Introduction
Het is meer dan een halve eeuw geleden dat het eerste verslag van natuurlijk voorkomende DNA-veranderingen in de vorm van cytosine methylatie 1. Cytosine methylatie is een gemodificeerd cytosine nucleotide aan waarin de 5e koolstofatoom op de basisring een methylgroep (5-mC), meest voorkomende in het CpG dinucleotide motief in zoogdieren genomen. De functionele aanwezigheid van 5-mC in genpromoters wordt algemeen geassocieerd met transcriptionele repressie, terwijl de afwezigheid is geassocieerd met transcriptionele activiteit 2.
Enorme vooruitgang geboekt in ons begrip van de rol van DNA-methylatie in ontwikkeling 3, transgeneration voortplanting van epigenetische profielen 4, kanker pathogenese 5,6, en een aantal andere onderzoeksgebieden. Veel van deze vooruitgang zijn in de laatste jaren nieuwe methoden ontwikkeld om DNA methylatie 7 profileren. Met de komst enpopularisering van next-generation sequencing (NGS) technieken zijn er nu een aantal methoden om DNA-methylatie profileren in een hele genoom of grote gebieden van een genoom 8. Deze benaderingen de mogelijkheid open studies ontdekking dat DNA methylatie patronen en verschillen in DNA methylering kwantificeren. Naast deze hypothese genererende aanpak is er grote behoefte aan gerichte / hypothese testen DNA methylatie kwantificatie werkwijzen.
Pyrosequencing, methylatie specifieke PCR, en directe Sanger sequencing van bisulfiet geconverteerde DNA zijn de meest gebruikte methoden voor de analyse van gerichte regio's geweest (dat wil zeggen, een promotor regio van een enkel gen of een CpG eiland) 9-12. Al deze werkwijzen afhankelijk bisulfiet conversie, een chemische deamineringsreactie waarbij gemethyleerde cytosine worden omgezet in uracil, terwijl gemethyleerde cytosine blijven intact 13,14. PCR amplificatie van bisulfite-geconverteerde DNA resultaten in vervanging van uracil met thymine 15 waardoor het differentieel methylering uit te lezen als een basis verschil. Hoewel zeer nuttig, de beperkingen van deze methoden zijn lage kwantitatieve nauwkeurigheid, korte lees- lengte, en de lage monster doorzet. Om deze beperkingen te pakken we ontwikkelden een methode die we hebben Bisulfiet Amplicon Sequencing (BSAS) 16 genoemd. Het doel van deze methode is in staat om de beoogde genomische gebieden van belang te analyseren in een groot aantal monsters met een hoge kwantitatieve nauwkeurigheid.
BSAS gebruikt elementen van bestaande methoden (bisulfiet conversie en regiospecifieke PCR amplificatie) en combineert deze met eenvoudige volgende generatie bibliotheek constructie (transposome-gemedieerde) 17 en Benchtop NGS 18 (figuur 1). Deze benadering voorziet in een kwantitatieve en een hogere throughput methode om de cytosine methylatie in elk gebied van belang. Hier presenteren wemethode in detail beschrijven aanpak voor het oplossen van problemen en de kwaliteit controleren van de BSAS proces.
Protocol
1. Nucleïnezuurisolatie van Tissue
OPMERKING: Co-isolatie van DNA en RNA uit hetzelfde weefselmonster biedt de mogelijkheid om DNA voor analyse en epigenetische gekoppeld RNA genexpressie analyse verzamelen. Het hier gegeven voorbeeld is een vorm van zuiveringskolom experimentele weefsel maar alternatieve benaderingen voor verschillende soorten monsters of andere isolatiemethoden worden gebruikt. De primaire eis voor zeer gezuiverde nucleïnezuur zonder contaminerende eiwitten of organische oplosmiddelen.
- Selecteer een stukje vers ingevroren of verse weefsel voor mechanische homogenisatie en plaats op ijs. Store of overdracht weefsel naar een 2,0 ml ronde bodem microcentrifugebuisje.
- Voeg een 5 mm roestvrijstalen kraal aan elke buis met weefsel. Voeg een geschikte hoeveelheid lysisbuffer, gebaseerd op suggesties aantal cellen of weefsel gewicht fabrikant.
- Homogeniseren van het weefsel met behulp van een parelmolen mechanische homogenisatie op30 Hz gedurende 30 sec.
