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Biology

डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा लक्षित

Published: February 24, 2015 doi: 10.3791/52488
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology, University of Oklahoma College of Medicine, 2Department of Geriatric Medicine, University of Oklahoma College of Medicine

Introduction

यह स्वाभाविक रूप से साइटोसिन मेथिलिकरण एक के रूप में डीएनए संशोधनों से होने वाली की पहली रिपोर्ट के बाद आधी शताब्दी से अधिक कर दिया गया है। Cytosine मेथिलिकरण आधार अंगूठी पर 5 वें कार्बन एक मिथाइल समूह (5-एमसी), सबसे अधिक बार स्तनधारी जीनोम में CPG डाईन्यूक्लियोटाइड आकृति में होने वाली है, जहां एक संशोधित साइटोसिन न्यूक्लियोटाइड आधार है। अनुपस्थिति ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि 2 के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि जीन प्रमोटरों में 5 एम सी के कार्यात्मक उपस्थिति आम तौर पर, ट्रांसक्रिप्शनल दमन के साथ जुड़ा हुआ है।

जबरदस्त प्रगति विकास 3 में डीएनए मेथिलिकरण, epigenetic प्रोफाइल के 4, कैंसर रोगजनन 5,6, और अन्य अनुसंधान क्षेत्रों की संख्या के transgeneration प्रचार की भूमिका के बारे में हमारी समझ में किया गया है। नए तरीके में डीएनए मेथिलिकरण 7 प्रोफ़ाइल करने के लिए विकसित किया गया है के रूप में इन अग्रिमों के कई पिछले कुछ वर्षों में आ गए हैं। आगमन के साथ औरअगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) तकनीक को लोकप्रिय अब एक पूरे जीनोम या एक जीनोम 8 के बड़े क्षेत्रों में डीएनए मेथिलिकरण प्रोफ़ाइल करने के तरीकों में से एक नंबर रहे हैं। इन तरीकों डीएनए मेथिलिकरण पैटर्न और डीएनए मेथिलिकरण में मतभेद यों खोज की है कि पढ़ाई की संभावना खुला। इन परिकल्पना पैदा दृष्टिकोण के अलावा, लक्षित / परिकल्पना परीक्षण डीएनए मेथिलिकरण quantitation के तरीकों के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है।

Pyrosequencing, मेथिलिकरण विशिष्ट पीसीआर, और bisulfite परिवर्तित डीएनए के प्रत्यक्ष सेंगर अनुक्रमण लक्षित क्षेत्रों के विश्लेषण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों के लिए किया गया है (यानी, एक जीन के प्रमोटर क्षेत्र या एक CPG द्वीप) 9-12। Methylated साइटोसिन के बरकरार 13,14 रहते हैं, जबकि इन तरीकों के सभी, bisulfite रूपांतरण, unmethylated साइटोसिन के uracil के रूप में परिवर्तित कर रहे हैं, जहां एक रासायनिक deamination प्रतिक्रिया पर निर्भर हैं। Bisulfite- की पीसीआर प्रवर्धनअंतर मेथिलिकरण एक आधार अंतर के रूप में बाहर पढ़ने के लिए अनुमति देता है थाइमिन 15 के साथ uracil के प्रतिस्थापन में परिवर्तित डीएनए का परिणाम है। अत्यधिक उपयोगी है, इन तरीकों के लिए सीमाओं को कम मात्रात्मक सटीकता, लघु पढ़ें लंबाई, और कम throughput नमूना शामिल है। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए हम हम (BSAS) 16 Bisulfite Amplicon अनुक्रमण करार दिया है एक विधि विकसित की है। इस पद्धति का लक्ष्य उच्च मात्रात्मक सटीकता के साथ नमूनों की एक बड़ी संख्या में ब्याज का लक्ष्य जीनोमिक क्षेत्रों का विश्लेषण करने में सक्षम होना है।

BSAS मौजूदा तरीकों के तत्वों (bisulfite रूपांतरण और क्षेत्र विशेष पीसीआर प्रवर्धन) का उपयोग करता है और सरल अगली पीढ़ी के पुस्तकालय निर्माण (transposome की मध्यस्थता) 17 और benchtop NGS 18 (चित्रा 1) के साथ उन्हें जोड़ती है। इस दृष्टिकोण के हित के किसी भी क्षेत्र में साइटोसिन मेथिलिकरण जांच करने के लिए एक और मात्रात्मक और उच्च throughput विधि के लिए प्रदान करता है। यहाँ हम पेशविस्तार से विधि और समस्या निवारण और गुणवत्ता BSAS प्रक्रिया की जाँच के लिए दृष्टिकोण का वर्णन है।

