Introduction
Det har været over et halvt århundrede siden den første rapport af naturligt forekommende DNA ændringer i form af cytosin methylering 1. Cytosin-methylering er en modificeret cytosin nukleotidbase, hvor 5 th carbon på basen ring har en methylgruppe (5-MC), hyppigst forekommende i CpG-dinukleotidet motiv i mammale genomer. Den funktionelle nærvær af 5-MC i genpromotorer er generelt forbundet med transkriptionel repression, medens fravær er forbundet med transkriptionel aktivitet 2.
Enorme fremskridt er blevet gjort i vores forståelse af den rolle, DNA methylering i udvikling 3, transgeneration formering af epigenetiske profiler 4, kræft patogenese 5,6, og en række andre forskningsområder. Mange af disse fremskridt er kommet i de sidste par år som nye metoder er blevet udviklet til profil DNA methylering 7. Med fremkomsten ogpopularisering af næste generation sekventering (NGS) teknikker er der nu en række metoder til at profilere DNA methylering i en hel genom eller store områder af et genom 8. Disse metoder åbner mulighed for opdagelse undersøgelser, der kvantificerer DNA-methylering mønstre og forskelle i DNA-methylering. Ud over disse hypotese-genererende fremgangsmåder, der er et væsentligt behov for målrettet / hypotesetestning DNA-methylering kvantificeringsfremgangsmåder.
Pyrosequencing, methylering specifik PCR og direkte Sanger sekventering af bisulfit konverterede DNA har været de mest anvendte metoder til analyse af målrettede regioner (dvs. en promotor region af et enkelt gen eller en CpG ø) 9-12. Alle disse metoder er afhængige af omdannelse med bisulfit, en kemisk Deamineringsreaktionen hvor methylerede cytosin s omdannes til uracil s, mens methylerede cytosin s forbliver intakt 13,14. PCR-amplifikation af bisulfite-konverterede DNA resulterer i udskiftning af uracil er med thymin 15 tillader differential methylering at læse som en base forskel. Mens meget nyttig, de begrænsninger af disse metoder omfatter lav kvantitativ nøjagtighed, kort læse længde, og lav prøve gennemløb. For at løse disse begrænsninger vi udviklet en metode, vi har kaldt Bisulfite Amplicon sekventering (BSAS) 16. Målet med denne fremgangsmåde er at være i stand til at analysere target genomiske regioner af interesse i et stort antal prøver med høj kvantitativ nøjagtighed.
BSAS bruger elementer af eksisterende metoder (bisulfit konvertering og region-specifik PCR forstærkning) og kombinerer dem med enkle næste generation bibliotek konstruktion (transposome-medieret) 17 og stationære NGS 18 (figur 1). Denne fremgangsmåde giver en mere kvantitativ og højere throughput metode til at undersøge cytosin methylering i en region af interesse. Her præsenterer vi detmetode i detaljer og beskrive metoder til fejlfinding og kvalitet kontrollere BSAS processen.
Protocol
1. nukleinsyreisolering fra væv
BEMÆRK: Co-isolering af DNA og RNA fra samme vævsprøve giver mulighed for at samle DNA til epigenetisk analyse og parret RNA til genekspression analyse. Eksemplet givet her er en form for søjleoprensning fra eksperimentel væv, men alternative metoder for forskellige prøvetyper eller andre isoleringsmetoder kan anvendes. Det primære krav er for højt oprenset nukleinsyre uden kontaminerende protein eller organiske opløsningsmidler.
- Vælg et stykke frisk frosset eller frisk væv til mekanisk homogenisering og anbring på is. Store eller overføre væv til et 2,0 ml rundbundet mikrocentrifugerør.
- Tilsæt en 5 mm rustfrit stål perle til hvert rør indeholdende væv. Tilsæt en passende mængde af lysisbuffer, baseret på producentens forslag af celleantal eller væv vægt.
- Homogeniseres vævet ved anvendelse af en perlemølle mekanisk homogenisering ved30 Hz i 30 sek.