OPMERKING: De frequentie en duur van de mechanische homogenisering is afhankelijk van het weefseltype. Zachtere weefsels zal volledig gehomogeniseerd met behulp van de aanbevolen instellingen, terwijl hardere weefsels nodig heeft het instellen optimalisatie. - Voer de DNA- en RNA-isolatie met silicagel spinkoloms bij kamertemperatuur volgende protocol van de fabrikant.
- Elute RNA in 50 ul van RNase-vrij water en leg ze op ijs. Gebruik RNA voor mRNA expressie analyse door qPCR.
- Elueer DNA in 100 pl TE-buffer. Herhaal elutie uit DNA kolom met elueermiddel DNA concentratie en rendement te verhogen. Gebruik DNA voor gerichte methylatie kwantificatie.
- Beoordeel de kwaliteit van DNA en RNA met een standaard spectrofotometer voor absorptie bij 230 nm, 260 nm, 280 nm en 320 nm.
OPMERKING: A260 / A280 verhouding moet ~ 1,8-2 voor hoge kwaliteit van DNA zijn. A260 / A280 verhouding moet zijn ~ 2 voor hoge kwaliteit RNA. De aanwezigheid van overmaat absorptie bij 230 nm indicAtes verontreinigingen uit het isolement procedure. - Kwaliteitscontrole het RNA verder met een capillaire elektroforese chip volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Hoge kwaliteit RNA zal een RNA integriteit nummer (RIN)> 8 hebben. De aanwezigheid van extra pieken in het elektroferogram naast rRNA pieken geven staalcontaminatie. - Kwantificeren DNA en RNA van fluorescentie volgens het protocol van de fabrikant.
Opmerking: Het gebruik van een fluorometrische test is gevoelig en specifiek voor het kwantificeren van nucleïnezuren dan spectrofotometrie alleen. - Geïsoleerd WINKEL DNA en RNA bij -80 ° C.
2. Target Identificatie en Primer Ontwerp
- Bepaal de genomische regio ('s) van belang om te worden geanalyseerd door BSAS op basis van de juiste referentie-genoom. Genpromoters van differentieel tot expressie genen zijn vaak doelwit van methylatie kwantificatie.
- Bereid een in silico bisulfiet-converted verwijzing genoom voor latere uitlijning van sequencing leest door het veranderen van de .fasta sequence-bestand in een teksteditor. In de 5'-3 'oriëntatie vervangen niet- CpG cytosine met thymine (Afbeelding 2).
- Ontwerp primer sets te gebieden van belang versterken van bisulfiet geconverteerde DNA.
- Selecteer en kopieer de onbekeerde regio van belang, in de 5'-3 'oriëntatie, in een bisulfiet-specifieke PCR-primer ontwerp-programma (figuur 3).
Opmerking: Een optimale bisulfiet-PCR amplicon lengte 250-400 bp per amplicon als bisulfiet behandeling fragmenten DNA en het is moeilijk om grote> 400 bp regio amplificeren. Als bijvoorbeeld een gebied van 1 kb van belang kunnen meerdere primerparen ontworpen om deze regio te dekken. Ontwerp amplicons te zijn van gelijke bp formaat gemakkelijk pooling. Vermijd amplicon lengtes <250 bp, omdat deze onvoldoende lengte voor bibliotheek generatie kunnen zijn. Een optimale primer lengte BSAS is>20 bp per primer. - Selecteer een Tm bereik van 55-65 ° C en een maximum Tm verschil tussen voorwaartse en reverse primers van 1-2 ° C.
- Selecteer primer paren die het beste hebben betrekking op de regio van belang. Niet primers die CpG bevatten of direct naast CpG selecteren, omdat dit vertekening veroorzaken in de PCR reacties. Gebruik standaard PCR-primers die uit een aantal academische of commerciële aanbieders kunnen worden besteld.
- Reconstrueren gevriesdroogde primers in RNase / DNase-vrij water bij een werkvoorraad van 100 uM.
- Selecteer en kopieer de onbekeerde regio van belang, in de 5'-3 'oriëntatie, in een bisulfiet-specifieke PCR-primer ontwerp-programma (figuur 3).
- WINKEL PCR primers bij -20 ° C. Verdunnen 100 uM primer voorraad tot 10 uM werkvoorraad voor PCR-reacties.
3. Bisulfiet Specifieke PCR-optimalisatie
OPMERKING: Bij bisulfiet omzetting van genomisch DNA, een aantal verschillende commerciële kits voor bisulfiet conversie beschikbaar. Selecteer de kit of protocol die het beste past bij de geplande experiment.
