Introduction
بعد مضي أكثر من نصف قرن منذ التقرير الأول للتحدث بشكل طبيعي التعديلات DNA على شكل السيتوزين مثيلة 1. السيتوزين مثيلة هو قاعدة السيتوزين النوكليوتيدات المعدلة حيث الكربون 5 عشر على عصابة القاعدة لديه مجموعة الميثيل (5-MC)، تحدث في اغلب الاحيان في ثنائي النوكليوتيد عزر الدليل السياسي الشامل في جينومات الثدييات. وجود وظيفي من 5-MC في المروجين الجين يرتبط عموما القمع النسخي، في حين يرتبط غياب النشاط مع النسخي 2.
وقد تم إحراز تقدم هائل في فهمنا لدور الحامض النووي في التنمية 3، نشر transgeneration لمحات جينية 4، والسرطان المرضية 5،6، وعدد من المجالات البحثية الأخرى. وصلنا العديد من هذه الإنجازات في السنوات القليلة الماضية حيث تم تطوير منهجيات جديدة للصفحة الشخصية DNA مثيلة 7. مع ظهور وتعميم من الجيل المقبل من التسلسل (NGS) تقنيات وهناك الآن عدد من الطرق للصفحة الشخصية الحامض النووي عبر الجينوم بأكمله أو مناطق واسعة من الجينوم 8. هذه النهج تفتح إمكانية اكتشاف الدراسات التي تقيس كمية DNA أنماط مثيلة والاختلاف في الحامض النووي. وبالإضافة إلى هذه الأساليب المولدة للفرضية، هناك حاجة كبيرة لاستهداف / فرضية DNA اختبار طرق مثيلة الكميات.
وكانت سلسلة البايرو، مثيلة PCR معين، وتسلسل سانجر المباشر للDNA تحويل بيسلفيت الطرق الأكثر استخداما لتحليل المناطق المستهدفة (أي منطقة المروج من جين واحد أو جزيرة الدليل السياسي الشامل) 9-12. كل من هذه الطرق تعتمد على تحويل بيسلفيت، وهو رد فعل نزع الأمين الكيميائي حيث يتم تحويلها لالسيتوزين unmethylated إلى اليوراسيل، في حين لا تزال في السيتوزين ميثليته سليمة 13،14. PCR التضخيم من bisulfite-نتائج فحص الحمض النووي المحولة في استبدال واليوراسيل مع الثايمين 15 السماح للمثيلة التفاضلية لقراءة بها باعتبارها الفرق القاعدة. بينما مفيدة للغاية، والقيود المفروضة على هذه الطرق تشمل منخفضة الدقة الكمية، طول قراءة القصير، وانخفاض الإنتاجية عينة. لمعالجة هذه القيود قمنا بتطوير طريقة لدينا وصف بيسلفيت Amplicon تسلسل (المقايضة) 16. والهدف من هذه الطريقة هو أن تكون قادرة على تحليل المناطق الجينومية الهدف من الفائدة في عدد كبير من العينات بدقة كمية عالية.
يستخدم المقايضة عناصر من الأساليب القائمة (تحويل بيسلفيت والخاصة بكل منطقة التضخيم PCR) ويجمعها مع الجيل المقبل بسيط البناء مكتبة (بوساطة transposome) 17 والفوق NGS 18 (الشكل 1). ويوفر هذا النهج لطريقة الإنتاجية أكثر الكمي والتعليم العالي لدراسة مثيلة السيتوزين في أي منطقة من الفائدة. هنا نقدمطريقة بالتفصيل ووصف النهج لاستكشاف وفحص الجودة في عملية المقايضة.
Protocol
1. حمض النووي عزل من الأنسجة
ملاحظة: شارك في عزل DNA و RNA من عينات الأنسجة نفسها يتيح الفرصة لجمع الحمض النووي لتحليل جينية وRNA يقترن لتحليل التعبير الجيني. المثال المذكور هنا هو شكل من أشكال عمود تنقية من الأنسجة التجريبية ولكن النهج البديلة لأنواع عينة مختلفة أو أساليب عزل أخرى يمكن استخدامها. الشرط الأساسي هو للحمض النووي عالي النقاء دون تلويث البروتين أو المذيبات العضوية.
- حدد قطعة من النسيج الطازجة المجمدة أو الطازجة لتجانس الميكانيكية ووضع على الجليد. متجر أو الأنسجة نقل إلى 2.0 مل جولة القاع أنبوب microcentrifuge.
- إضافة واحد 5 مم الفولاذ المقاوم للصدأ حبة لكل أنبوب يحتوي على الأنسجة. إضافة كمية مناسبة من تحلل العازلة، بناء على اقتراحات المصنعة من عدد الخلايا أو الأنسجة الوزن.
- تجانس الأنسجة باستخدام التجانس الميكانيكية طاحونة حبة في30 هرتز لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: تواتر ومدة التجانس الميكانيكية تعتمد على نوع الأنسجة. سوف الأنسجة ليونة التجانس تماما باستخدام الإعدادات الموصى بها، في حين أن الأنسجة أكثر صرامة تحتاج إلى وضع الأمثل. - تنفيذ DNA و RNA العزل باستخدام أعمدة السيليكا تدور في درجة حرارة الغرفة التالية بروتوكول الشركة الصانعة.