BEMÆRK: hyppigheden og varigheden af mekanisk homogenisering er afhængig af vævstype. Blødere væv vil helt homogeniseres bruge de anbefalede indstillinger, mens hårdere væv kræver indstilling optimering. - Foretag DNA og RNA-isolering under anvendelse af silica spinkolonner ved stuetemperatur efter fabrikantens protokol.
- Elute RNA i 50 pi RNase-frit vand og sted på is. Brug RNA for mRNA-ekspression analyse ved qPCR.
- Eluer DNA i 100 ul TE-buffer. Gentag eluering fra DNA-søjle ved anvendelse eluenten for at øge DNA-koncentration og udbytte. Brug DNA for målrettet methylering kvantificering.
- Vurdere kvaliteten af DNA og RNA ved hjælp af en standard spektrofotometer for absorbans ved 230 nm, 260 nm, 280 nm, og 320 nm.
BEMÆRK: A260 / A280-forhold skal være ~ 1,8-2 for DNA høj kvalitet. A260 / A280-forhold skal være ~ 2 for kvalitet RNA høj. Tilstedeværelsen af overskydende absorbans ved 230 nm IndicATES forureninger fra isoleringsproceduren. - Kvalitet kontrollere RNA yderligere ved hjælp af en kapillarelektroforese chip i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Høj kvalitet RNA vil have en RNA integritet nummer (RIN)> 8. Tilstedeværelsen af ekstra toppe i elektroferogram udover rRNA toppe indikerer prøveforurening. - Kvantificere DNA og RNA ved fluorescerende assay ifølge producentens protokol.
BEMÆRK: Ved hjælp af en fluorometrisk assay er mere sensitiv og specifik til kvantificering af nukleinsyrer end spektrofotometri alene. - Store isoleret DNA og RNA ved -80 ° C.
2. Mål Identifikation og Primer Design
- Bestem den genomiske region (er) af interesse, der skal analyseres ved BSAS med det relevante henvisning genom sekvens. Genpromotorer af differentielt udtrykte gener er fælles mål for methylering kvantificering.
- Forbered en i silico bisulfit-konvertereed henvisning genom til senere tilpasning af sekventering læser ved at ændre .fasta sekvens filen i en teksteditor. I 5'-3 'orientering, erstatte ikke-CpG cytosin er med thymin s (figur 2).
- Design primer sæt til at forstærke områder af interesse fra bisulfit konverterede DNA.
- Vælg og kopiere uomvendt område af interesse, i 5'-3 'orientering, i et bisulfit-specifik PCR-primer design program (figur 3).
BEMÆRK: En optimal bisulfit-PCR amplicon længde er 250-400 bp pr amplikon som bisulfitbehandling fragmenter DNA og det er vanskeligt at amplificere store> 400 bp regioner. Hvis for eksempel et område på 1 kb er af interesse, kan flere primerpar konstrueres til at dække dette område. Design amplicons at være af samme bp størrelse for nem pooling. Undgå amplicon længder <250 bp, fordi disse kan være utilstrækkelig længde til biblioteket generation. En optimal primer længde for BSAS er>20 bp per primer. - Vælg en T m rækkevidde 55-65 ° C og en max T m forskel mellem frem og bak primere på 1-2 ° C.
- Vælg primerpar, der bedst dækker området af interesse. Vælg ikke primere, der indeholder bindingssteder for CpG, eller som støder direkte op til CpG sites, da dette vil medføre skævhed i PCR-reaktionerne. Brug standard PCR-primere, der kan bestilles fra et vilkårligt antal akademiske eller kommercielle udbydere.
- Opløs frysetørrede primere i RNase / DNase frit vand ved en arbejdsgruppe bestand på 100 uM.
- Vælg og kopiere uomvendt område af interesse, i 5'-3 'orientering, i et bisulfit-specifik PCR-primer design program (figur 3).
- Store PCR-primere ved -20 ° C. Fortyndes 100 um primer lager til 10 um arbejder materiel til PCR-reaktioner.
3. bisulfit specifikke PCR Optimization
BEMÆRK: bisulfit omdannelse af genomisk DNA, en række forskellige kommercielle kits til omdannelse med bisulfit er tilgængelige. Vælg kit eller protokol, der passer bedst til den planlagte eksperiment.