Protocol

ऊतक से 1. न्यूक्लिक एसिड अलगाव

नोट: एक ही ऊतक के नमूने से डीएनए और आरएनए के सह-अलगाव जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए epigenetic विश्लेषण के लिए डीएनए और बनती शाही सेना को इकट्ठा करने का अवसर प्रदान करता है। यहां दिए गए उदाहरण नियोजित किया जा सकता प्रयोगात्मक ऊतक लेकिन विभिन्न प्रकार नमूना या अन्य अलगाव तरीकों के लिए वैकल्पिक तरीकों से स्तंभ शुद्धि का एक रूप है। प्राथमिक आवश्यकता प्रोटीन या कार्बनिक सॉल्वैंट्स contaminating के बिना अत्यधिक शुद्ध न्यूक्लिक एसिड के लिए है।

  1. मैकेनिकल homogenization के लिए ताजा जमे हुए या ताजा ऊतक का एक टुकड़ा का चयन करें और बर्फ पर जगह है। एक 2.0 मिलीलीटर दौर नीचे microcentrifuge ट्यूब स्टोर या हस्तांतरण ऊतक।
  2. ऊतक युक्त प्रत्येक ट्यूब एक 5 मिमी स्टेनलेस स्टील मनका जोड़ें। सेल नंबर या ऊतक वजन के निर्माता के सुझावों के आधार पर lysis बफर का एक उचित मात्रा में, जोड़ें।
  3. एक मनका मिल मैकेनिकल homogenization में उपयोग करते हुए ऊतक homogenize30 सेकंड के लिए 30 हर्ट्ज।
    नोट: आवृत्ति और यांत्रिक homogenization की अवधि के ऊतक प्रकार पर निर्भर है। नरम ऊतकों पूरी तरह से मुश्किल ऊतकों अनुकूलन स्थापित करने की आवश्यकता होती है, की सिफारिश की सेटिंग्स का उपयोग homogenize जाएगा।
  4. निर्माता प्रोटोकॉल निम्नलिखित कमरे के तापमान पर सिलिका स्पिन स्तंभों का उपयोग डीएनए और आरएनए अलगाव बाहर ले।
    1. बर्फ पर RNase मुक्त पानी और जगह के 50 μl में Elute शाही सेना। QPCR के द्वारा mRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए शाही सेना का प्रयोग करें।
    2. ते बफर के 100 μl में डीएनए elute। डीएनए एकाग्रता और उपज बढ़ाने के लिए eluent का उपयोग डीएनए कॉलम बंद दोहराएँ क्षालन। लक्षित मेथिलिकरण quantitation के लिए डीएनए का प्रयोग करें।
  5. 230 एनएम, 260 एनएम, 280 एनएम, और 320 एनएम पर absorbance के लिए एक मानक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग डीएनए और आरएनए की गुणवत्ता का आकलन।
    नोट: A260 / A280 अनुपात उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए के लिए ~ 1.8-2 होना चाहिए। A260 / A280 अनुपात ~ 2 उच्च गुणवत्ता शाही सेना के लिए होना चाहिए। 230 एनएम इंडिक पर अतिरिक्त absorbance के की उपस्थितिअलगाव की प्रक्रिया से ates contaminants के।
  6. गुणवत्ता के निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक केशिका वैद्युतकणसंचलन चिप का उपयोग करके आगे शाही सेना की जाँच करें।
    नोट: उच्च गुणवत्ता शाही सेना एक शाही सेना अखंडता संख्या (Rin)> 8 होगा। rRNA चोटियों के अलावा electropherogram में अतिरिक्त चोटियों की उपस्थिति नमूना संदूषण का संकेत मिलता है।
  7. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार फ्लोरोसेंट परख द्वारा डीएनए और आरएनए यों।
    नोट: एक fluorometric परख का प्रयोग अकेले स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री से न्यूक्लिक एसिड बढ़ाता के लिए अधिक संवेदनशील और विशिष्ट है।
  8. स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए और आरएनए पृथक।