<ol>OPMERKING: 1-2 pl bisulfiet geconverteerde DNA voldoende optimalisatie PCR-reacties als 1 ug genomisch DNA werd gebruikt voor de conversie invoer.
- Monteer de volgende reactie voor doelamplificatie optimalisatie van een enkele amplicon. Voor meerdere monsters assembleren reacties in een 96-well PCR plaat.
25 pi 2x reactiebuffer
0,5 ul dNTP Mix
5 ul 10 uM Forward Primer (Finale 1 uM)
5 pl 10 pM Reverse Primer(Finale 1 uM)
2 pl matrijs bisulfiet geconverteerd DNA
0.4 gl (5 U / pl) DNA polymerase
12.1 ul DNase-vrij water (Final reactie volume 50 pi) - Seal PCR plaat met geschikt hechtmiddel of met warmte gelaste film.
- Plaats reactie in een geschikte PCR-apparaat en gebruik de volgende fietsen voorwaarden met een verwarmd deksel:
- Voer een initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 10 min.
- Denatureren bij 95 ° C gedurende 30 sec.
- Ontlaten gedurende 30 seconden op een specifieke Tm primers gebruikt. Begin bij een annealing temperatuur enkele ° C onder de Tm van de primer optimalisatie reacties.
OPMERKING: Beste annealing temperaturen kunnen ook worden bepaald met een gradient thermische cycler een temperatuurbereik testen. - Voer een verlenging bij 72 ° C gedurende 30 sec. Het verlengen van de verlenging tijd voor langere amplicons.
- Herhaal de stappen 3.3.3.2-3.3.3.4 voor 35 cycli teTal voor de eerste optimalisatie. Hogere aantallen cyclus kan het nodig zijn, maar moet in het algemeen worden vermeden om klonale amplificaties die reactie artefacten zal creëren voorkomen.
- Voer een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 7 min.
- Houd reacties bij 4 ° C.
- Visualiseer ampliconen door PAGE elektroforese. U kunt ook gebruik maken van een capillaire elektroforese van DNA-chip volgens het protocol van de fabrikant.
- Meng 24 gl van de PCR reactie met 6 gl 5x lading kleurstof op ijs en vortex.
- Maak 1 liter 1x TBE lopende buffer door het mengen van 200 ml 5x TBE lopende buffer en 800 ml van DDH 2 O. Verdun DNA ladder een eindconcentratie van 0,5 ug per putje in DDH 2 O en ladingskleurstof.
- Putten belasting met 30 pi van PCR-reacties of ladder.
- Voer de elektroforese bij 200 V gedurende ~ 45 min. Stop de gel punt toen de eerste kleurstof voorste einde van de gel bereikt.
- Vlekken op de gel bij 5 pg / mlethidium bromide door mengen 5 ui 10 mg / ml in 100 ml van DDH 2 O. Bedek de hele gel en laat incubeer gedurende ~ 5 min.
- Afbeelding de gel via een UV lichtbak of multimodale imager bij een excitatiegolflengte van 482 nm.
- Met betrekking tot de ladder, de grootte PCR amplicons en bepaalt specificiteit van de reactie door te zoeken naar andere dan de verwachte amplicongrootte meerdere banden (Figuur 4A en C).
- Zodra de optimale omstandigheden voor BS-PCR zijn bepaald, voert BS-PCR experimentele monsters.
- Zuiver amplicons blijft, primers en andere reactiecomponenten. Voeren silica kolom zuivering, SPRI kraal, of gel-gebaseerde clean-up en kwantificering.
- Elueer amplicons in 30 ui TE-buffer.
- Kwantificeren amplicons met fluorometrische assay onder gebruikmaking van protocollen van de fabrikant.
- Als er meerdere amplicons per monster, combineren op hetzelfde gewicht per volumebedragen en bewaar bij -20 ° C.
4. NGS Bibliotheek Voorbereiding en Bibliotheek QC
OPMERKING: BSAS NGS bibliotheek voorbereiding maakt gebruik van een vereenvoudigde-transposome gemedieerde protocol met dual-indexering (zie Materialen lijst voor meer informatie over de bibliotheek voorbereiding kit selectie). Deze methode zorgt voor een uiterst snelle en high-throughput route voor de bibliotheek constructie die is gevalideerd en toont weinig tot geen bias in bisulfietsequencing toepassingen 16,19. Dual-indexering zorgt voor een hogere multiplexing van monsters dan enkele indexering. Andere bibliotheek voorbereiding stijlen kan mogelijk zijn, maar zijn niet getest.