<ol>BEMÆRK: 1-2 pi bisulfit omdannede DNA er tilstrækkelig til optimering PCR-reaktioner, hvis 1 ug genomisk DNA blev anvendt til omdannelse input.
- Saml følgende reaktion for målamplifikation optimering af en enkelt amplikon. For multiple prøver samle reaktioner i en 96-brønds PCR-plade.
25 pi 2x reaktionsbuffer
0,5 pi dNTP Mix
5 pi 10 pM Forward Primer (Final 1 uM)
5 pi 10 pM Reverse Primer(Final 1 uM)
2 pi template bisulfit omdannet DNA
0,4 pi (5 U / pl) DNA-polymerase
12.1 pi DNase frit vand (Final reaktionsvolumen 50 pi) - Seal PCR-plade med passende klæbemiddel eller varmeforseglet film.
- Placer reaktion i et passende termiske cykler og bruge følgende cykling betingelser med en opvarmet låg:
- Udfør en indledende denaturering ved 95 ° C i 10 min.
- Denaturer ved 95 ° C i 30 sek.
- Anneal for 30 sekunder ved den specifikke T m af primere, der anvendes. Start med en annealingstemperatur nogle få ° C under Tm af primer til optimering reaktioner.
BEMÆRK: Best udglødningstemperaturer kan også bestemmes ved anvendelse af en gradient thermocycler at teste en række temperaturer. - Udfør en forlængelse ved 72 ° C i 30 sek. Forlænge forlængelse gang længere ampliconer.
- Gentag trin 3.3.3.2-3.3.3.4 i 35 cykler tilTal til indledende optimering. Højere tal cyklus kan være nødvendigt, men bør generelt undgås for at forhindre klonale amplifikationer, der vil skabe reaktion artefakter.
- Udfør en endelig forlængelse ved 72 ° C i 7 min.
- Hold reaktioner ved 4 ° C.
- Visualiser ampliconer efter side elektroforese. Alternativt kan du bruge en kapillær elektroforese DNA-chip ifølge producentens protokol.
- Bland 24 pi af PCR-reaktionen med 6 pi 5x loading dye på is og vortex.
- Lav 1 L 1X TBE løbende buffer ved at blande 200 ml 5x TBE løbende buffer og 800 ml ddH 2 O. DNA stigen fortyndes til en slutkoncentration på 0,5 ug per brønd i ddH 2 O og loading dye.
- Load brønde med 30 pi PCR-reaktioner eller stigen.
- Kør gelen ved 200 V til ~ 45 min. Stop gel løbe, når den første farvestof fronten når enden af gelen.
- Farv gelen med 5 ug / mlethidiumbromid ved at blande 5 pi 10 mg / ml i 100 ml ddH 2 O. Dæk hele gelen og lad inkuber i ~ 5 min.
- Billede gelen via et UV-lys boks eller multimodal imager ved en excitationsbølgelængde på 482 nm.
- Med henvisning til stigen, størrelse PCR amplikoner og bestemme specificitet af reaktionen ved efter multiple bånd andre end den forventede amplikonstørrelse (figur 4A og C).
- Når optimale betingelser for BS-PCR er blevet bestemt, udføre BS-PCR på eksperimentelle prøver.
- Oprens ampliconer fra resterende primere og andre reaktionskomponenter. Udfør silicasøjle rensning, SPRI perle, eller gel-baserede oprydning og kvantificering.
- Eluere amplikoner i 30 pi TE-buffer.
- Kvantificere ampliconer hjælp fluorometrisk assay ved anvendelse af producentens protokoller.
- Hvis der er flere amplikoner per prøve, pool dem på samme vægt pr volumenbeløb og opbevares ved -20 ° C.
4. NGS Bibliotek Forberedelse og Bibliotek QC
BEMÆRK: BSAS NGS bibliotek forberedelse bruger en forenklet transposome-medieret protokol med dual-indeksering (Se Materialer Liste for detaljer om biblioteket forberedelse udvælgelse kit). Denne metode giver en ekstrem hurtig og høj kapacitet rute for bibliotek konstruktion, der er valideret og viser lidt at ingen bias i bisulfit sekventering applikationer 16,19. Dual-indeksering giver mulighed for en højere multipleksering af prøver end enkelt indeksering. Andet bibliotek forberedelse stilarter kan være muligt, men er ikke blevet testet.