2. लक्ष्य पहचान और प्रथम डिजाइन

  1. ब्याज की जीनोमिक क्षेत्र (एस) का निर्धारण उचित संदर्भ जीनोम अनुक्रम पर आधारित BSAS से विश्लेषण किया जाना है। विभिन्न व्यक्त जीनों के जीन प्रमोटरों मेथिलिकरण quantitation के आम लक्ष्य कर रहे हैं।
  2. सिलिको bisulfite परिवर्तित में एक तैयार करेंअनुक्रमण के बाद के संरेखण के लिए एड संदर्भ जीनोम एक पाठ संपादक में .fasta अनुक्रम फ़ाइल बदलकर पढ़ता है। 5'-3 'अभिविन्यास में, थाइमिन के (चित्रा 2) के साथ गैर CPG साइटोसिन की जगह।
  3. डिजाइन प्राइमर bisulfite परिवर्तित डीएनए से हित के क्षेत्रों को बढ़ाना सेट।
    1. का चयन करें और एक bisulfite-विशिष्ट पीसीआर प्रथम डिजाइन कार्यक्रम (चित्रा 3) में, 5'-3 'अभिविन्यास में, ब्याज की स्थिर क्षेत्र की नकल।
      नोट: एक इष्टतम bisulfite पीसीआर amplicon लंबाई bisulfite उपचार टुकड़े डीएनए के रूप में amplicon के प्रति 250-400 बी.पी. है और यह 400> बड़े बीपी क्षेत्रों बढ़ाना मुश्किल है। उदाहरण के लिए, एक केबी के एक क्षेत्र के लिए ब्याज की है, तो कई प्राइमर जोड़े इस क्षेत्र को कवर करने के लिए तैयार किया जा सकता है। डिजाइन amplicons आसान पूलिंग के लिए बराबर बीपी आकार का हो। इन पुस्तकालय पीढ़ी के लिए अपर्याप्त लंबाई का हो सकता है क्योंकि amplicon लंबाई <250 बीपी से बचें। BSAS के लिए एक इष्टतम प्राइमर लंबाई> हैप्राइमर प्रति 20 बीपी।
    2. आगे के बीच 55-65 डिग्री सेल्सियस के एक टी एम रेंज और एक अधिकतम टी एम फर्क का चयन करें और 1-2 डिग्री सेल्सियस की प्राइमरों रिवर्स।
    3. सबसे अच्छा ब्याज के क्षेत्र को कवर किया है कि प्राइमर जोड़े का चयन करें। इस पीसीआर प्रतिक्रियाओं में पूर्वाग्रह का कारण होगा, जैसा कि CPG साइटों होते हैं या CPG साइटों के लिए सीधे आसन्न हैं कि प्राइमरों का चयन न करें। शैक्षणिक या व्यावसायिक प्रदाताओं में से किसी भी नंबर से आदेश दिया जा सकता है कि मानक पीसीआर प्राइमरों का प्रयोग करें।
    4. 100 माइक्रोन का काम कर रहे एक शेयर पर RNase / DNase मुक्त पानी में lyophilized प्राइमरों पुनर्गठित।
  4. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर पीसीआर प्राइमरों। पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए स्टॉक में काम कर रहे 10 माइक्रोन से 100 माइक्रोन प्राइमर शेयर पतला।

3. Bisulfite विशेष पीसीआर अनुकूलन

नोट: जीनोमिक डीएनए के bisulfite रूपांतरण के लिए, bisulfite रूपांतरण के लिए विभिन्न व्यावसायिक किट के एक संख्या में उपलब्ध हैं। सबसे अच्छा योजना बनाई प्रयोग है कि सूट किट या प्रोटोकॉल का चयन करें।