- Bereid NGS bibliotheken BS PCR amplicons in een 96-well PCR plaat. Verdun amplicons tot 0,2 ng / ul voor een laatste ingang massa van 1 ng of 5 ui van 0,2 ng / ul verdunning. Voer een clean-up van de gegenereerde bibliotheken gebruik SPRI kralen. Gebruik 50-90 ul SPRI kralen voor het isoleren van bibliotheken wet dit protocol. Het volume van de SPRI kralen hangt op doel grootte van de bibliotheek en de cyclus aantal gewenste sequencing reacties.
OPMERKING: Gebruik een microplaatschudder of plaat vortexer aan kralen resuspenderen.- Elueer de bibliotheken van de kralen en naar een nieuwe 96-well plaat en afdichting met smeltlassen film voor opslag bij -20 ° C.
- Bepaal de grootte en concentratie van bibliotheken (figuur 4B en D).
- Voer bibliotheken op een capillaire elektroforese DNA dimensionering chip volgens de protocollen van de fabrikant.
- Gebruik een hoge gevoeligheid capillaire elektroforese DNA test om de gemiddelde grootte van de bibliotheek gedetecteerde pieken en een schatting van molariteit volgens de protocollen van de fabrikant bepaald.
- Kwantificeren bibliotheken door qPCR, met primers tegen de adaptersequenties in de geproduceerde bibliotheken en gebruik standaarden met bekende concentratie.
- Run qPCR reacties op een real-time instrument met behulp van de absolute kwantificatie instellingen volgens de protocollen van de fabrikant.
- Met de grootte van bibliotheken en de molaire kwantificatie van qPCR de molaire concentraties van de bibliotheken te berekenen.
- Voer bibliotheken op een capillaire elektroforese DNA dimensionering chip volgens de protocollen van de fabrikant.
- Verdun bibliotheken 4 nM met 10 mM Tris-Cl met 0,1% Tween-20 bij pH 8,5. WINKEL bibliotheken in een 96-well PCR plaat afgedicht met smeltlassen film bij -20 ° C.
5. Sequencing Bibliotheken Met behulp van een tafelmodel Sequencer
- Ontdooien en reagentia voor te bereiden volgens de instructies van de fabrikant.
- Ontdooi 4 nM bibliotheken op ijs.
- Voeg 1 ml 0,2 N NaOH in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Pool 4 nM bibliotheken in gelijke volumes, indien meerdere bibliotheken worden gebruikt.
- Verdunnen en denatureren samengevoegd bibliotheken volgens de instructies van de fabrikant om het gewenste uiteindelijke molaire concentratie.
- Houd verdund en denaturerengepoolde bibliotheek op ijs tot klaar om te laden op reagens cartridge.
- Genereer een staalkaart bevatten steekproef namen en bijbehorende index informatie en geef alleen .fastq te genereren bestanden.
- Load staalkaart in de corresponderende staalkaart map op de sequencer.
- Voeg een totaal van 600 ui verdund en gedenatureerd bibliotheek om het reagens patroon in de overeenkomstige put.
- Voer de sequentiëringsreacties voltooid.
6. Methylering Kwantificering Data Analyse
LET OP: Er zijn meerdere programma's beschikbaar voor NGS data-analyse met inbegrip van zowel commerciële als open source. Details over het uitvoeren van programma's kan worden gevonden met elk specifiek pakket. Algemene instructies worden gegeven bij elke stap, samen met de specifieke commando's voor deze software pakket. (Zie Materialen lijst voor meer informatie over software die wordt gebruikt in dit protocol).
- Bestanden importeren .fastq.gz in geschikte sequencing analyse pijplijn kwaliteit score (Qscores) behouden voor gebruik in lees trimmen. (Voor dit voorbeeld programma te selecteren 'Import' en selecteer de sequencing methode gebruikt voor het genereren leest. Selecteer .fastq.gz Lees bestanden te importeren en te behouden Qscores van .fastq bestanden voor lezen trimmen toepassingen door 'Gooi kwaliteit scoort' deselecteren onder 'Algemeen Opties '. Selecteer een locatie voor de geïmporteerde leest en selecteer' Finish '.)