- Forbered NGS biblioteker fra BS PCR amplikoner i en 96-brønds PCR-plade. Fortynd ampliconer til 0,2 ng / pl for en endelig input masse af 1 ng eller 5 pi 0,2 ng / pl fortynding. Udfør en rensning af genererede biblioteker ved hjælp SPRI perler. Brug 50-90 pi SPRI perler til isolering biblioteker wed denne protokol. Mængden af forårsb perler afhænger målstørrelse af bibliotek og cyklus antal ønskede sekventeringsreaktioner.
BEMÆRK: Brug en mikropladeryster eller plade Vortexer at resuspendere perlerne.- Elueres bibliotekerne fra perlerne og overføres til en ny 96-brønds plade og tætne med varmeforsegling film til opbevaring ved -20 ° C.
- Bestemme størrelsen og koncentrationen af biblioteker (figur 4B og D).
- Kør biblioteker på et kapillarelektroforese-DNA dimensionering chip ifølge producentens protokoller.
- Brug en høj følsomhed kapillarelektroforese DNA assay for at bestemme den gennemsnitlige størrelse af detekterede bibliotekets toppe og et skøn over molaritet i henhold til producentens protokoller.
- Kvantificere biblioteker ved qPCR, hjælp primere designet mod adapter sekvenser i de genererede biblioteker og brug standarder med en kendt koncentration.
- Kør qPCR rehandlinger på en real-time instrument ved hjælp af absolutte kvantificeringsfremgangsmåder indstillingerne i overensstemmelse med producentens protokoller.
- Brug størrelse biblioteker og molforholdet kvantificering fra qPCR at beregne de molære koncentrationer af bibliotekerne.
- Kør biblioteker på et kapillarelektroforese-DNA dimensionering chip ifølge producentens protokoller.
- Fortynd biblioteker til 4 nM ved anvendelse af 10 mM Tris-Cl med 0,1% Tween-20 ved pH 8,5. Store biblioteker i en 96-brønds PCR-plade forsegles med varmeforsegling film ved -20 ° C.
5. Sequencing Biblioteker Brug af en Benchtop Sequencer
- Tø op og forberede reagenser ifølge producentens instruktioner.
- Optø 4 Nm biblioteker på is.
- Lav 1 ml 0,2 N NaOH i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Pool 4 Nm biblioteker i lige volumen mængder, hvis flere biblioteker der skal anvendes.
- Fortyndet og denaturere pooled biblioteker ifølge producentens anvisninger til den ønskede endelige molære koncentration.
- Hold fortyndet og denatureresamlet bibliotek på is indtil klar til at lægge på reagenskassetten.
- Generer en prøve plade indeholdende prøvenavne og tilsvarende indeks information og specificere at generere .fastq filer.
- Load prøve ark i den tilsvarende prøve ark mappe på sequencer.
- Tilføj alt 600 pi fortyndet og denatureret bibliotek til reagenskassetten i den tilsvarende godt.
- Kør sekventeringsreaktioner til færdiggørelse.
6. Methylering Kvantificering Dataanalyse
BEMÆRK: Der er flere programmer til rådighed for NGS dataanalyse, herunder både kommercielle og open source. Nærmere oplysninger om kørende programmer kan findes med hver enkelt pakke. Generelle instruktioner gives på hvert trin sammen med de specifikke kommandoer for denne softwarepakke. (Se Materialer List for detaljer om software, der anvendes i denne protokol).
- Import .fastq.gz filer til passende sequencing analyse rørledning fastholde kvalitetsresultater (Qscores) til brug i read trimning. (I dette eksempel program vælge 'Importer', og vælg den sekventering metode bruges til at generere læser. Vælg .fastq.gz læse filer til at importere, og fastholde Qscores fra .fastq filer til læse trimning applikationer ved at fravælge »skille kvalitetsresultater 'under' Generelt Indstillinger '. Vælg en placering til den importerede læser og vælg' Afslut '.)
