Introduction
Трассировка Анатомический путь является одним из наиболее часто используемых инструментов, чтобы расшифровать связь между мозгом и поведением 1. Продвижение в нейронных цепей отслеживания технологий даровал неврологов с возможностью отслеживания нейронных цепей из генетически определенных популяций нейронов у мышей 2. Несмотря на эти технические достижения остается сложной, чтобы разгадать образование нейронных цепей, особенно во время эмбрионального созревания. Это потому, что большинство методов отслеживания разработанных к настоящему основаны на стереотаксической инъекции transsynaptic индикаторов или генетически модифицированных нейротропных вирусов (рис 1) 2,3. Хотя эти методы достижения пространственного и временного разрешения подключения, присущие существенные ограничения, такие как технически сложных трассирующих вливаний в развивающемся мозге, воспроизводимость в месте инъекции, потенциал воспаление в месте инъекции и наиболее важtantly цитотоксичность вызвано нейротропных вирусов ограничить их использование 4.
Альтернативный метод заключается в выражении transsynaptic индикаторов, как трансгенов в генетически измененных мышей. Мы недавно изменили эту технику и разработали двойную систему отслеживания генетических transsynaptic для отображения нейронных цепей любого генетически определенных нейронов населения 5. Наши экспериментальные стратегия основана на двух новых нокаут в линиях мышей, которые выражают либо двунаправленный Tracer ячменя лектин (BL) 6 или ретроградная Tracer столбнячный токсин фрагмента C слит с GFP (GTT) 7 из ROSA 26 локуса после Cre-опосредованного рекомбинация. Здесь мы использовали эти штаммы мыши, чтобы выборочно выразить BL и GTT в нейронах, которые производят kisspeptin, нейропептид, который участвует в регуляции созревания репродуктивной оси 8,9. Мы показываем, что этот метод подходит для визуализации развитие и созревание поцелуяпептин нейронная схема во время эмбрионального развития женского мозга мыши 5.
Стратегия Разведение
R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) и R26-GFP-ТТЦ (GTT) трассирующие линии плей-штаммов 5, которые несут рекомбинантные аллелей ROSA26. R26-BIZ и аллели R26-GTT транскрипционно молчание в связи с наличием сильного транскрипции стоп-сигнала, который в сопровождении двух LoxP сайтов 5. Выражение бизнесе и GTT трансгена активируется с помощью Cre-опосредованного удалени транскрипции стоп-сигналом. Аллели R26-BIZ и R26-GTT может использоваться самостоятельно, просто пересечения с линией водителя CRE. Для анализа животных, гетерозиготных по соответствующим Cre и R26 аллели могут быть использованы. Однопомётники несущие один Cre или один R26 аллель, соответственно, должны быть использованы в качестве контрольных. В качестве альтернативы, также возможно, чтобы генерировать тriple стучать в животных, несущих аллели Cre, R26-Biz и R26-ГЦГ, однако это потребует еще один крест.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этика заявление: Процедуры, связанные с животными предметы были утверждены по животноводству, комиссии университета Гамбурга и Университета земли Саар.
1. Подготовка и фиксация эмбриональной ткани
- Организовать все оборудование, необходимое для рассекать из эмбрионов и приготовления растворов для последующей фиксации ткани до принесения в жертву животных.
Примечание: Всегда подготовить свежие 4% параформальдегида (PFA) раствор (4% PFA в 0,1 М фосфатном буферном солевом растворе (PBS), доведения рН до 7,4). - Эвтаназии приуроченный беременной женщины мышь с этической точки зрения утвержденной процедурой.
- Перевести мыши на платформу. Смочите брюшной стороне живота с 70% этанола и сделать вертикальный разрез, используя острые ножницы, чтобы разоблачить брюшной полости.
- Определить эмбриональных цепь и вытащить его тщательно тупыми щипцами и поместить его в ледяной PBS.
- Извлеките отдельные эмбрионы изэмбриональных цепи с использованием тонких ножницы и пинцет. Удаление лишних тканей вокруг эмбрионов и мыть их в ледяной PBS.