- Trimmen en te behouden leest met behulp van de volgende instellingen in een NGS data-analyse pijplijn. (Voor dit programma te selecteren 'Trim Sequences' onder 'NGS Core Tools' en selecteer de leest te worden bijgesneden.)
- Behouden leest alleen ≥ Q30 scores bevatten. (Voor dit programma te selecteren 'Trim met behulp van de kwaliteit scores' en zet de limiet op 0.001.)
- Behouden leest alleen met ≤ 1 dubbelzinnig nucleotide. (Voor dit programma te selecteren 'Trim dubbelzinnige nucleotiden' en zet de'Maximum aantal onduidelijkheden' op 1. Selecteer een locatie voor opslag bijgesneden leest en selecteer 'Finish'.)
- Kaart getrimd leest de in silico bisulfiet omgezet gen verwijzing van 2,2. (Voor het voorbeeld software. Kies 'Kaart' leest aan Reference 'onder' NGS Core Tools 'Selecteer getrimd leest in kaart worden gebracht en selecteer' volgende '. Selecteer de geconverteerde referentie sequentie en selecteer' nee masking 'onder' verwijzing maskeren '. Selecteer' volgende '.)
- Wijs een maximumstraf voor mismatches, inserties en deleties. Parameters zodanig dat 100% van de gelezen lengte vereist naar kaart 90% sequentie identiteit. Bijvoorbeeld software, wijs een score van 3 voor mismatches, inserties en deleties. Wijs een score van 1 voor de minimale fractie van lees- lengte toegewezen aan referentie, en wijs een score van 0,9 voor de minimale fractie van de identiteit tussen neerzetten lezen en referentie.
- Voor uitlijning uitgang te genereren elk monster als een onafhankelijke bestand. Bijvoorbeeld software, kies 'Create stand-alone te lezen mappings' onder 'Output opties' en 'Save' onder 'Resultaat handling'. Selecteer een locatie om de lees mapping opslaan en selecteer 'Voltooien'.
- Voer een variant bellen workflow op afgebeelde leest. Voor het voorbeeld software, kies 'Probabilistic Variant Detection' onder 'Resequencing Analysis', selecteert u de lees mapping te analyseren en selecteer 'volgende'. Selecteer 'Negeer niet-specifieke wedstrijden' onder 'Lees filters' en selecteer 'volgende'.
- Zorg ervoor dat de volgorde is op een depe van ≥ 1000 X door het instellen van de 'minimale dekking' onder 'Betekenis' naar 1000.
- Zorg ervoor dat de variant gesprek aanwezig is in zowel vooruit is en achteruit leest. Bijvoorbeeld software, kies 'vereist aanwezigheid in zowel vooruit als achteruit stands' onder 'Variant filters' en selecteer 'volgende'.
- Export uitgelijnd, variant genaamd gegevens als een geannoteerde tafel. Bijvoorbeeld software, kies 'Maak geannoteerde table' onder 'Output opties' en selecteer een locatie om de variant tafel bestand op te slaan. Selecteer 'Finish'.
- Trimmen en te behouden leest met behulp van de volgende instellingen in een NGS data-analyse pijplijn. (Voor dit programma te selecteren 'Trim Sequences' onder 'NGS Core Tools' en selecteer de leest te worden bijgesneden.)
- Bereken 5-mC percentage met behulp van de variant frequenties geannoteerde CpG sites in de regio van belang van de variant tafel bestand. De frequentie van cytosine op een referentie C in CG is de 5-mC percentage.
OPMERKING: Wanneer u variant belt algoritmen voor zeer gemethyleerde CpG's, vervang CpG cytosines met thyminen. Dit zal identify de afgebeelde cytosine als varianten, waardoor cytosine frequentie CpG's. - Bepaal bisulfiet conversie efficiëntie (BSC) door eerst het berekenen van het percentage C niet in CpG sites in de (C). Vermenigvuldig het percentage niet CpG C door totale aantal T's toegewezen (T mp), en delen door de totale C's toegewezen aan de referentie T (C MPT). 100 min de berekende frequentie is het bisulfiet conversie efficiëntie (BSC) van die bibliotheek (vergelijking 1).
Vergelijking 1. Bisulfiet omzettingsrendement.