- Trim og fastholde læser ved hjælp af følgende indstillinger i en NGS dataanalyse pipeline. (Til dette program skal du vælge "Trim Sekvenser 'under' NGS Core Funktioner ', og vælg den læser, der skal trimmes.)
- Behold kun læser indeholdende ≥ Q30 scoringer. (Til dette program skal du vælge "Trim ved hjælp af kvalitet score" og sætte grænsen til 0,001.)
- Behold kun læser indeholdende ≤ 1 tvetydig nukleotid. (Til dette program skal du vælge "Trim tvetydige nukleotider« og indstil»Maksimale antal uklarheder« til 1. Vælg en placering for at gemme trimmet læser og vælg 'Afslut'.)
- Kort trimmet læser til i silico bisulfit omdannet gen henvisning fra 2,2. (For eksempel software vælge 'Kort Læser til reference' under 'NGS Core Tools. Vælg trimmet læser skal kortlægges, og vælg' Næste '. Vælg den konverterede referencesekvensen og vælg' nej maskering 'under' henvisning maskering ". Vælg ' Næste '.)
- Tildel en maksimal straf for uoverensstemmelser, indsættelser og sletninger. Indstil parametrene, således at 100% af den læste længde kræves til kort med 90% sekvensidentitet. For eksempel software, tildele en score på 3 for uoverensstemmelser, indsættelser og sletninger. Tildel en score på 1 for mindste brøkdel af read længde kortlagt til reference, og tildele en score på 0,9 for minimum brøkdel af identitet mellem kortlagt læst og reference.
- For justering output genererer hver prøve som en selvstændig fil. For eksempel software, skal du vælge 'Opret enkeltstående læse kortlægninger' under 'Output indstillinger' og 'Gem' under 'Result behandling «. Vælg en placering for at gemme læse kortlægning og vælg 'Afslut'.
- Kør en variant ringer arbejdsgangen på kortlagt læser. For eksempel software, vælge 'Probabilistic Variant Detection' under 'Gen- sekventering Analysis', skal du vælge den læste kortlægning, der skal analyseres, og vælg 'Næste'. Vælg 'Ignorer uspecifikke kampe' under 'Læs filtre', og vælg 'Næste'.
- Sørg for, at sekvensen er på et depth på ≥ 1000 x ved at indstille "minimum dækning 'under' betydning« til 1.000.
- Sørg for, at varianten opkaldet er til stede i både frem og bak læser. For eksempel software, skal du vælge "Kræver tilstedeværelse i både frem og bak stande« under »variant filtre ', og vælg' Næste '.
- Export justeret, variant kaldet data som en kommenteret bord. For eksempel software, skal du vælge 'Opret kommenteret bordet' under 'Output indstillinger' og vælg et sted at gemme variant tabellen fil. Vælg 'Afslut'.
- Trim og fastholde læser ved hjælp af følgende indstillinger i en NGS dataanalyse pipeline. (Til dette program skal du vælge "Trim Sekvenser 'under' NGS Core Funktioner ', og vælg den læser, der skal trimmes.)
- Beregn 5-MC procent ved hjælp af variant frekvenser kommenteret CpG steder i området af interesse fra varianten tabellen fil. Hyppigheden af cytosin ved en referencetemperatur C i CG er 5-MC procentdel.
BEMÆRK: Ved brug variant ringer algoritmer til stærkt methylerede CpG s, erstatte CpG cytosiner med thyminer. Dette vil identify det tilknyttede cytosin er som varianter, hvilket resulterer i cytosin frekvens CpG s. - Bestem bisulfit virkningsgrad (HA) ved først at beregne procentdelen af C er ikke i CpG steder i reference (C). Multiplicer procentdelen af ikke CpG C'er efter antal samlede Ts kortlagt (T mp), og dividere med total C'er kortlagt ved henvisningen Ts (C MPT). 100 minus frekvensen beregnede den bisulfit virkningsgrad (HA), i samme bibliotek (ligning 1).
Ligning 1. bisulfit omdannelseseffektivitet.