- أزل الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه ومكان على الجليد. استخدام الحمض النووي الريبي لتحليل مرنا التعبير QPCR.
- أزل الحمض النووي في 100 ميكرولتر من TE العازلة. تكرار شطف قبالة العمود DNA باستخدام شاطف لزيادة تركيز الحمض النووي والعائد. استخدام الحمض النووي لاستهداف الكميات مثيلة.
- تقييم جودة DNA و RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي القياسي لالامتصاصية في 230 نانومتر، 260 نانومتر و 280 نانومتر، و 320 نانومتر.
ملاحظة: يجب أن تكون نسبة A260 / A280 ~ 1.8-2 لDNA ذات جودة عالية. وينبغي أن تكون نسبة A260 / A280 ~ 2 لRNA ذات جودة عالية. وجود فائض الامتصاصية في 230 نانومتر الهنديةالملوثات آتش من إجراء العزل. - جودة الاختيار RNA مزيد باستخدام رقاقة الكهربائي الشعري وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: عالية الجودة RNA سيكون له عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين)> 8. وجود قمم إضافية في رحلاني بالإضافة إلى قمم الريباسي تشير تلوث العينة. - تحديد DNA و RNA من فحص الفلورسنت وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
ملاحظة: استخدام مقايسة فلوروميتريك هو أكثر حساسية ومحددة لقياس الأحماض النووية من القياس الطيفي وحدها. - متجر DNA و RNA معزولة في -80 ° C.
2. تحديد الهدف والتصميم التمهيدي
- تحديد المنطقة الجينومية (ق) من الفائدة ليتم تحليلها من قبل المقايضة على أساس تسلسل الجينوم مرجعية المناسب. المروجين جين من الجينات وأعرب تفاضلي أهدافا مشتركة للمثيلة الكميات.
- إعداد في سيليكون بيسلفيت-تحويلإد الجينوم مرجعية لمحاذاة في وقت لاحق من التسلسل يقرأ عن طريق تغيير ملف تسلسل .fasta في محرر النص. في التوجه لل3 5'"، استبدل الدليل السياسي الشامل غير السيتوزين مع الثايمين في (الشكل 2).
- التصميم التمهيدي يحدد لتضخيم المناطق ذات الاهتمام من DNA تحويل بيسلفيت.
- تحديد ونسخ المنطقة غير محول من الفائدة، في التوجه لل3 5'"، إلى PCR برنامج التصميم التمهيدي بيسلفيت محددة (الشكل 3).
ملاحظة: والأمثل بيسلفيت-PCR طول amplicon هو 250-400 شركة بريتيش بتروليوم في amplicon كأجزاء العلاج بيسلفيت الحمض النووي وأنه من الصعب لتضخيم مناطق غليان كبيرة> 400. إذا، على سبيل المثال، وهي منطقة من 1 كيلوبايت هي المصالح، أزواج التمهيدي متعددة ويمكن تصميم لتغطية هذه المنطقة. amplicons تصميم لتكون متساوية في الحجم BP لسهولة تجميع. تجنب أطوال amplicon <250 BP لأن هذه قد تكون ذات طول كاف لتوليد المكتبة. طول التمهيدي الأمثل لالمقايضة هو>20 شركة بريتيش بتروليوم في التمهيدي. - تحديد نطاق T م من 55-65 درجة مئوية، وبحد أقصى T م الفرق بين الأمام والاشعال من 1-2 ° C عكس.
- تحديد أزواج التمهيدي أن أفضل تغطية المنطقة من اهتمام. لم تقم بتحديد الاشعال التي تحتوي على مواقع الدليل السياسي الشامل أو هي المتاخمة مباشرة إلى مواقع الدليل السياسي الشامل، وهذا سوف يسبب التحيز في التفاعلات PCR. استخدام بادئات PCR القياسية التي يمكن طلبها من أي عدد من مقدمي الأكاديمي أو التجاري.
- إعادة الاشعال مجفف بالتجميد في ريبونوكلياز / الدناز المياه مجانا في الأسهم العمل من 100 ميكرومتر.
- تحديد ونسخ المنطقة غير محول من الفائدة، في التوجه لل3 5'"، إلى PCR برنامج التصميم التمهيدي بيسلفيت محددة (الشكل 3).
- متجر الاشعال PCR في -20 ° C. تمييع 100 ميكرومتر الأسهم التمهيدي إلى 10 ميكرومتر الأسهم العمل للتفاعلات PCR.
3. بيسلفيت محددة PCR الأمثل
ملاحظة: لتحويل بيسلفيت من الحمض النووي الجيني، وعدد من مجموعات تجارية مختلفة لتحويل بيسلفيت المتاحة. حدد عدة أو البروتوكول الذي يناسب التجربة المخطط لها.