<राजभाषा>
  • जीनोमिक डीएनए के माइक्रोग्राम प्रति 2 करने के लिए एनजी 200 के बीच का प्रयोग करें। अनुकूलन प्रयोगों के लिए, कई बी एस पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए डीएनए परिवर्तित पर्याप्त bisulfite के क्रम में कई रूपान्तरण प्रतिक्रियाओं चलाते हैं।
  • उच्च डीएनए सांद्रता बनाए रखने के लिए bisulfite परिवर्तित डीएनए के छोटे (उदाहरण के लिए, 10 μl) क्षालन संस्करणों का प्रयोग करें।
    नोट: एक माइक्रोग्राम प्रति जीनोमिक डीएनए रूपांतरण इनपुट के लिए इस्तेमाल किया गया था अगर bisulfite परिवर्तित डीएनए के 1-2 μl अनुकूलन पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त है।
  • Bisulfite विशिष्ट पीसीआर द्वारा bisulfite परिवर्तित डीएनए बढ़ाना। बी एस पीसीआर प्रतिक्रियाओं bisulfite परिवर्तित डीएनए amplifying में सक्षम एक Taq पोलीमरेज़ का उपयोग कर की आवश्यकता होती है।
    1. एक भी amplicon का लक्ष्य प्रवर्धन अनुकूलन के लिए निम्नलिखित प्रतिक्रिया इकट्ठा। कई नमूने लिए, एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में प्रतिक्रियाओं इकट्ठा।
      25 μl 2x प्रतिक्रिया बफर
      0.5 μl dNTP मिक्स
      5 μl 10 माइक्रोन आगे प्राइमर (अंतिम 1 माइक्रोन)
      5 μl 10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर(अंतिम 1 माइक्रोन)
      2 μl टेम्पलेट bisulfite डीएनए परिवर्तित
      0.4 μl (5 यू / μl) डीएनए पोलीमरेज़
      12.1 μl DNase मुक्त पानी (अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा 50 μl)
    2. उपयुक्त चिपकने वाला या गर्मी से सील फिल्म के साथ पीसीआर थाली सील।
    3. एक उपयुक्त थर्मल cycler में प्रतिक्रिया जगह और एक गर्म ढक्कन के साथ निम्न साइकिल चालन की स्थिति का उपयोग करें:
      1. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण प्रदर्शन करते हैं।
      2. 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर denature।
      3. प्राइमरों की विशेष टी मीटर की ऊंचाई पर 30 सेकंड के लिए पानी रखना इस्तेमाल किया जा रहा है। एक annealing तापमान में अनुकूलन प्रतिक्रियाओं के लिए प्राइमर की टी एम नीचे कुछ डिग्री सेल्सियस की शुरुआत करें।
        नोट: सर्वश्रेष्ठ annealing के तापमान में भी तापमान की एक श्रृंखला का परीक्षण करने के लिए एक ढाल थर्मल cycler का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है।
      4. 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक विस्तार के प्रदर्शन करना। अब amplicons के लिए विस्तार समय लंबा।
      5. दोहराएँ 3.3.3.2-3.3.3.4 35 के लिए चक्र कदमप्रारंभिक अनुकूलन के लिए ताल। हायर चक्र संख्या के लिए आवश्यक हो सकता है, लेकिन आम तौर पर प्रतिक्रिया कलाकृतियों का निर्माण करेगा कि क्लोनल amplifications को रोकने के लिए बचा जाना चाहिए।
      6. सात मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार प्रदर्शन करते हैं।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं पकड़ो।
    4. पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन द्वारा amplicons कल्पना। वैकल्पिक रूप से, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक केशिका वैद्युतकणसंचलन डीएनए चिप का उपयोग करें।
      1. बर्फ और भंवर पर 5x लोड हो रहा है डाई के 6 μl के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया के 24 μl मिलाएं।
      2. ओ DDH 2 के बफर और 800 मिलीलीटर 5x TBE के 200 मिलीलीटर मिश्रण चलाकर 1x TBE बफर चलाने का एक एल बनाओ DDH 2 हे और लदान डाई में अच्छी तरह से प्रति 0.5 माइक्रोग्राम प्रति के अंतिम एकाग्रता के लिए डीएनए सीढ़ी पतला।
      3. पीसीआर प्रतिक्रियाओं या सीढ़ी के 30 μl के साथ लोड कुओं।
      4. 45 मिनट ~ के लिए 200 वी पर जेल चला। पहले डाई सामने जेल के अंत तक पहुँचता है जब जेल रन बंद करो।
      5. 5 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के साथ जेल दागDDH 2 ओ की 100 मिलीलीटर में 10 मिलीग्राम / एमएल के 5 μl मिश्रण से ethidium ब्रोमाइड पूरे जेल कवर और ~ 5 मिनट के लिए सेते करते हैं।
      6. छवि 482 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में एक यूवी प्रकाश बॉक्स या बहुविध इमेजर के माध्यम से जेल।
      7. , आकार पीसीआर amplicons सीढ़ी के संदर्भ में और उम्मीद amplicon आकार के अलावा अन्य कई बैंड (चित्रा -4 ए और सी) के लिए देख द्वारा प्रतिक्रिया की विशिष्टता का निर्धारण।
    5. एक बार बी एस पीसीआर के लिए इष्टतम स्थितियों प्रयोगात्मक नमूनों पर बी एस पीसीआर प्रदर्शन, निर्धारित किया गया है।
      1. शेष प्राइमरों और अन्य प्रतिक्रिया घटकों से amplicons के शुद्ध। सिलिका स्तंभ शुद्धि, SPRI मनका, या जेल आधारित क्लीन-अप और मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करते हैं।
      2. 30 μl ते बफर में Elute amplicons।
      3. निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग fluorometric परख का उपयोग amplicons यों।
      4. नमूना प्रति एकाधिक amplicons कर रहे हैं, मात्रा प्रति बराबर वजन में उन्हें पूल-20 डिग्री सेल्सियस पर मात्रा और दुकान।

    • 4. NGS पुस्तकालय तैयारी और पुस्तकालय क्यूसी

    नोट: BSAS NGS पुस्तकालय तैयारी दोहरे अनुक्रमण के साथ एक सरल transposome की मध्यस्थता प्रोटोकॉल का उपयोग करता है (पुस्तकालय तैयारी किट चयन पर जानकारी के लिए सामग्री सूची देखें)। इस विधि bisulfite अनुक्रमण अनुप्रयोगों 16,19 में कोई पूर्वाग्रह के लिए थोड़ा मान्य है और पता चलता कर दिया गया है कि पुस्तकालय के निर्माण के लिए एक बहुत ही तेजी से और उच्च throughput मार्ग प्रदान करता है। दोहरे अनुक्रमण एकल अनुक्रमण से नमूने के एक उच्च बहुसंकेतन के लिए अनुमति देता है। अन्य पुस्तकालय तैयारी शैलियों संभव हो सकता है, लेकिन परीक्षण नहीं किया गया।