- Возьмите небольшой хвост биопсии (перед передачей эмбриона в PFA) и инкубировать ее в хвост буфера для лизиса для гендерной идентификации и трассирующими аллель генотипирования ПЦР.
- Начало из эмбриона на самых боковой стороне и передачи каждого эмбриона отдельно в пробирку, содержащую ледяной 4% PFA на льду на шейкере.
- Замочите эмбрионов в возрасте E13.5 или моложе в течение 1,5 ч на льду с постоянной тряски. Замочите эмбрионов в возрасте E14.5 и E15.5 в течение 2,5 ч по льду с постоянной тряски.
- Для эмбрионы возраста E16.5 и старше, обезглавить и снимите внешнюю оболочку до замачивания голову в растворе PFA. Главы эмбрионов E16.5 можно замочить в течение 4,5 ч по льду с постоянной тряски.
- После соответствующей фиксации, мыть эмбрионов три раза охлажденным на льду PBS. Передача эмбрионов в 30% сахарозы в растворе PBS при 4 ° С, пока они не тонутна дно.
2. Замораживание
- Организовать все необходимые материалы, прежде чем начать процесс замораживания: крио-плесени, крио-перчатки, в полулегком энтомология щипцы, Маркер и температура составные оптимального раскроя (OCT)
- Этикетка крио-формы с постоянным употреблением алкоголя маркер устойчивости (говоря ориентацию ткани, дата и генотипа). Подготовьте слякоть измельченного сухого льда и 100% этанола в ведерке со льдом. Поместите стеклянный стакан внутри, содержащий изопентан. Подождите 10 минут для изопентан, чтобы остыть.
- В то же время удаления ткани из раствора сахарозы, вытереть излишки сахарозу вокруг ткани с помощью лабораторных салфетки. Передача ткани в предварительно меченных крио-пресс-формы с достаточным октября, чтобы покрыть ткань. Избегайте пузырьков воздуха в центре развертывания; особенно вокруг ткани.
- Расположите ткань в октябре помощью полулегком энтомологии щипцы, чтобы избежать повреждения тканей. Начните замораживания путем передачи крио-мольд в предварительно охлажденный изопентан бане. Не допускайте попадания изопентан в октябре в качестве не замерзнет должным образом. Оберните образцы в алюминиевую фольгу и хранить при температуре -80 ° C.
3. Cryosectioning
- Вырезать 14 мкм тонкие серийных срезов в серии «пять с помощью криостата и собирать на SuperFrost® Plus стеклах для иммунофлуоресценции анализа (IF). Хранить слайды при температуре -80 ° С до использования.
4. Tracer визуализация Используя (TSA) Протокол Tyramide усиление сигнала
- Подготовка буферов и реагентов, необходимых для окрашивания. Всегда свеже подготовить Трис-NaCl-твин (ТНТ) буфер в день использования.
- Подготовка TNT буфер с помощью 100 мл 1 М Трис-HCl, рН 7,5, 30 мл 5 М NaCl и DDH 2 O до конечного объема 1 л Добавить 500 мкл Tween 20 с использованием 1 мл пипетки. Добавить в анимации 20 медленно и промойте пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что все Твин 20 вРешение.
- Подготовка Трис-NaCl-блокировки (TNB), используя буфер 100 мл 1 М Трис-HCl, рН 7,5, 30 мл 5 М NaCl и DDH 2 O до конечного объема 1 л Добавить 5 г блокирующий реагент (снабжена Комплект) медленно небольшими порциями в буфер при перемешивании. Нагрейте раствор постепенно до 55 ° C при непрерывном перемешивании до полного растворения блокирующего реагента (это не должно занять больше времени, чем 30-60 мин). Для достижения гомогенного нагрева использовать водяную баню при 55 ° С. Решение появится молочный. Доведите раствор до комнатной температуры перед использованием. Алиготе и хранить при температуре -20 ° С в течение длительного хранения.
- Восстановить биотин tyramide реагента (входит в комплект) в области молекулярной биологии / ВЭЖХ-класса ДМСО. В зависимости от которых набор используется соответствующее количество может варьироваться в ДМСО. Хранить исходный раствор при 4 ° С.