<رأ>ملاحظة: 1-2 ميكرولتر من الحمض النووي تحويل بيسلفيت كافية لتحسين ردود الفعل PCR إذا تم استخدام 1 ميكروغرام الحمض النووي الجيني لإدخال التحويل.
- تجميع التفاعل التالي لتضخيم الهدف الأمثل من amplicon واحد. للحصول على عينات متعددة، تجميع ردود الفعل في لوحة PCR 96-جيدا.
25 ميكرولتر رد فعل العازلة 2X
0.5 ميكرولتر مزيج dNTP
5 ميكرولتر 10 ميكرومتر إلى الأمام التمهيدي (النهائي 1 ميكرومتر)
5 ميكرولتر 10 ميكرومتر عكس التمهيدي(1 ميكرومتر النهائي)
2 ميكرولتر قالب بيسلفيت تحويل DNA
0.4 ميكرولتر (5 U / ميكرولتر) البلمرة DNA
12.1 ميكرولتر المياه مجانا الدناز (حجم رد الفعل النهائي 50 ميكرولتر) - ختم PCR لوحة مع لاصق مناسب أو فيلم حرارة مختومة.
- ضع رد الفعل في cycler الحرارية المناسبة واستخدامها الظروف الدراجات التالية مع غطاء ساخنة:
- إجراء تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- تفسد على 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
- يصلب لمدة 30 ثانية في T م معين من الاشعال المستخدمة. تبدأ في درجة حرارة الصلب بضعة ° C أدناه T م من التمهيدي لردود الفعل الأمثل.
ملاحظة: يمكن أيضا تحديد أفضل درجات حرارة الصلب باستخدام cycler الحرارية الانحدار لاختبار مجموعة من درجات الحرارة. - أداء امتدادا عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. إطالة وقت التمديد لamplicons أطول.
- كرر الخطوات من 3.3.3.2-3.3.3.4 لمدة 35 دورات لالتل لتعظيم الاستفادة الأولي. أرقام المرحلة العليا قد تكون ضرورية ولكن يجب عموما تجنبها لمنع التكبير نسيلي التي من شأنها خلق التحف رد فعل.
- إجراء تمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
- عقد ردود الفعل عند 4 درجات مئوية.
- تصور amplicons بواسطة PAGE الكهربائي. بدلا من ذلك، استخدام DNA رقاقة الكهربائي الشعري وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
- مزيج 24 ميكرولتر من رد فعل PCR مع 6 ميكرولتر من 5X صبغ تحميل على الجليد ودوامة.
- جعل 1 L من 1X TBE تشغيل عازلة عن طريق خلط 200 مل من 5X TBE تشغيل عازلة و 800 مل من DDH 2 O. تمييع سلم DNA لتركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام لكل بئر في [ده 2 O وصبغ التحميل.
- آبار تحميل مع 30 ميكرولتر من ردود الفعل PCR أو السلم.
- تشغيل هلام في 200 V ل~ 45 دقيقة. وقف على المدى هلام عندما تصل الأولى أمام صبغ نهاية هلام.
- وصمة عار الجل مع 5 ميكروغرام / ملبروميد إيثيديوم عن طريق خلط 5 ميكرولتر من 10 ملغ / مل في 100 مل من DDH 2 O. تغطية هلام كامل والسماح احتضان ل~ 5 دقائق.
- صورة هلام عبر مربع ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو تصوير المتعدد الوسائط في طول موجي الإثارة من 482 نانومتر.
- في إشارة إلى سلم، وحجم amplicons PCR وتحديد خصوصية التفاعل من خلال النظر للفرق متعددة أخرى من حجم amplicon المتوقع (4A الشكل وC).
- مرة واحدة وقد تم تحديد الظروف المثلى لBS-PCR، نفذ BS-PCR على العينات التجريبية.
- تنقية amplicons من تبقى الاشعال والمكونات رد فعل الأخرى. أداء السيليكا العمود تنقية، سبري حبة، أو القائم على الجل للتنظيف والكمي.
- amplicons أزل في 30 ميكرولتر TE العازلة.
- تحديد amplicons باستخدام فحص فلوروميتريك باستخدام بروتوكولات المصنعة.
- إذا كان هناك amplicons متعددة لكل عينة، تجمع لهم في وزن متساو لكل وحدة التخزينكميات وتخزينها في -20 ° C.
4. NGS إعداد المكتبة والمكتبة QC
ملاحظة: إعداد مكتبة المقايضة NGS يستخدم بروتوكول بوساطة transposome مبسط مع ثنائي الفهرسة (انظر قائمة المواد حصول على تفاصيل حول المكتبة إعداد اختيار عدة). يوفر هذا الأسلوب طريقا سريعا للغاية والإنتاجية العالية لبناء المكتبة التي تم التحقق من صحتها ويظهر قليل من دون تحيز في تطبيقات التسلسل بيسلفيت 16،19. ثنائي الفهرسة يسمح لمضاعفة أعلى من عينات من فهرسة واحدة. قد تكون أساليب إعداد مكتبة أخرى ممكن ولكن لم يتم اختبارها.