    1. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में बी एस पीसीआर amplicons से NGS पुस्तकालयों तैयार करें। / 0.2 एनजी को amplicons पतला एक एनजी, या 0.2 एनजी / μl कमजोर पड़ने के 5 μl के अंतिम इनपुट जन के लिए μl। SPRI मोती का उपयोग कर उत्पन्न पुस्तकालयों की क्लीन-अप को पूरा करें। डब्ल्यू पुस्तकालयों के लिए अलग 50-90 μl SPRI मोती का प्रयोग करेंइस प्रोटोकॉल रबर। SPRI मोतियों की मात्रा पुस्तकालय का लक्ष्य आकार और इच्छित अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं का चक्र संख्या पर निर्भर करता है।
      नोट: मोती resuspend करने के लिए एक microplate प्रकार के बरतन या थाली vortexer का प्रयोग करें।
      1. मोती बंद पुस्तकालयों elute और एक नया 96 अच्छी तरह से थाली को हस्तांतरण और -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए गर्मी सील फिल्म के साथ सील।
    2. पुस्तकालयों (चित्रा 4 बी और डी) के आकार और एकाग्रता का निर्धारण।
      1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार चिप नौकरशाही का आकार घटाने एक केशिका वैद्युतकणसंचलन डीएनए पर चलने पुस्तकालयों।
        1. पता चला पुस्तकालय चोटियों का औसत आकार और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार molarity के एक अनुमान निर्धारित करने के लिए एक उच्च संवेदनशीलता केशिका वैद्युतकणसंचलन डीएनए परख का प्रयोग करें।
      2. एक ज्ञात एकाग्रता के साथ उत्पन्न पुस्तकालयों और उपयोग के मानकों में एडाप्टर के दृश्यों के खिलाफ बनाया प्राइमरों का उपयोग, qPCR के द्वारा पुस्तकालयों यों।
        1. भागो qPCR पुनःनिर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पूर्ण quantitation सेटिंग्स का उपयोग कर एक वास्तविक समय लिखत पर कार्रवाई।
        2. पुस्तकालयों की दाढ़ सांद्रता की गणना करने के qPCR से पुस्तकालयों के आकार और दाढ़ quantitation का प्रयोग करें।
    3. पीएच 8.5 में 0.1% बीच 20 से 10 मिमी Tris-CL का उपयोग करते हुए चार एनएम पुस्तकालयों पतला। -20 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी सील फिल्म के साथ बंद एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में स्टोर पुस्तकालयों।

    एक benchtop Sequencer का प्रयोग 5. अनुक्रमण पुस्तकालय

    1. बाहर पिघलना और निर्माता के निर्देशों के अनुसार अभिकर्मकों तैयार करते हैं।
    2. बर्फ पर 4 एनएम पुस्तकालयों गला लें।
    3. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 0.2 एन NaOH के 1 मिलीलीटर बनाओ।
    4. बराबर मात्रा मात्रा में पूल 4 एनएम पुस्तकालयों, कई पुस्तकालयों कर रहे हैं इस्तेमाल किया जाएगा।
    5. पतला और वांछित अंतिम दाढ़ एकाग्रता के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार जमा पुस्तकालयों denature।
      1. पतला रखें और denatureतैयार है जब तक बर्फ पर जमा पुस्तकालय अभिकर्मक कारतूस पर लोड करने के लिए।
    6. एक नमूना चादर नमूना नाम युक्त और इसी सूचकांक जानकारी पैदा करते हैं और केवल फाइलों .fastq उत्पन्न करने के लिए निर्दिष्ट करें।
      1. Sequencer पर इसी नमूना चादर फ़ोल्डर में लोड नमूना पत्रक।
    7. अच्छी तरह से इसी में अभिकर्मक कारतूस 600 पतला μl और विकृत पुस्तकालय की कुल जोड़ें।
    8. पूरा करने के लिए अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं चलाएँ।

    6. मेथिलिकरण Quantitation डेटा विश्लेषण

    नोट: दोनों वाणिज्यिक और खुला स्रोत सहित NGS डेटा विश्लेषण के लिए उपलब्ध कई कार्यक्रम कर रहे हैं। चल रहे कार्यक्रमों पर विवरण प्रत्येक विशिष्ट पैकेज के साथ पाया जा सकता है। जनरल निर्देश इस सॉफ्टवेयर पैकेज के लिए विशिष्ट आदेशों के साथ साथ हर कदम पर दिया जाता है। (इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर पर जानकारी के लिए सामग्री सूची देखें)।