BEMÆRK: Mens pattedyr genomer indeholder meget små mængder af ikke-CpG cytosin methylering (med undtagelse potentielt af stamceller 20), plantegenomer indeholde en betydelig mængde. For at bestemme bisulfit omdannelseseffektivitet i disse reference genomer, en egnet vej er at sekventere en del af den mitokondrielle genom eller chloroplast genom eller kendte methylerede gener til stede i plantegenomer 21 og beregning omdannelseseffektivitet som beskrevet ovenfor. Bisulfit virkningsgrad skal være ≥98% i de fleste tilfælde, med den uomvendte C'er potentielt hidrører fra ikke CpG methylering.
Representative Results
BSAS læser korrekt justeret til konverterede henvisning sekvens vil ligne Figur 5. CpG-dinukleotider kan tydeligt identificeres og methylering kan estimeres ved at observere base-opkald på CpG steder i kortlagt læser. For eksempel med methylering kontrol, vil 0% methylering resulterer i alle læser kortlagt til CpG sites containing Ts (figur 5A). 100% methylering kontrol vil resultere i alle læser kortlagt læser for CpG sites containing C'er (figur 5B).
Kvantificering af cytosin frekvens (C / C + T) ved CpG sites giver methylering frekvens i den oprindelige prøve. En repræsentativ standardkurve genereret fra hele genomet methylering kontroller (n = 3 / methylering ratio) viser lineariteten af methylering kvantificering samt præcision i kvantificering ved hver methylering ratio (figur 6). Som et eksempel på denne fremgangsmåde i alt RNA og DNA blev co-iso leret fra muse cerebellum og retina (n = 4 / gruppe). Rhodopsin ekspression selektivt udtrykt i retinal væv blev målt ved anvendelse af qPCR. Ekspression blev kun fundet i nethinden (figur 7A). Brug BSAS blev CpG methylering niveauer kvantificeres i rhodopsin promotorregionen. Kumulative methylering niveauer på tværs promotorregionen var> 80% i lillehjernen sammenlignet med <15% i nethinden (p <0,001, parametrisk t-test) (Figur 7B). BsAs methylering for mængden ydelser fra stedsspecifik methylering kvantificering og methylering niveauer kan sammenlignes på et CpG-specifikt grundlag tværs et givet genomisk region. CpG methylering niveauer i rhodopsin promotoren var signifikant højere i cerebellare prøver sammenlignet med nethinden prøver (p <0,001, parametrisk t-test på hvert CpG sted) (figur 7C).
1highres.jpg "/>
Figur 1:. Skematisk af BSAS metode Ved denne metode genomisk DNA er bisulfit omdannede at ændre unmethylation cytosiner til uraciler. Efterfølgende under PCR disse uraciler ændres til thyminer. PCR-amplifikation er rettet mod områder af interesse og meget beriger for netop disse sekvenser. De resulterende PCR-amplikoner er lavet i dobbelt-indekseret biblioteker gennem en simpel tagmentation proces. Efterfølgende bibliotekerne sekventeret på en bordmodel næste generation sequencer og sekventering læser mappes til in silico konverteret referencesekvens og procent methylering af cytosin s bestemmes i en base-specifik måde.
Figur 2:. I silico bisulfit konvertering af region af interesse Enhver region af interesse fra enhver genomisk reference kan SELECTed i silico bisulfit konvertering. Ikke-CpG cytosiner er erstattet med thymin er i referencesekvensen. CpG cytosiner forbliver cytosiner i bisulfit omdannet reference.
Figur 3:. Primer placering bisulfit PCR primere er designet mod en in silico bisulfit omdannet referencesekvens. Primere skal udformes, så de ikke overlapper CG dinukleotider eller konstrueret ved siden CG dinucleotider.
Figur 4: Eksempler på høje og dårlig kvalitet PCR amplikoner og sekventering biblioteker Repræsentative elektroferogram spor og gel viser (A) ideel amplikon til transposome-medieret bibliotek generation med en enkelt høj.koncentration produkt. (B) Library genereret fra denne amplikon viser høj koncentration og endda størrelsesfordeling. (C) Dårlig kvalitet PCR amplikoner kan være lav i størrelse, koncentration og indeholde flere produkter og / eller primerdimerer. Disse dårlige kvalitet amplikoner vil føre til (D) ikke bibliotek generation med lav koncentration og lav størrelsesfordeling.