OPMERKING: Terwijl zoogdieren genomen bevatten zeer lage hoeveelheden niet-CpG cytosine methylatie (met uitzondering potentieel van stamcellen 20), het genoom van planten bevatten een aanzienlijke hoeveelheid. Om bisulfiet omzettingsrendement bepalen deze reference genomen, een geschikte weg is om een deel van het mitochondriale genoom of chloroplastgenoom of bekende gemethyleerde genen die aanwezig zijn in plantaardig genoom sequentie 21 en berekenen omzettingsrendement zoals hierboven beschreven. Bisulfiet conversie efficiëntie ≥98% in de meeste gevallen, met omgezette C's mogelijk uit niet CpG methylering.
Representative Results
BSAS correct leest afgestemd op geconverteerde referentie sequentie zal Figuur 5 lijken. CpG dinucleotiden duidelijk kan worden geïdentificeerd en methylatie staten kan worden geschat door het observeren basis gesprekken op CpG sites in de kaart gebracht leest. Bijvoorbeeld, met methylering bedieningsorganen zullen 0% methylatie leiden alle leest toegewezen aan CpG bevattende T's (Figuur 5A). 100% methylatie controles leiden alle leest toegewezen leest CpG bevattende C's (Figuur 5B).
Kwantificering van cytosine frequentie (C / C + T) en CpG methylering geeft de frequentie in het oorspronkelijke monster. Een representatieve standaardcurve gegenereerd gehele genoom methylering controles (n = 3 / methylering verhouding) toont lineariteit van methylatie kwantificering en precisie kwantificering bij elke methylering verhouding (figuur 6). Als voorbeeld van deze werkwijze in totaal RNA en DNA werden samen iso kend van muis cerebellum en retina (n = 4 / groep). Rhodopsin expressie selectief uitgedrukt in retinale weefsel werd gemeten met qPCR. Expressie werd alleen gedetecteerd in retina (figuur 7A). Met behulp van BSAS, werden CpG methylatie niveaus gekwantificeerd in de rhodopsin promotor regio. Cumulatieve methylatie niveaus in het promotorgebied waren> 80% in het cerebellum vergeleken met <15% in de retina (p <0,001, t-parametrische test) (Figuur 7B). BSAS methylatie kwantificatie profiteert van locatie-specifieke methylatie kwantificatie en methylatie niveaus kunnen worden vergeleken op een CpG-specifieke basis in een bepaalde genomische regio. CpG methylering in de rhodopsine promoter waren significant hoger in cerebellaire monsters vergeleken met retina monsters (p <0,001, t-parametrische test bij elke CpG plaatse) (Figuur 7C).
1highres.jpg "/>
Figuur 1:. Schema van BSAS werkwijze In deze werkwijze, genomisch DNA bisulfiet omgezet in unmethylation cytosines wijzigen om uracillen. Vervolgens gedurende PCR die uracillen gewijzigd naar thymines. PCR amplificatie wordt tegen gebieden van belang en zeer verrijkt voor slechts deze sequenties. Het resulterende PCR amplicons geschieden op tweeërlei geïndexeerde bibliotheken door een eenvoudig tagmentation proces. Vervolgens worden de bibliotheken sequentie op een benchtop volgende generatie sequencer en de sequentie leest worden toegewezen aan de in silico omgezet referentiesequentie en percentage methylatie van cytosine wordt bepaald in een base-specifieke wijze.
Figuur 2:. In silico bisulfiet omzetting van regio van belang Elke regio van belang uit een genomische referentie kan Selec zijnted voor in silico bisulfiet conversie. Niet-CpG cytosines vervangen door thymine in de referentiesequentie. CpG cytosines blijven cytosinen in de bisulfiet omgezet referentie.
Figuur 3:. Primer plaatsing Bisulfiet PCR-primers zijn ontworpen tegen een in silico bisulfiet omgezet referentie sequentie. Primers worden ontworpen dat zij geen CG dinucleotiden overlappen of naast ontworpen CG dinucleotiden.
Figuur 4: Voorbeelden van hoge en lage kwaliteit PCR ampliconen en sequencing bibliotheken Vertegenwoordiger elektroferogram sporen en gel tonen (A) ideaal amplicon voor-transposome gemedieerde bibliotheek generatie met één hoog.concentratie artikel. (B) bibliotheek gegenereerd uit deze amplicon toont hoge concentratie en zelfs grootteverdeling. (C) Slechte PCR amplicons kunnen lage grootte, concentratie en meerdere producten en / of primer dimeren bevatten. Deze slechte kwaliteit amplicons leidt tot (D) mislukt bibliotheek generatie met een lage concentratie en lage grootteverdeling.