    1. उपयुक्त एसई में आयात .fastq.gz फ़ाइलेंtrimming पढ़ें में उपयोग के लिए गुणवत्ता स्कोर (Qscores) को बनाए रखने के विश्लेषण पाइपलाइन quencing। (इस उदाहरण कार्यक्रम के लिए 'आयात' का चयन करें और पढ़ता उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया अनुक्रमण विधि का चयन करें। आयात करने के लिए फ़ाइलों को पढ़ने .fastq.gz का चयन करें, और पढ़ें 'जनरल के तहत' त्यागें गुणवत्ता स्कोर 'सही का निशान हटा अनुप्रयोगों trimming के लिए .fastq फाइलों से Qscores बनाए रखने के समाप्त करें 'विकल्प' आयातित पढ़ता है और चयन के लिए। एक स्थान का चयन करें।)
      1. ट्रिम और एक NGS डेटा विश्लेषण पाइप लाइन में निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग पढ़ता बरकरार रहती है। (इस कार्यक्रम के लिए 'NGS कोर उपकरण' के अंतर्गत 'ट्रिम दृश्यों' का चयन करें, और छंटनी की जा पढ़ता का चयन करें।)
        1. केवल ≥ Q30 के स्कोर युक्त पढ़ता को बनाये रखें। (इस कार्यक्रम के लिए 'गुणवत्ता स्कोर का उपयोग कर ट्रिम' का चयन करें और 0.001 करने के लिए सीमा निर्धारित करें।)
        2. बनाए रखने के लिए केवल ≤ एक अस्पष्ट न्यूक्लियोटाइड युक्त पढ़ता है। (इस कार्यक्रम के लिए 'ट्रिम अस्पष्ट न्यूक्लियोटाइड' का चयन करें और सेट1. करने के लिए 'अस्पष्टता की अधिकतम संख्या' पढ़ता छंटनी बचाने के लिए एक स्थान का चयन करें और 'समाप्त' का चयन करें।)
      2. मानचित्र 2.2 से में सिलिको bisulfite परिवर्तित जीन संदर्भ के लिए पढ़ता है छंटनी की। (उदाहरण के सॉफ्टवेयर के लिए 'NGS कोर उपकरण' के अंतर्गत 'मानचित्र संदर्भ के लिए पुस्तकें' का चयन करें। छंटनी का चयन मैप किया और 'अगले' का चयन करें। परिवर्तित संदर्भ अनुक्रम का चयन करें और 'संदर्भ मास्किंग' के अंतर्गत 'नहीं मास्किंग' का चयन किया जाना है पढ़ता है। चुनें ' अगली '।)
        1. बेमेल, सम्मिलन, और विलोपन के लिए अधिकतम सजा निरुपित। निर्धारित मापदंडों पढ़ें लंबाई की 100% से 90% अनुक्रम पहचान के साथ नक्शा करने के लिए आवश्यक है कि इस तरह के। उदाहरण के सॉफ्टवेयर के लिए, बेमेल, सम्मिलन, और विलोपन के लिए 3 के स्कोर आवंटित। संदर्भ के लिए मैप पढ़ें लंबाई की न्यूनतम अंश के लिए एक के स्कोर प्रदान, और पढ़ सकते हैं और संदर्भ मैप के बीच पहचान की न्यूनतम अंश के लिए 0.9 के स्कोर आवंटित।
        2. संरेखण उत्पादन के लिए एक स्वतंत्र फ़ाइल के रूप में प्रत्येक नमूने उत्पन्न करते हैं। उदाहरण के सॉफ्टवेयर के लिए, चुनिंदा 'स्टैंड-अलोन बनाएं मैपिंग पढ़ने' 'आउटपुट विकल्प' और 'परिणाम से निपटने' के अंतर्गत 'सहेजें' के अंतर्गत। पढ़ें मानचित्रण बचाने के लिए और 'समाप्त' का चयन करने के लिए एक स्थान का चयन करें।
      3. मैप किए पढ़ता है पर एक प्रकार बुला कार्यप्रवाह चलाएँ। उदाहरण के सॉफ्टवेयर के लिए, 'Resequencing विश्लेषण' के अंतर्गत 'संभाव्य संस्करण डिटेक्शन' का चयन विश्लेषण किया जा पढ़ें मानचित्रण का चयन करें और 'अगले' का चयन करें। चुनें 'फिल्टर पढ़ें' के अंतर्गत 'गैर विशिष्ट मैचों पर ध्यान न दें' और 'अगले' का चयन करें।
        1. अनुक्रम एक रवानगी पर है कि यह सुनिश्चित करें1000 के लिए 'महत्व' के अंतर्गत 'न्यूनतम कवरेज' की स्थापना करके ≥ 1000 x वें।
        2. संस्करण कॉल आगे दोनों में मौजूद है कि यह सुनिश्चित करने के लिए और पढ़ता रिवर्स। उदाहरण के सॉफ्टवेयर के लिए, चयन 'आगे दोनों में उपस्थिति की आवश्यकता है और खड़ा रिवर्स' 'संस्करण फिल्टर' के अंतर्गत और 'अगले' का चयन करें।
        3. निर्यात गठबंधन संस्करण एक एनोटेट तालिका के रूप में डेटा को बुलाया। उदाहरण के सॉफ्टवेयर के लिए, 'आउटपुट विकल्प' के अंतर्गत 'एनोटेट तालिका बनाएँ' का चयन करें और संस्करण तालिका फ़ाइल को बचाने के लिए एक स्थान का चयन करें। 'समाप्त' का चयन करें।
    2. संस्करण तालिका फ़ाइल से ब्याज के क्षेत्र में एनोटेट CPG स्थलों पर संस्करण आवृत्तियों का उपयोग कर 5-एम सी प्रतिशत की गणना। तटरक्षक में एक संदर्भ सेल्सियस पर साइटोसिन की आवृत्ति 5-एम सी प्रतिशत है।
      नोट: अत्यधिक methylated CPG के लिए एल्गोरिदम बुला संस्करण का उपयोग करते समय, thymines साथ CPG cytosines जगह। इस पहचान के होगाCPG के पर साइटोसिन आवृत्ति, जिसके परिणामस्वरूप वेरिएंट के रूप में वित्तीय वर्ष साइटोसिन के मैप की गई।
    3. पहली सी का प्रतिशत संदर्भ (सी) में CPG साइटों में नहीं है की गणना के द्वारा bisulfite रूपांतरण दक्षता (बीएससी) निर्धारित करते हैं। संदर्भ टी सी (एमपीटी) पर मैप किए गए कुल सी द्वारा कुल टी मैप किया (टी सांसद) की संख्या से गैर CPG सी का प्रतिशत, और विभाजन गुणा करें। 100 शून्य से गणना की आवृत्ति कि पुस्तकालय (समीकरण 1) के bisulfite रूपांतरण दक्षता (बीएससी) है।