- إعداد مكتبات NGS من amplicons BS PCR في PCR لوحة 96-جيدا. تمييع amplicons إلى 0.2 نانوغرام / ميكرولتر لكتلة المدخلات النهائية من 1 نانوغرام، أو 5 ميكرولتر من 0.2 نانوغرام / ميكرولتر التخفيف. إجراء تنظيف المكتبات إنشاؤها باستخدام الخرز سبري. استخدام 50-90 حبات سبري ميكرولتر لعزل المكتبات ثإيث هذا البروتوكول. حجم حبات سبري يعتمد على حجم الهدف من المكتبة وعدد دورة من ردود الفعل التسلسل المطلوب.
ملاحظة: استخدم شاكر صفيحة ميكروسكوبية أو لوحة vortexer ل resuspend الخرز.- أزل المكتبات قبالة الخرز ونقل إلى لوحة 96-جيدا جديدة وختم مع الختم الحرارة فيلم للتخزين في -20 ° C.
- تحديد حجم وتركيز المكتبات (الشكل 4B و D).
- المكتبات تعمل على DNA الكهربائي الشعرية التحجيم رقاقة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
- استخدام حساسية عالية DNA الكهربائي الشعرية فحص لتحديد متوسط حجم قمم مكتبة الكشف وتقدير المولية وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
- تحديد المكتبات التي كتبها QPCR، وذلك باستخدام بادئات مصممة ضد متواليات محول في المكتبات ولدت ومعايير استخدام مع تركيز معروف.
- تشغيل QPCR إعادةالإجراءات على صك في الوقت الحقيقي باستخدام الإعدادات الكميات المطلقة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
- استخدام حجم المكتبات والكميات المولي من QPCR لحساب تركيزات المولي من المكتبات.
- المكتبات تعمل على DNA الكهربائي الشعرية التحجيم رقاقة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
- تمييع المكتبات إلى 4 نانومتر باستخدام 10 ملي تريس، الكلور مع 0.1٪ توين 20 في درجة الحموضة 8.5. متجر مكتبات في 96-جيدا PCR لوحة مختومة مع فيلم الختم الحرارة في -20 ° C.
5. المكتبات تسلسل باستخدام التسلسل الفوق
- ذوبان الجليد بها وإعداد الكواشف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- ذوبان الجليد 4 مكتبات نانومتر على الجليد.
- جعل 1 مل من 0.2 هيدروكسيد الصوديوم N في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- تجمع 4 مكتبات نانومتر بكميات متساوية الحجم، إذا مكتبات متعددة والتي سيتم استخدامها.
- تمييع وتفسد المكتبات المجمعة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة للتركيز المطلوب المولي النهائي.
- الحفاظ المخفف وتفسدمكتبة المجمعة على الجليد حتى جاهزة للتحميل على خرطوشة الكاشف.
- توليد معلومات الفهرس ورقة عينة تحتوي على أسماء عينة والمقابلة وتحديد لتوليد .fastq الملفات فقط.
- ورقة عينة الحمل في المقابل مجلد ورقة العينة على المنظم.
- إضافة ما مجموعه 600 ميكرولتر المخفف ومكتبة التشويه والتحريف لخرطوشة كاشف في المقابلة أيضا.
- تشغيل التفاعلات التسلسل على الانتهاء.
تحليل 6. مثلأيشن الكميات البيانات
ملاحظة: هناك برامج متعددة المتاحة لتحليل البيانات NGS بما في ذلك مصدر تجاري ومفتوحة على حد سواء. ويمكن الاطلاع على تفاصيل عن البرامج التي تعمل مع كل حزمة محددة. يتم إعطاء تعليمات عامة في كل خطوة جنبا إلى جنب مع أوامر معينة لحزمة البرنامج هذا. (راجع قائمة المواد للاطلاع على تفاصيل البرامج المستخدمة في هذا البروتوكول).
- استيراد ملفات .fastq.gz في حد ذاته الاقتضاءquencing خط أنابيب تحليل الإبقاء على نقاط جودة (Qscores) لاستخدامها في قراءة التشذيب. (لهذا البرنامج المثال اختر 'استيراد' وحدد طريقة التسلسل استخدامها لتوليد يقرأ اختيار .fastq.gz قراءة الملفات لاستيراد، والاحتفاظ Qscores من ملفات .fastq للقراءة التشذيب التطبيقات من خلال إلغاء "تجاهل نقاط جودة 'أسفل' عامة الخيارات ". حدد موقعا لالمستوردة يقرأ واختر 'إنهاء'.)
- تقليم والاحتفاظ يقرأ باستخدام الإعدادات التالية في خط أنابيب تحليل البيانات NGS. (لهذا البرنامج اختر 'تسلسل تريم "تحت عنوان" أدوات الأساسية NGS "، وحدد يقرأ إلى تهذيب.)
- الاحتفاظ فقط يقرأ تحتوي على عشرات ≥ Q30. (لهذا البرنامج اختر 'تقليم باستخدام نقاط جودة "وتعيين الحد الأقصى إلى 0.001).