Figuur 5: Voorbeelden van sequencing output van methylering controles. (A) In silico omgezet verwijzing sequencing met CpG locaties in het rood gemarkeerd. 0% methylatie controle in kaart gebracht leest om de geselecteerde regio blijkt thyminen (hebzucht hoogtepunt) in kaart brengen op CpG sites. (B) 100% methylatie controle in kaart gebracht leest tonen cytosine's (blauwe markering) in kaart brengen op CpG sites.
Figuur 6:. Methylering kwantificatie over een reeks methylatie controles Volledige genoomanalyse methylering controles gemengd bij methylering's (n = 3 / ratio) van 0% tot 100% werden gekwantificeerd met BSAS. Plotten kwantificering van verwachte versus gekwantificeerde demonstreert lineariteit van methylatie controle kwantificatie. Over alle controles, was er een hoge precisie in methylatie kwantificatie.
Figuur 7: Voorbeeld van gekoppelde DNA-methylatie en genexpressie analyse van weefselmonsters. (A) Rhodopsin relatieve mRNA expressie van de muis cerebellaire en netvliesweefsel. (B) Rhodopsin gemiddelde promotor methylering gekwantificeerd door BSAS tussen cerebellaire en retinale DNA (*** p <0,001, parametrische t-test). <strong> C) CpG site-specific methylatie niveaus in rhodopsin promotor (-244 tot +6, ten opzichte van de transcriptie start site [TSS]) in de muis cerebellum en netvlies DNA.
Discussion
BSAS zorgt voor gerichte, nauwkeurige DNA-methylatie kwantificatie met hoge doorvoer mogelijkheden in zowel het aantal monsters en het aantal doelen. Daarnaast is deze bibliotheek generatie behulp-transposome gemedieerde tagmentation vereist minder ingang DNA, is sneller en bevat minder stappen dan de traditionele scheren en de daaropvolgende adapter ligatietechnieken. Deze verbeteringen ten opzichte van bestaande methoden maken het precies base-level DNA methylatie analyse van enige doelwit van belang. Bovendien BSAS biedt een nieuwe methode voor de bevestiging van de regio's van belang (differentieel methylatie regio's (DMR's), CpG eilanden, regulerende regio's) die zijn geïdentificeerd door middel van genoomwijde bisulfite 22 of vastleggen 23 benaderingen. Met behulp van orthogonale bevestiging benaderingen en meer kwantitatief nauwkeuriger methoden verbetert de analytische strengheid van epigenomisch studies. De hoge lees diepte bereikt met BSAS accurate kwantificering in een smal interval rejectsconsulting in nauwkeurige kwantificatie 16. Bovendien kan de mogelijkheid om veel monsters uitgevoerd in een enkel experiment de monstergrootte voor bevestigingen van volledige genoom methoden, waarvan de statistische kracht zal toenemen toenemen; Een zwakte van veel van de huidige epigenetische studies. Belangrijk BSAS biedt basespecifieke CpG methylering kwantificering, waardoor het genereren van testbare hypothesen epigenetisch onderzoek. Hypotheses zoals verhoogde methylatie in een specifiek responselement leidt tot verminderde binding van een specifieke transcriptiefactor. BSAS combinatie met gepaarde mRNA expressie data, een werkwijze voor het verkrijgen van zowel epigenetische regulatie en mRNA expressie in een stuk weefsel of celpopulatie. Gepaarde metingen van regulering en expressie verhogen ook de wetenschappelijke nauwkeurigheid en de impact van de bevindingen.