Figur 5: Eksempler på sekventering output fra methylering kontrol. (A) i silico omdannet henvisning sekventering med CpG sites fremhævet med rødt. 0% methylering kontrol kortlagt læser til de valgte region viser thyminer (grådighed fremhæve) Kortlægning på CpG sites. (B) 100% methylering kontrol kortlagt læser vise cytosin s (blå fremhæve) kortlægning på CpG sites.
Figur 6:. Methylering kvantificering tværs af en række methylering kontrol hele genomet methylering kontrol blandet ved methylering forhold (n = 3 / ratio) fra 0% til 100% blev kvantificeret ved hjælp BSAS. Plotning kvantificering af forventede versus kvantificeret viser linearitet methylering kontrol kvantificering. På tværs af alle kontroller, der var høj præcision i methylering kvantificering.
Figur 7: Eksempel på parrede DNA-methylering og genekspressionsanalyse fra vævsprøver. (A) Rhodopsin relative mRNA-ekspression fra muse cerebellar og retinal væv. (B) Rhodopsin gennemsnitlige promotor methylering kvantificeret ved BSAS mellem cerebellar og retinal DNA (*** p <0,001, parametrisk t-test). <strong> C) CpG stedspecifikke methylering niveauer på tværs rhodopsin promotor (-244 til +6, i forhold til transkriptionsstartsitet [TSS]) i mus lillehjernen og nethinden DNA.
Discussion
BSAS muliggør fokuseret, præcis DNA methylering kvantificering med højt gennemløb kapaciteter i både antallet af prøver og antallet af mål. Derudover dette bibliotek generation hjælp transposome-medieret tagmentation kræver mindre input DNA, hurtigere og indeholder færre trin end traditionel udskæring og efterfølgende adapter ligeringsteknikker. Disse forbedringer i forhold til eksisterende metoder giver mulighed for præcis bas-niveau DNA methylering analysere ethvert mål af interesse. Desuden BSAS giver en ny metode til bekræftelse af områder af interesse (differentielt methylering regioner (DMRs), CpG øer, regulatoriske regioner), der er identificeret ved hjælp af hele genomet bisulfit 22 eller fange 23 tilgange. Brug af ortogonale bekræftelse fremgangsmåder og mere kvantitativt præcise metoder forbedrer analytiske stringens af epigenomic studier. Den høje read dybde opnås med BSAS muliggør nøjagtig kvantificering i en smal konfidensinterval, resulting i præcis kvantificering 16. Derudover kan evnen til at køre mange prøver i et enkelt forsøg forøge stikprøvestørrelsen for bekræftelser af hele genomet metoder, hvilket vil øge den statistiske effekt; en svaghed i mange nuværende epigenetiske studier. Vigtigere er det, BSAS giver en base-specifik CpG methylering kvantificering, som giver mulighed for dannelse af testbare hypoteser for epigenetisk forskning. Hypoteser såsom øget methylering på en bestemt reaktion element vil resultere i nedsat binding af en transkriptionsfaktor. BSAS kombineret med parrede mRNA-ekspression data, tilvejebringer en fremgangsmåde til opnåelse af både epigenetisk regulering og mRNA-ekspression i et enkelt stykke af væv eller cellepopulation. Forbundne målinger af regulering og udtryk også øge videnskabelig stringens og virkningen af resultaterne.