- الاحتفاظ فقط يقرأ تحتوي على ≤ 1 النوكليوتيدات غامضة. (لهذا البرنامج اختر 'النيوكليوتيدات غامضة تريم "وتعيين"الحد الأقصى لعدد النقاط الغامضة" ل1. حدد موقع لحفظ قلص يقرأ واختر 'إنهاء'.)
- قلص خريطة يقرأ لفي سيليكون بيسلفيت تحويلها إشارة الجينات من 2.2. (للاطلاع على سبيل المثال برنامج تحديد "خارطة يقرأ إلى المرجعي 'تحت' أدوات الأساسية NGS" اختيار قلص يقرأ ليتم تعيينها وحدد "التالي". حدد تسلسل إشارة تحويله واختر 'لا اخفاء' أسفل 'اخفاء مرجعية ". حدد" التالى '.)
- تعيين الحد الأقصى للعقوبة لعدم التطابق، الإدراج، والحذف. تعيين المعلمات مثل ما هو مطلوب 100٪ من طول القراءة لرسم خريطة مع الهوية تسلسل 90٪. على سبيل المثال البرمجيات، وتعيين على 3 نقاط عن عدم التطابق، الإدراج، والحذف. تعيين على درجة من 1 للحد الأدنى جزء من طول القراءة تعيينها إلى المرجعية، وتعيين على درجة من 0.9 الحد الأدنى لجزء من الهوية بين تعيين القراءة والمرجعية.
- للإخراج محاذاة توليد كل عينة كملف مستقل. على سبيل المثال البرمجيات، وحدد على 'إنشاء قائمة بذاتها قراءة تعيينات "تحت عنوان" خيارات الإخراج "و" حفظ "تحت عنوان" معالجة النتيجة ". حدد موقعا لحفظ الخرائط القراءة واختر 'إنهاء'.
- تشغيل البديل تدعو سير العمل على تعيين يقرأ. للمثال البرمجيات، اختر 'احتمالي كشف البديل "تحت عنوان" تحليل Resequencing "، حدد رسم الخرائط قراءة لتحليلها وتحديد" التالي ". اختر 'تجاهل مباريات غير محددة "تحت عنوان" قراءة الفلاتر' وحدد 'التالي'.
- تأكد من أن التسلسل في إقلاععشر ≥ 1000 X عن طريق تعيين "تغطية الحد الأدنى 'أسفل' أهمية 'إلى 1،000.
- ضمان أن الدعوة البديل موجودة في كل من الأمام ويقرأ عكس. على سبيل المثال البرنامج، حدد "مطلوب جود في كل من الأمام والمدرجات عكس 'أسفل' المرشحات البديل 'وحدد' التالي '.
- تصدير الانحياز، متغير يسمى البيانات وجدول المشروح. على سبيل المثال البرنامج، اختر 'إنشاء جدول المشروح "تحت عنوان" خيارات الإخراج' وحدد موقع لحفظ ملف جدول متغير. اختر 'إنهاء'.
- تقليم والاحتفاظ يقرأ باستخدام الإعدادات التالية في خط أنابيب تحليل البيانات NGS. (لهذا البرنامج اختر 'تسلسل تريم "تحت عنوان" أدوات الأساسية NGS "، وحدد يقرأ إلى تهذيب.)
- حساب نسبة 5-MC باستخدام ترددات البديل في مواقع الدليل السياسي الشامل المشروح في المنطقة من الاهتمام من ملف جدول متغير. تردد السيتوزين في C الإشارة في CG هي النسبة المئوية 5-MC.
ملاحظة: عند استخدام البديل تدعو خوارزميات لفي الدليل السياسي الشامل مميثل للغاية، استبدال cytosines الدليل السياسي الشامل مع thymines. هذا وسوف هوية منذالسنة المالية للتعيين في السيتوزين كما المتغيرات، مما أدى إلى تردد السيتوزين في والدليل السياسي الشامل. - تحديد كفاءة تحويل بيسلفيت (ش.م.ب) عن طريق حساب لأول مرة نسبة C ليست في المواقع الدليل السياسي الشامل في المرجعية (C). مضاعفة نسبة عدم الدليل السياسي الشامل C من خلال عدد من إجمالي تي معين (T النائب)، والقسمة على مجموعه من C تعيينها في إشارة T في (C زارة البريد والاتصالات). 100 ناقص تردد المحسوب هو كفاءة تحويل بيسلفيت (ش.م.ب) من تلك المكتبة (المعادلة 1).
المعادلة 1. بيسلفيت كفاءة التحويل.
ملاحظة: في حين الجينوم الثدييات تحتوي على كميات ضئيلة جدا من غير الدليل السياسي الشامل، السيتوزين مثيلة (باستثناء يحتمل أن تكون الخلايا الجذعية 20)، الجينوم النباتية تحتوي على كمية كبيرة. من أجل تحديد بيسلفيت كفاءة التحويل في هذه الاشارةالجينوم ه، وهو طريق مناسب لتسلسل جزء من جينوم الميتوكوندريا أو بلاستيدات الخضراء الجينوم أو الجينات unmethylated المعروف موجود في محطة الجينوم 21 واحتساب كفاءة التحويل كما هو موضح أعلاه. وينبغي أن يكون بيسلفيت كفاءة التحويل ≥98٪ في معظم الحالات، مع غير محول C في يحتمل تنشأ من عدم مثيلة الدليل السياسي الشامل.