Примечание: Секции из животных, гетерозиготных по соответствующим Cre и R26 аллелей могут быть использованы для анализа схем. Использование сотражений от помета, осуществляющих один Cre или один R26 аллель, соответственно, в качестве отрицательного контроля. Лечить негативные слайды управления так же, как слайды из двойных гетерозиготных животных. Кроме того, включать в себя один управления слайд из двойной гетерозиготной животных, но оставить в стороне реагента TSA (неусиленных управления).
- Использование острый свежий скальпель удалить лишнюю октября окружающих срезов тканей и отметить границу вокруг участков с PAP пера.
- Сушат слайды в течение 2-3 мин при комнатной температуре (RT). Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в течение 30 мин в 0,3% H 2 O 2 решения в ледяной метанола, чтобы утолить активности эндогенной пероксидазы.
- Промыть 3 раза с PBS в течение 5 мин каждый при комнатной температуре. Инкубируют в течение 10 мин в 0,5% Triton X-100 в PBS на ткани проницаемости. Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый.
- Блок с ТНБ (блокирование решение, 200-300 мкл на слайд) для 30мин при комнатной температуре во влажной камере. Убедитесь, что все разделы полностью покрыты ТНБ. Не позволяйте слайды высохнуть в период между шагами.
- Слить избыток блокирующий буфер и применить основную антисыворотки, распознающий Tracer (1: 1000 козьего анти-WGA для BL, 1: 15000 кроличье анти-GFP для GTT), разбавленного в TNB в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С. Убедитесь в том, чтобы использовать достаточный объем, чтобы полностью покрыть срезы ткани (200-300 мкл на слайд).
ПРИМЕЧАНИЕ: В первую очередь разведения сыворотки иммунные рекомендуемые здесь, возможно, придется быть скорректированы. - Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый при перемешивании.
- Инкубируйте участки с биотинилированного вторичного антисыворотки признании множество первой антисыворотки (1: 500 лошади анти-козел IgG для анти-WGA, 1: 5000 козьего антитела против кроличьего IgG для анти-GFP в TNB в течение 1 ч при комнатной температуре).
- Промыть 3 раза с ТНТ при комнатной температуре в течение 5 мин каждый при перемешивании. Выдержите в 1: 100 стрептавидином (SA) -conjugated пероксидазой хрена (SA-HRP, при условии, Wiго набора) в TNB в течение 30 мин при комнатной температуре во влажной камере. Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый. Между тем оттепели АСП.
- Развести АСП 1:50 в АСП усиления разбавителя (входит в комплект, используйте комплект TSA для визуализации BL и набор TSA + для GTT). Инкубируйте срезов ткани в разбавленном АСП именно по 10 мин при комнатной температуре. Развести АСП непосредственно перед использованием, в идеале в течение предыдущего этапа промывки, не используйте оставшуюся разбавленный TSA реагент для будущих экспериментов; всегда готовятся свежие.
- Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый при перемешивании. Инкубируют при 1: 500 Alexa Fluor® 546 стрептавидин конъюгата в TNB в течение 30 мин при комнатной температуре. Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый при перемешивании.
- Инкубировать в течение 10 мин в 5% растворе bisbenzimide в PBS при комнатной температуре в течение ядерного окрашивания. Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый при перемешивании. Установите с Fluromount G и выполнять эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.
5. τlacZ Окрашивание для эмбрионального разделах
- Подготовка буферов и реагентов, необходимых для окрашивания. Всегда свеже подготовить буфера C LacZ перед использованием.
- Подготовка 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида (X-GAL) маточного раствора (40 мг / мл) с добавлением 40 г X-гал в 1 мл 70% диметилформамида (ДМФ). Накрыть алюминиевой фольгой и хранят при -20 ° С в течение длительного хранения.
- Подготовка нитро тетразолия (NBT) улРаствор Ока (50 мг / мл) с добавлением 50 г NBT до 1 мл 70% DMF. Накрыть алюминиевой фольгой и хранят при -20 ° С в течение длительного хранения.