Kritiske skridt i BSAS protokollen omfatter primer design, amplikon optimering og bibliotek generation /QC. PCR bias introduceret, hvis primere ikke er udformet korrekt og forstærke på forskellige effektivitetsgevinster 8. Anvendelsen af methylering standarder, såsom enzymatisk genererede 100% og 0% cytosin methylerede standarder, kan anvendes til at bestemme graden, om nogen, af methylering kvantificering bias, og er en ordentlig metodisk kontrol ved kvantificering methylering 16. Ligeledes bør der udvises forsigtighed, når du optimerer PCR-reaktioner til frembringelse af et enkelt høj kvalitet amplikon. Hvis der ikke amplikon er til stede ved anvendelse af de foreslåede retningslinjer er beskrevet i protokollen, optimering skridt omfatter stigende PCR-cyklus numre eller bsDNA input beløb. Hvis der er flere PCR-produkter, herunder primer-dimerer, optimering trin omfatter faldende bsDNA input beløb, faldende PCR-primeren molære input koncentrationer stigende udglødningstemperaturer eller faldende PCR-cyklus nummer. En eller en kombination af disse optimeringsprocedurer giver tilstrækkelige resultater til at generere en enkelt high-kvalitet amplicon. Alternativt redesigne primere er en god tilgang til primersæt, der ikke giver et enkelt amplikon. For de regioner, hvor redesign ikke er egnet eller mulig, degenerere primersæt herunder både cytosin-og thymin er på CpG steder i forward primere og adenin-og guanin er på CpG steder i reverse primere kan arbejde. Men disse primersæt kræve yderligere optimering at sikre, at ingen PCR bias opstår, en proces uden for denne protokol. Kvalitet biblioteker er ekstremt vigtigt for succes. Sørg for, at QC foranstaltninger gennemføres for at bestemme størrelse, kvaliteten og mængden af bibliotekerne før sekventering. Sekventeringsreaktioner er tilbøjelige til svigt med input af lav kvalitet biblioteker. Bias i methylering kvantificering kan afbødes ved at sikre, methylering frekvenser er til stede i både frem og bak sekventering læser. Derudover bør kvalitet snesevis af baser der tilpasser til CpG sites være ≥Q30 for høj confidence i kvantificering. Mens andre har tidligere vist lidt at ingen bias i tagmentation reaktioner af bisulfit konverterede DNA 19, sikrer de målinger, der er beskrevet ovenfor giver mulighed for bekræftelse af lav partiskhed methylering kvantificering.
BSAS øjeblikket måler methylering på CpG sites vil imidlertid fremtidige udvidelser af denne fremgangsmåde tillader Forbundne målinger af CpG 5-HMC med tilsætning af eksperimentelle trin sondres mellem 5-MC og 5-HMC såsom indførelse af kalium perruthenat før omdannelse med bisulfit 24. Det vil øge effekten af BSAS nytte ved at tillade parret methylering, både 5-MC og 5-HMC, og udtryk data for at fastslå roller DNA methylering genekspression regulering. Transposome-medieret fremstilling af PCR amplikoner bibliotek ikke resultere i nedsat sekventering dybde ved enderne af amplificerede regioner. Derfor bør regioner med høj interesse være designet til at opholde sig i midten af amplikoner. Hvordannogensinde, fordi BSAS genererer sekventering læse dybder> 1000 X, den kvantitative nøjagtighed af 5-MC målinger nær enderne af amplificerede regioner fortsat høj.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
| Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
| Agencourt AMPure XP - PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 ml |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
| twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
| Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
| Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
| Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
| 0.1-10 μl Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
| 2-200 μl Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
| 50-1,000 μl Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
| MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
| 2.0 ml Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300 cycles |
| KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
| ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
| Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
| Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5x (1 L) |
| Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5x (10 ml) |
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
| UltraPure 10 mg/ml Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384-well block |
| DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
| SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
| QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
| TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
| Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
| TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| 384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
| Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
| EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
| ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |
References
- Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & Development. 16 (1), 6-21 (2002).
- Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
- Heard, E., Martienssen, R. A. Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms. Cell. 157 (1), 95-109 (2014).
- Baylin, S. B. DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice. Oncology. 2, Suppl 1. S4-S11 (2005).
- Baylin, S. B. The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).
- Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).
- Mikeska, T., et al. Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis. The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).
- Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In. Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).
- Dikow, N., et al. Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA. Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).
- Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues. Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).
- Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method. Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).
- Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine. Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).
- Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues. Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).
- Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing. Epigenetics & Chromatin. 6 (1), 33 (2013).
- Caruccio, N. Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition. Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Adey, A., Shendure, J. U. ltra-low-input tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing. Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).
- Smallwood, S. A., et al. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).
- Wang, J., et al. Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation. Plant Methods. 7, 39 (2011).
- Lister, R., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Ivanov, M., et al. In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes. Nucleic Acids Research. 41 (6), e72 (2013).
- Booth, M. J., et al. Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).