Representative Results
المقايضة يقرأ محاذاة بشكل صحيح إلى تسلسل إشارة تحويله سوف تشبه الشكل 5. يمكن بوضوح أن تحدد dinucleotides الدليل السياسي الشامل ويمكن تقدير دول مثيلة من خلال مراقبة المكالمات قاعدة في مواقع الدليل السياسي الشامل في تعيين يقرأ. على سبيل المثال، مع وجود ضوابط مثيلة، و0٪ مثيلة يؤدي في جميع يقرأ تعيينها إلى مواقع تحتوي على الدليل السياسي الشامل T في (الشكل 5A). سوف الضوابط مثيلة 100٪ ينتج في جميع يقرأ معين يقرأ إلى مواقع تحتوي على الدليل السياسي الشامل C في (الشكل 5B).
الكميات من التردد السيتوزين (C / C + T) في مواقع الدليل السياسي الشامل غلة تردد مثيلة في العينة الأصلية. منحنى مستوى تمثيلي المتولدة من الضوابط كلها الجينوم مثيلة (ن = 3 / نسبة الحامض) ويظهر الخطي من مثيلة الكميات وكذلك الدقة في تحديد الكميات في كل نسبة الحامض (الشكل 6). وكمثال على هذا الأسلوب في المجموع، وكانت RNA والحمض النووي شارك في ايزو ذا الصلة من المخيخ الماوس وشبكية العين (ن = 4 / المجموعة). رودوبسين التعبير، أعرب انتقائي في أنسجة الشبكية، تم قياسها باستخدام QPCR. تم الكشف عن التعبير فقط في شبكية العين (الشكل 7A). عن طريق المقايضة، تم كميا مستويات الحامض الدليل السياسي الشامل في المنطقة رودوبسين المروج. وكانت مستويات الحامض التراكمية عبر منطقة المروج> 80٪ في المخيخ مقارنة <15٪ في شبكية العين (ع <0.001، حدودي اختبار t) (الشكل 7B). ويمكن مقارنة المقايضة مثيلة الكميات فوائد من موقع محدد مثيلة الكميات، ومستويات الحامض على أساس الدليل السياسي الشامل محددة عبر أي منطقة الجينومية معين. وكانت مستويات الحامض الدليل السياسي الشامل عبر المروج رودوبسين أعلى بكثير في عينات للدماغ عند مقارنة عينات الشبكية (P <0.001، حدودي اختبار t في كل موقع الدليل السياسي الشامل) (الشكل 7C).
1highres.jpg "/>
الشكل 1: رسم تخطيطي للطريقة المقايضة في هذه الطريقة، الحمض النووي الجيني هو بيسلفيت تحويلها إلى تعديل cytosines unmethylation إلى uracils. وفي وقت لاحق، خلال PCR يتم تغيير هذه uracils إلى thymines. يتم توجيه PCR التضخيم ضد المناطق ذات الاهتمام ويثري للغاية لمجرد هذه المتتاليات. مصنوعة الناتجة amplicons PCR في المكتبات المزدوجة فهرستها من خلال عملية tagmentation بسيطة. وفي وقت لاحق والتسلسل المكتبات على الفوق الجيل القادم المنظم والتسلسل يقرأ يتم تعيينها لفي سيليكون وتحويلها تسلسل المرجعية والمئة مثيلة من يتم تحديد السيتوزين بطريقة قاعدة محددة.
الشكل 2: في سيليكون وتحويل بيسلفيت من المنطقة من اهتمام أي منطقة من الاهتمام من أي إشارة الجينومية يمكن أن يكون SELECتيد لفي سيليكون وتحويل بيسلفيت. يتم استبدال cytosines غير الدليل السياسي الشامل مع الثايمين في تسلسل المرجعية. تبقى cytosines الدليل السياسي الشامل تحويل cytosines في بيسلفيت المرجعية.
الشكل (3): تم تصميم الاشعال التنسيب التمهيدي بيسلفيت PCR ضد في سيليكون بيسلفيت تحويلها تسلسل المرجعية. الاشعال هي أن تكون مصممة بحيث لا تتداخل dinucleotides CG أو تصميم المتاخمة لdinucleotides CG.
الشكل 4: أمثلة من amplicons العالية وسوء نوعية PCR والمكتبات التسلسل آثار رحلاني التمثيلية وتظهر هلام (A) amplicon المثالي لتوليد مكتبة بوساطة transposome مع ارتفاع وحيد. المنتج التركيز. (B) مكتبة المتولدة من هذه amplicon يبين تركيز عال، وحتى حجم التوزيع. يمكن (C) سوء نوعية amplicons PCR تكون منخفضة في الحجم، والتركيز، وتحتوي على منتجات متعددة و / أو dimers التمهيدي. وستكون هذه amplicons نوعية رديئة تؤدي إلى (D) فشل الجيل مكتبة مع انخفاض تركيز وتوزيع حجم صغير.