- Подготовка LacZ фиксирующий с помощью 80 мкл 25% глутарового альдегида, 5 мл 4% PFA, 20 мкл 1 М MgCl 2, 100 мкл 500 мМ EGTA, 1 мл 1 М фосфатного буфера, рН 7,4, и DDH 2 O до конечной Объем 10 мл.
- Подготовка LacZ буфера А с помощью 1 мл 1 М MgCl 2, 5 мл 500 мМ EGTA, 50 мл 1 М фосфатного буфера, рН 7,4, и DDH 2 O до конечного объема 500 мл.
- Подготовка LacZ буфера B с помощью 1 мл 1 М MgCl 2, 5 мл 500 мМ EGTA, 5 мл 1% дезоксихолат натрия, 100 мл 10% NP-40, 50 мл 1 М фосфатного буфера, рН 7,4, и DDH 2 O до конечного объема 500 мл.
- Подготовка LacZ буфера C, добавляя 10 мкл НБТ маточного раствора и 12,5 мкл X-гал маточного раствора в 1 мл LacZ буфере В. делают свежевыжатый непосредственно перед использованием и накрыть алюминиевой фольгой.
- Высушите слайды при комнатной температуре, по крайней мере в течение 10-15 мин (пока подготовить слайды с PAP пера).
- Закрепить секции с фиксатором в течение LacZ 2 мин при комнатной температуре во влажной камере внутри химического вытяжного шкафа. Промыть 3 раза PBS с добавлением 2 мМ MgCl 2.
- Промыть слайды с LacZ буфером А. Вымойте слайды с LacZ буфер А 3 раза в течение 10 минут каждый при комнатной температуре. Промыть два раза LacZ буфера В в течение 5 мин каждый. Инкубируйте слайды в LacZ буфера С на 30-37 ° С в течение 6 ч или на ночь во влажной камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить достаточного объема LacZ буфера С; слайды не должны высыхать во время инкубации. - После соответствующей инкубации мыть слайды с PBS с добавлением 2 мМ MgCl 2. Промыть разделах кратко с DDh 2 O. Покровное с глицин желатина Майера. Подходит для светового микроскопа, оснащенного дифференциальный интерференционный контраст (DIC) изображений настройки.
6. Gendэ и Tracer генотипирование
- Подготовьте хвост буфера для лизиса с помощью 1 мл 1 М Трис-HCl рН 8,5, 100 мкл 500 мМ EGTA, 200 мкл 10% SDS, 400 мкл 5 М NaCl и DDH 2 O, чтобы до конечного объема 10 мл.
- Добавить 500 мкл буфера для лизиса хвоста каждой пробирке Эппендорфа, содержащую хвостовой биопсии. Добавить протеиназы К до конечной концентрации 100 мг / мл. Инкубируют в течение ночи на качалке при 55 ° C.
- Центрифуга образцов при 17000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Передача супернатант к новому центрифужную пробирку. Добавить 500 мкл изопропанола, супернатант. Смешайте в течение по крайней мере 5 мин путем инвертирования трубы вверх и вниз.
- Спина в центрифуге при 17000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Слейте надосадочную. Добавить 200 мкл 70% этанола. Встряхнуть, по крайней мере, 5 мин.
- Центрифуга при 17000 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант с Pipetman (не сливать). Сушат гранулы в теплой камере (37 ° C) в течение 15-30 мин.
- Ресуспендируют осадок в 100 мклнизким TE pH 8,0 или воды с использованием широким отверстием отфильтрованные советы. Поместить в 55 ° C в течение 1 часа и при 37 ° С в течение ночи для правильного растворения. Хранить при 4 ° С.
