1.
Gli alleli R26-BIZ e R26-GTT si completano a vicenda e facilitano la visualizzazione dei circuiti neurali di una popolazione neuronale geneticamente identificato su ricombinazione Cre-mediata. La R 26 promotore è ben caratterizzato e media espressione ubiquitaria con modesta forza 11,12. Utilizzando metodi altamente sensibili per la rilevazione tracciante come l'amplificazione del segnale tiramide sistema (TSA) consente l'identificazione di quantità anche minime di molecole traccianti trasferiti attraverso sinapsi. Un altro grande vantaggio di usare il promotore R26 per guidare l'espressione tracciante è che i neuroni che esprimono sintetizzano continuamente i traccianti per tutta la loro vita. Questo rende possibile analizzare maturazione circuitoper periodi di tempo prolungati 5. Al contrario, questo non è possibile quando si utilizza virus neurotropi causa della loro citotossicità. È importante sottolineare che il nostro sistema genetico binario e l'utilizzo del promotore R26 disaccoppia produzione di traccianti da promotori endogeni potenzialmente pesantemente regolamentati guida espressione Cre (in questo caso, il promotore Kiss1), che possono essere regolati da una varietà di genetica e fattori di epigenetica 13. Quindi trasferimento transsynaptic di BL e GTT riflette comunicazione sinaptica reale tra due popolazioni neuronali.
Ricombinazione Cre-mediata è un evento irreversibile e quindi converte l'espressione genica evolutivamente transiente in espressione del transgene stabile. L'uso di un sistema Cre inducibile 14 può potenzialmente smascherare un effetto di sviluppo a causa di espressione transiente Cre.
In conclusione, i due nuovi R26-R26-BIZ e GTT ceppi di topi possono essere utilizzati per analizzare locale e loGamma circuiti neurali ng che potrebbe essere composto di diverse classi e tipi di neuroni provenienti da ogni regione del cervello o anche dal midollo spinale in modo Cre-dipendente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
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