الشكل 5: أمثلة من مخرجات التسلسل من الضوابط مثيلة. (A) في سيليكون وتحويلها التسلسل المرجعي مع المواقع الدليل السياسي الشامل أبرز باللون الأحمر. السيطرة مثيلة 0٪ معين يقرأ للمنطقة تظهر thymines مختارة (الجشع تمييز) رسم الخرائط في مواقع الدليل السياسي الشامل. التحكم (B) 100٪ مثيلة معين يقرأ تظهر (تسليط الضوء الأزرق) رسم الخرائط السيتوزين لفي مواقع الدليل السياسي الشامل.
together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 6: الكميات مثلأيشن عبر مجموعة من الضوابط مثيلة الضوابط مثيلة جينوم كامل مختلطة في نسب مثيلة (ن = 3 / نسبة) من 0٪ الى 100٪ وتم قياس كمية باستخدام المقايضة. بالتآمر الكميات المتوقعة مقابل كميا يدل الخطي من السيطرة مثيلة الكميات. عبر جميع الضوابط، كان هناك دقة عالية في مثيلة الكميات.
الرقم 7: مثال لتقرن الحامض النووي والتعبير الجيني من تحليل عينات الأنسجة. (A) رهودوبسن] التعبير مرنا نسبيا من المخيخ الماوس والأنسجة الشبكية. (B) رهودوبسن] متوسط مثيلة المروج كميا عن طريق المقايضة بين المخيخ والحمض النووي في شبكية العين (*** P <0.001، حدودي اختبار t). <قوية> مستويات الحامض C) الدليل السياسي الشامل الموقع المحدد عبر المروج رودوبسين (-244 إلى +6، نسبة إلى موقع بداية النسخ [TSS]) في المخيخ الماوس وDNA شبكية العين.
Discussion
المقايضة يسمح للركزت ودقيقة الكميات مثيلة الحمض النووي مع قدرات إنتاجية عالية في كل من عدد من العينات وعدد من الأهداف. بالإضافة إلى ذلك، هذا الجيل المكتبة باستخدام بوساطة transposome tagmentation يتطلب أقل DNA المدخلات، وأسرع وعلى خطوات أقل من القص التقليدي والتقنيات محول ربط لاحقة. هذه التحسينات على أساليب القائمة تسمح الدقيق على مستوى قاعدة تحليل الحامض النووي من أي هدف من الفائدة. وعلاوة على ذلك، المقايضة يوفر طريقة جديدة للحصول على تأكيد من المناطق ذات الاهتمام (المناطق مثيلة تفاضلي (DMRS)، والجزر الدليل السياسي الشامل، والمناطق التنظيمية) التي تم تحديدها باستخدام الجينوم كله بيسلفيت 22 أو 23 التقاط النهج. باستخدام نهج تأكيدا المتعامدة وأكثر الأساليب الكمية دقيقة يحسن الدقة التحليلية الدراسات epigenomic. عمق قراءة عالية تحقق مع المقايضة يسمح الكميات دقيقة في فاصل الثقة الضيق، وإعادةsulting في الكميات الدقيقة 16. بالإضافة إلى ذلك، والقدرة على تشغيل العديد من العينات في تجربة واحدة يمكن أن تزيد من حجم العينة لتأكيدات وسائل الجينوم كاملة، الأمر الذي سيزيد من قوة الإحصائية؛ نقطة ضعف العديد من الدراسات جينية الحالية. الأهم من ذلك، يوفر المقايضة على الدليل السياسي الشامل مثيلة الكميات قاعدة محددة، والذي يسمح لتوليد فرضيات قابلة للاختبار للأبحاث جينية. سوف فرضيات مثل زيادة مثيلة في عنصر استجابة محددة يؤدي إلى انخفاض ملزمة للعامل النسخ محددة. المقايضة، جنبا إلى جنب مع بيانات التعبير مرنا مقترن، يوفر طريقة للحصول على كل من التنظيم جينية ومرنا التعبير في قطعة واحدة من نسيج أو خلية السكان. قياسات يقترن التنظيم والتعبير أيضا أن يزيد من الدقة العلمية وتأثير النتائج.