    1 समीकरण

    समीकरण 1. Bisulfite रूपांतरण दक्षता।
    नोट: स्तनधारी जीनोम (स्टेम कोशिकाओं को 20 के संभावित अपवाद के साथ) गैर CPG साइटोसिन मेथिलिकरण की बहुत कम मात्रा में होते हैं, वहीं संयंत्र जीनोम एक महत्वपूर्ण मात्रा में होते हैं। इन referenc में bisulfite रूपांतरण दक्षता का निर्धारण करने के क्रम मेंई जीनोम, एक उपयुक्त मार्ग 21 जीनोम और ऊपर वर्णित के रूप में रूपांतरण दक्षता की गणना संयंत्र में मौजूद माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम या क्लोरोप्लास्ट जीनोम या ज्ञात unmethylated जीनों के एक हिस्से का अनुक्रम करने के लिए है। Bisulfite रूपांतरण दक्षता स्थिर सी संभावित गैर CPG मेथिलिकरण से उत्पन्न होने के साथ, ज्यादातर मामलों में ≥98% होना चाहिए।

    Representative Results

    BSAS ठीक से चित्रा 5 समान होगा परिवर्तित संदर्भ अनुक्रम के लिए गठबंधन पढ़ता है। CPG dinucleotides स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है और मेथिलिकरण राज्यों मैप किया पढ़ता में CPG स्थलों पर बेस कॉल देख कर अनुमान लगाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मेथिलिकरण नियंत्रण के साथ, 0% मेथिलिकरण सभी टी (चित्रा 5A) युक्त CPG साइटों के लिए मैप पढ़ता में परिणाम होगा। 100% मेथिलिकरण नियंत्रण मैप किया पढ़ता सभी सी (चित्रा 5 ब) युक्त CPG साइटों के लिए पढ़ता में परिणाम होगा।

    CPG स्थलों पर साइटोसिन आवृत्ति (सी / सी + टी) के quantitation मूल नमूने में मेथिलिकरण आवृत्ति पैदावार। पूरे जीनोम मेथिलिकरण नियंत्रण (एन = 3 / मेथिलिकरण अनुपात) से उत्पन्न एक प्रतिनिधि मानक वक्र प्रत्येक मेथिलिकरण अनुपात (चित्रा 6) में quantitation में मेथिलिकरण quantitation के linearity के साथ ही सटीक पता चलता है। कुल में इस पद्धति का एक उदाहरण के रूप में, आरएनए और डीएनए सह आईएसओ थे माउस सेरिबैलम और रेटिना (एन = 4 / समूह) से lated। चुनिंदा रेटिना ऊतक में व्यक्त Rhodopsin अभिव्यक्ति, qPCR का उपयोग कर मापा गया था। अभिव्यक्ति ही रेटिना (चित्रा 7A) में पाया गया था। BSAS का प्रयोग, CPG मेथिलिकरण स्तरों rhodopsin प्रमोटर क्षेत्र में मात्रा निर्धारित किया गया था। प्रमोटर क्षेत्र भर में संचयी मिथाइलेशन के स्तर रेटिना (पी <0.001, पैरामीट्रिक टी परीक्षण) (चित्रा 7B) में <15% की तुलना में सेरिबैलम में> 80% थे। साइट विशेष मेथिलिकरण quantitation से BSAS मेथिलिकरण quantitation के लाभ, और मेथिलिकरण का स्तर किसी भी जीनोमिक क्षेत्र भर में एक CPG-विशेष के आधार पर तुलना की जा सकती। रेटिना के नमूने (पी <0.001, प्रत्येक CPG स्थल पर पैरामीट्रिक टी परीक्षण) (चित्रा 7C) की तुलना में जब rhodopsin प्रमोटर भर CPG मेथिलिकरण स्तरों अनुमस्तिष्क नमूनों में काफी अधिक थे।

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    चित्रा 1:। BSAS विधि के योजनाबद्ध इस विधि में, जीनोमिक डीएनए uracils को unmethylation cytosines संशोधित करने के लिए परिवर्तित bisulfite है। इसके बाद पीसीआर के दौरान इन uracils thymines करने के लिए बदल रहे हैं। पीसीआर प्रवर्धन हित के क्षेत्रों के खिलाफ निर्देशित और अत्यधिक सिर्फ इन दृश्यों के लिए समृद्ध करती है। जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर amplicons एक साधारण tagmentation प्रक्रिया के माध्यम से दोहरे अनुक्रमित पुस्तकालयों में बना रहे हैं। इसके बाद पुस्तकालयों एक benchtop अगली पीढ़ी Sequencer पर अनुक्रम कर रहे हैं और अनुक्रमण साइटोसिन का एक आधार विशिष्ट ढंग से निर्धारित किया जाता है की सिलिको में परिवर्तित संदर्भ अनुक्रम और प्रतिशत मिथाइलेशन के लिए मैप कर रहे हैं पढ़ता है।