- Используйте 1 мкл ДНК для ПЦР (50 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл хвост ДНК, 2,5 мкл ДМСО, 10 вечера каждого праймера, 25 мкм каждого дНТФ и 1М бетаин). ПЦР праймеры для генотипирования и гендерной идентификации приведены в таблице материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе показаны репрезентативные результаты, которые могут быть получены работе с R26-Biz (B L- Я RES-τlac Z) и R26-GTT (G FP- TT C) аллелей. Здесь мы используем R26-BIZ и аллелей R26-ГЦГ проанализировать созревание нейронных цепей, регулирующих репродуктивной системы. Размножение у позвоночных находится в центре контролируется небольшое подмножество нейронов в гипоталамусе, которые секретируют гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ). Kisspeptin, мощным активатором ГнРГ нейронов, участвует в регуляции активности ГнРГ нейронов, однако, когда нейронные цепи между ГнРГ и kisspeptin нейронов создаются в развивающихся женского мозга мыши не было известно 5. Сначала покажем, что выражение трансгенов BIZ и GTT специально включается Cre-зависимой рекомбинации в эмбриональныхkisspeptin нейроны в дугообразном ядре (ARC) (рисунок 2) с использованием kisspeptin конкретных Cre драйвер линии 10. Мы тогда показать, что kisspeptin нейронов в АРК уже общаться с определенное подмножество ГнРГ нейронов в период внутриутробного развития (рис 3а, б). Кроме того, мы показываем, что ARC kisspeptin нейроны перед ГнРГ нейронов (рис 3а, C). Взятые вместе, наши результаты показывают, что нейронные цепи между kisspeptin и ГнРГ нейронов в полной мере определены и действуют в женский мозг мыши до рождения.
Рисунок 1:. Transsynaptic передача индикаторов с использованием обычных или генетические подходы в традиционном подходе, transsynaptic Tracer поднята всех нейронов в месте инъекции, таким образом, потенциально обозначая неспецифические несвязанных путей. Вгенетический подход, трассирующими избирательно экспрессируется генетически определенных нейронов, таким образом, в частности, визуализации нейронов, связанных с трассирующими-экспрессирующих клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Верный активации BIZ и GTT трансгена в эмбриональные АРК kisspeptin нейронов. () Стратегия размножения, чтобы активировать BIZ и выражение GTT в kisspeptin нейронов. Мы разводили R26-бизнеса и R26-ГЦГ мышей Kisspeptin-IRES-Cre (KissIC) мышей 10, в котором Cre-рекомбиназу экспрессируется под контролем промотора Kiss1. (СЕ) β-гал ферментативную активность идентифицирует трассировщик продуцирующих клетки и ограничивается АРК в мозгу женщины KissIC / R26-BIZ эмбрион на день эмбрионального развития (E) 18,5. (FG) Двухместный иммунофлюоресценции kisspeptin (зеленый) и BL (красный) (F) или GTT (красный) (G) демонстрирует точное активации BL или GTT выражении на Cre-опосредованного рекомбинация в kisspeptin нейроны в KissIC / R26-Biz или KissIC / R26-GTT эмбрионов у самок мышей, соответственно. Масштабные линейки (C) 500 мкм, (г) 200 мкм, (F, G) 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: ГнРГ нейроны синаптически подключен к и после kisspeptin нейронов. (А) Комбинаторные генетический двунаправленный transsynaptic трассировка. В то время как τlaCZ приурочена к Cre-экспрессирующих kisspeptin нейронов, BL будет transsynaptically переданы вверх по течению (пресинаптических) и вниз (постсинаптические) нейроны мышей KissIC / R26-Biz. В отличие от этого, GFP-ТТС transsynaptically переданы пресинаптических, но не постсинаптических нейронов у мышей KissIC / R26-GTT. Постсинаптические нейроны имеют τlacZ-положительных аксонов волокон в их непосредственной близости (B, C) Двухместный иммунофлюоресценции BL (красный, B). Или GTT (красный; C) и гонадотропин (зеленый) на сагиттальном сечении по всей голове самки KissIC / R26-BIZ или KissIC / R26-GTT эмбрион на E18.5. (B) Обратите внимание, что некоторые, но не все нейроны ГнРГ содержать BL. Эти данные показывают, что подмножество эмбриональных нейронов GnRH в синаптически подключен к ARC kisspeptin нейронов. (C) Обратите внимание, что ни один из нейронов ГнРГ не содержат GTT. Эксклюзивный перевод transsynaptic Б.Л., но не GTT в ГнРГ нейронов показывает, что ГнРГ нейроновявляются ниже kisspeptin нейронов. Масштабные линейки (B, C) 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Особенности | Transsynaptic индикаторы | Нейротропные вирусы |
| Способ применения | Выражается в трансгенов | Механически вводят |