وتشمل الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول المقايضة التصميم التمهيدي، amplicon الأمثل، وتوليد مكتبة /QC. هو عرض PCR التحيز إذا لم يتم تصميمها بشكل صحيح الاشعال وتضخيم في الكفاءات المختلفة 8. استخدام المعايير مثيلة، مثل لدت إنزيمي 100٪ و 0٪ السيتوزين ميثليته المعايير، ويمكن استخدامها لتحديد درجة، إن وجدت، من التحيز مثيلة الكميات، وهو السيطرة المنهجية المناسبة عند قياس مثيلة 16. وبالمثل، ينبغي توخي الحذر عند تحسين ردود الفعل PCR لتوليد واحد amplicon ذات جودة عالية. إذا لم يكن هناك amplicon هو الحاضر باستخدام المبادئ التوجيهية المقترحة مفصل في البروتوكول، وتشمل الخطوات الأمثل أعداد متزايدة دورة PCR أو bsDNA كمية المدخلات. إذا كانت هناك منتجات PCR متعددة، بما في ذلك التمهيدي-dimers، وتشمل الخطوات الأمثل خفض كمية المدخلات bsDNA، وخفض PCR التمهيدي تركيزات المدخلات المولي، وزيادة درجات الحرارة الصلب، أو خفض عدد PCR دورة. واحد أو مزيج من هذه الإجراءات تحسين غلة النتائج كافية لتوليد المهزومة واحدح-نوعية amplicon. بدلا من ذلك، إعادة تصميم الاشعال هو نهج جيد لمجموعات التمهيدي التي لا تسفر عن amplicon واحد. لتلك المناطق حيث إعادة تصميم غير مناسب أو ممكن، تتحول مجموعات التمهيدي بما في ذلك قد تعمل السيتوزين والثايمين لفي مواقع الدليل السياسي الشامل في الاشعال إلى الأمام والأدينين والجوانين لفي مواقع الدليل السياسي الشامل في الاشعال العكسية. ومع ذلك، هذه المجموعات التمهيدي تحتاج إلى مزيد من التحسين لضمان عدم التحيز PCR يحدث، وهي عملية خارج نطاق هذا البروتوكول. المكتبات الجودة هي في غاية الأهمية للنجاح. ضمان أن تكون التدابير QC تتم لتحديد حجم ونوعية وكمية من المكتبات قبل التسلسل. ردود الفعل التسلسل عرضة للفشل مع مدخلات من المكتبات ذات جودة منخفضة. التحيز في مثيلة الكميات يمكن تخفيفها عن طريق ضمان أن الترددات مثيلة موجودة في كل من الأمام وعكس يقرأ التسلسل. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن عشرات نوعية قواعد التوفيق إلى مواقع الدليل السياسي الشامل يكون ≥Q30 لارتفاع شاركnfidence في الكميات. في حين أن آخرين قد أظهرت قليلا في وقت سابق الى أي تحيز في التفاعلات tagmentation من الحمض النووي تحويل بيسلفيت 19، وضمان المقاييس المذكورة أعلاه يسمح للتأكيد منخفضة التحيز مثيلة الكميات.
يقيس المقايضة حاليا مثيلة في مواقع الدليل السياسي الشامل، ومع ذلك، فإن التوسعات المستقبلية لهذه الطريقة تسمح القياسات الموثوقة من الدليل السياسي الشامل 5-مؤسسة حمد الطبية مع إضافة من الخطوات التجريبية التمييز بين 5-مولودية و5-مؤسسة حمد الطبية مثل إدخال perruthenate البوتاسيوم قبل التحويل بيسلفيت 24. سيؤدي هذا إلى زيادة تأثير المقايضة فائدة من خلال السماح للمثيلة مقترن، على حد سواء 5-مولودية و5-مؤسسة حمد الطبية، والبيانات التعبير من أجل تحديد الأدوار التنظيمية التعبير الجيني من الحامض النووي. إعداد مكتبة Transposome بوساطة من amplicons PCR لا يؤدي إلى انخفاض عمق التسلسل في نهايات المناطق تضخيمها. ولذلك، ينبغي أن تصمم مناطق فائدة مرتفعة للإقامة في وسط amplicons. كيفمن أي وقت مضى، لأن المقايضة يولد قراءة التسلسل أعماق> 1،000 X، دقة كمية من 5-MC القياسات بالقرب من أقاصي المناطق تضخيم لا تزال مرتفعة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
| Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
| Agencourt AMPure XP - PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 ml |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
| twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
| Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
| Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
| Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
| 0.1-10 μl Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
| 2-200 μl Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
| 50-1,000 μl Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
| MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
| 2.0 ml Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300 cycles |
| KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
| ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
| Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
| Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5x (1 L) |
| Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5x (10 ml) |
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
| UltraPure 10 mg/ml Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384-well block |
| DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
| SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
| QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
| TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
| Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
| TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| 384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
| Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
| EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
| ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |
References
- Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & Development. 16 (1), 6-21 (2002).
- Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
- Heard, E., Martienssen, R. A. Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms. Cell. 157 (1), 95-109 (2014).
- Baylin, S. B. DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice. Oncology. 2, Suppl 1. S4-S11 (2005).
- Baylin, S. B. The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).
- Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).
- Mikeska, T., et al. Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis. The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).
- Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In. Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).
- Dikow, N., et al. Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA. Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).
- Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues. Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).
- Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method. Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).
- Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine. Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).
- Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues. Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).
- Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing. Epigenetics & Chromatin. 6 (1), 33 (2013).
- Caruccio, N. Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition. Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Adey, A., Shendure, J. U. ltra-low-input tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing. Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).
- Smallwood, S. A., et al. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).
- Wang, J., et al. Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation. Plant Methods. 7, 39 (2011).
- Lister, R., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Ivanov, M., et al. In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes. Nucleic Acids Research. 41 (6), e72 (2013).
- Booth, M. J., et al. Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).