Kritische stappen binnen de BSAS protocol omvatten primer ontwerp, amplicon optimalisatie en bibliotheek generatie /QC. PCR voorspanning wordt geïntroduceerd als primers niet goed zijn ontworpen en versterken op verschillende efficiëntie 8. Het gebruik van methylering standaarden, zoals enzymatisch gegenereerde 100% en 0% cytosine gemethyleerd normen kan worden gebruikt om de mate te bepalen, indien aanwezig, van methylatie kwantificering bias, en is een goede methodologische controle kwantificering methylatie 16. Ook moet erop worden gelet bij het optimaliseren van PCR-reacties voor het genereren van een enkele hoogwaardige amplicon. Als er geen amplicon aanwezig is met behulp van de voorgestelde richtlijnen beschreven in het protocol, optimalisatie stappen omvatten het verhogen van de PCR-cyclus nummers of bsDNA ingang hoeveelheid. Als er meerdere PCR producten, waaronder primer dimeren, optimalisatiestappen omvatten afnemende bsDNA ingang bedrag verlagen van de PCR-primer molaire ingangsconcentraties verhogen annealing temperaturen verminderen of PCR- cyclusnummer. Eén of een combinatie van deze optimalisatie procedures levert voldoende resultaten één hig genererenh kwaliteit amplicon. Als alternatief herinrichten primers is een goede aanpak voor primer sets die geen enkele amplicon hoeft opleveren. Voor de regio's waar herontwerp is niet geschikt of mogelijk is, ontaarden primersets waaronder zowel cytosine en thymine bij CpG sites in voorwaartse primers en adenine en guanine bij CpG sites in omgekeerde primers kunnen werken. Echter, deze primer sets moeten verdere optimalisatie geen PCR voorspanning optreedt, een werkwijze buiten het toepassingsgebied van dit protocol. Kwaliteit bibliotheken zijn uitermate belangrijk voor succes. Zorg ervoor dat QC maatregelen worden uitgevoerd om te bepalen omvang, kwaliteit en kwantiteit van bibliotheken voor sequencing. Sequentiëringsreacties zijn gevoelig voor storing met ingang van lage kwaliteit bibliotheken. Bias in methylering kwantificatie kan worden beperkt door ervoor te zorgen dat methylatie frequenties aanwezig zijn in zowel vooruit als achteruit sequencing leest. Bovendien moet de kwaliteit scores van basen uitlijnen om CpG sites ≥Q30 voor hoge confidence in kwantificatie. Terwijl anderen hebben aangetoond voorheen weinig tot geen bias in tagmentation reacties van bisulfiet geconverteerde DNA-19, het waarborgen van de hierboven beschreven metrics zorgt voor bevestiging van laag vooringenomenheid methylatie kwantificatie.
BSAS Momenteel meet methylatie op CpG zal echter toekomstige uitbreidingen van deze methode gepaarde metingen van CpG 5-HMC mogelijk met de toevoeging van experimentele stappen onderscheiden 5-mC en 5-HMC zoals invoering kalium perruthenaat voor bisulfiet conversie 24. Dit zal het effect van BSAS nut om genexpressie regulerende rol van DNA methylering bepalen verhogen doordat voor gepaarde methylatie, zowel 5-mC en 5-HMC en expressie data. Transposome gemedieerde bibliotheek bereiding van PCR amplicons resulteert in verminderde sequencing diepte de uiteinden van geamplificeerde gebieden. Daarom moet gebieden van groot belang zijn ontworpen in het midden van amplicons te verblijven. Hoeooit, omdat BSAS genereert sequencing lees diepte> 1000 X, de kwantitatieve nauwkeurigheid van 5-mC metingen nabij de einden van geamplificeerde regio blijft hoog.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
| Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
| Agencourt AMPure XP - PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 ml |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
| twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
| Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
| Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
| Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
| 0.1-10 μl Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
| 2-200 μl Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
| 50-1,000 μl Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
| MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
| 2.0 ml Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300 cycles |
| KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
| ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
| Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
| Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5x (1 L) |
| Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5x (10 ml) |
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
| UltraPure 10 mg/ml Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384-well block |
| DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
| SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
| QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
| TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
| Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
| TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| 384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
| Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
| EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
| ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |
References
- Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & Development. 16 (1), 6-21 (2002).
- Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
- Heard, E., Martienssen, R. A. Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms. Cell. 157 (1), 95-109 (2014).
- Baylin, S. B. DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice. Oncology. 2, Suppl 1. S4-S11 (2005).
- Baylin, S. B. The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).
- Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).
- Mikeska, T., et al. Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis. The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).
- Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In. Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).
- Dikow, N., et al. Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA. Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).
- Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues. Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).
- Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method. Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).
- Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine. Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).
- Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues. Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).
- Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing. Epigenetics & Chromatin. 6 (1), 33 (2013).
- Caruccio, N. Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition. Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Adey, A., Shendure, J. U. ltra-low-input tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing. Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).
- Smallwood, S. A., et al. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).
- Wang, J., et al. Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation. Plant Methods. 7, 39 (2011).
- Lister, R., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Ivanov, M., et al. In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes. Nucleic Acids Research. 41 (6), e72 (2013).
- Booth, M. J., et al. Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).