| Направление распространения | Антероградный, ретроградная и двунаправленный | Ретроградная & антероградный |
| Synaptic эффективность | Multisynaptic | Multisynaptic или моносинаптические (ретроградный только) |
| Интенсивность сигнала | Слабые, уменьшается при каждом синапсе | Сильный, усиление сигнала на каждом синапсе |
| Иммунная реакция | Нет; выражается в эндогенного белка | Сильный иммунный ответ, смертоносные |
| Пространственное и временное разрешение | В зависимости от промотора выбора | Высокая избирательная из-за механических инъекций на отдельных участках |
Таблица 1: Сравнение особенностей генетических transsynaptic индикаторов и генетически модифицированные нейротропные вирусы
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выражая transsynaptic индикаторов, как трансгенов проследить нейронных цепей генетически определенных популяций нейронов имеет ряд преимуществ по сравнению с стереотаксической инъекции индикаторов или NEUROTOPIC вирусов. Во-первых, трассировщик получают в качестве эндогенного белка и, следовательно, не вызывает каких-либо иммунного ответа и селективный нейронной пути могут быть проанализированы в различных животных с высокой воспроизводимостью. Во-вторых, потому что это неинвазивный метод может быть использован для отслеживания цепи от нейронов, не легко доступных для стереотаксических инъекций, например, в матке. Ограничения включают в себя, как правило низкую эффективность в transsynaptic передачи, которая может привести к трудностям в обнаружении Tracer. Кроме того, молекула Tracer размывание при каждом синапсе. В отличие от этого, нейротропные вирусы повторить и вирусной репликации в свою очередь, приводит тогда к усиления сигнала после пересечения синапса. Тем не менее, вирусная репликация также является основным limitatион использованием нейротропных вирусов за счет собственного вирусной цитотоксичности. Некоторые особенности генетических transsynaptic индикаторов и генетически модифицированных нейротропных вирусов сопоставлены в таблице 1.
Аллели R26-BIZ и R26-GTT дополняют друг друга и помогают при нервных цепей генетически определенных нейронов населения, на Cre-опосредованного рекомбинации. R 26 промотор хорошо изученным и посредником повсеместное выражение со скромной силы 11,12. Использование высокочувствительных методов для обнаружения примеси, такие как усиление tyramide сигнала (TSA) Система позволяет идентифицировать даже незначительных количеств молекул-меток, перемещаемых через синапсы. Еще одним важным преимуществом использования промотор R26 для управления экспрессией индикаторного является то, что, выражающие нейроны постоянно синтезировать индикаторов на протяжении всей их жизни. Это позволяет анализировать схемы созреваниев течение длительных периодов времени 5. В отличие от этого, это невозможно при использовании нейротропных вирусы из-за их цитотоксичности. Важно отметить, что наш двоичный код генетической системы и использование промотора R26 разъединяет производство трассирующими от потенциально в значительной степени регулируется эндогенных стимуляторов вождения Cre выражение (в данном случае, промоутер Kiss1), которые могут регулироваться с помощью различных генетических и эпигенетических факторов 13. Поэтому transsynaptic передача BL и GTT отражает реальную синаптической связи между двумя нейронных популяций.
Cre-опосредованного рекомбинации является необратимым событием, и, следовательно, он преобразует выражение развитием переходных гена в стабильной экспрессии трансгена. Использование индуцируемого системы Cre 14 потенциально может размаскировать эффект с развитием за счет временной экспрессии Cre.
В заключение двух новых R26-BIZ и R26-GTT линии мышей могут быть использованы для анализа местных и вотнг нейронные цепи диапазон, который может состоять из различных классов и типов нейронов, происходящих из любого региона мозга или даже из спинного мозга в Cre-зависимым образом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
- Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
- Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
- Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
- De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
- Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
- Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67 (2005).
- Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
- Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).