    चित्र 2
    चित्रा 2:। हित के क्षेत्र के सिलिको bisulfite रूपांतरण में किसी भी जीनोमिक संदर्भ से हित के किसी भी क्षेत्र selec किया जा सकता हैसिलिको bisulfite रूपांतरण में लिए टेड। गैर CPG cytosines थाइमिन के संदर्भ अनुक्रम में साथ प्रतिस्थापित कर रहे हैं। CPG cytosines bisulfite में cytosines संदर्भ परिवर्तित रहते हैं।

    चित्र तीन
    चित्रा 3:। प्राइमर नियुक्ति Bisulfite पीसीआर प्राइमरों सिलिको bisulfite में एक के खिलाफ तैयार कर रहे हैं संदर्भ अनुक्रम बदल दिया। प्राइमर वे तटरक्षक dinucleotides ओवरलैप नहीं है इसलिए बनाया गया है या तटरक्षक dinucleotides से सटे डिजाइन किए जा रहे हैं।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: उच्च और खराब गुणवत्ता पीसीआर amplicons और अनुक्रमण पुस्तकालयों के उदाहरण प्रतिनिधि electropherogram निशान और जेल शो (ए) के एक भी उच्च के साथ transposome की मध्यस्थता पुस्तकालय पीढ़ी के लिए आदर्श amplicon।एकाग्रता उत्पाद। इस amplicon से उत्पन्न (बी) के पुस्तकालय (सी) खराब गुणवत्ता पीसीआर amplicons आकार, एकाग्रता में कम हो सकता है। उच्च एकाग्रता और भी आकार के वितरण से पता चलता है, और एकाधिक उत्पादों और / या प्राइमर dimers होते हैं। इन गरीब गुणवत्ता amplicons (डी) के लिए नेतृत्व एकाग्रता कम और कम आकार के वितरण के साथ पुस्तकालय पीढ़ी में विफल रहा होगा।

    चित्रा 5
    चित्रा 5: मेथिलिकरण नियंत्रण से अनुक्रमण outputs के उदाहरण हैं। सिलिको में (ए) CPG साइटों के साथ संदर्भ अनुक्रमण लाल रंग में प्रकाश डाला बदल दिया। मैप किए 0% मेथिलिकरण नियंत्रण CPG स्थलों पर चयनित क्षेत्र दिखा thymines (लालच उजागर) मैपिंग करने के लिए पढ़ता है। मैप किया (बी) 100% मेथिलिकरण नियंत्रण CPG स्थलों पर साइटोसिन की (नीला उजागर) मानचित्रण दिखाने पढ़ता है।


    चित्रा 6:। मेथिलिकरण नियंत्रण की एक सीमा के पार मेथिलिकरण quantitation के 100% 0% से मेथिलिकरण अनुपात (एन = 3 / अनुपात) में मिश्रित पूरे जीनोम मेथिलिकरण नियंत्रण BSAS का उपयोग मात्रा गया। मात्रा निर्धारित बनाम की उम्मीद के quantitation साजिश रचने मेथिलिकरण नियंत्रण quantitation के linearity को दर्शाता है। सभी नियंत्रण के उस पार, मेथिलिकरण quantitation में उच्च परिशुद्धता वहां गया था।

    चित्रा 7
    चित्रा 7: ऊतकों के नमूनों से बनती डीएनए मेथिलिकरण और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण का उदाहरण। (ए) माउस अनुमस्तिष्क और रेटिना के ऊतकों से Rhodopsin सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति। (बी) अनुमस्तिष्क और रेटिना डीएनए (*** पी <0.001, पैरामीट्रिक टी परीक्षण) के बीच BSAS द्वारा मात्रा Rhodopsin औसत प्रमोटर मेथिलिकरण। <माउस सेरिबैलम और रेटिना डीएनए में प्रतिलेखन शुरू होने से साइट [टीएसएस]) के सापेक्ष rhodopsin प्रमोटर (6 करने के लिए -244, भर में मजबूत> सी) CPG साइट विशेष मेथिलिकरण स्तरों।

    Discussion

    BSAS नमूने और लक्ष्य की संख्या के दोनों संख्या में उच्च throughput क्षमताओं के साथ ध्यान केंद्रित किया, सही डीएनए मेथिलिकरण quantitation के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, transposome की मध्यस्थता tagmentation का उपयोग करते हुए इस पुस्तकालय पीढ़ी तेज, कम इनपुट डीएनए की आवश्यकता है और पारंपरिक बाल काटना और बाद एडाप्टर बंधाव तकनीक की तुलना में कम चरणों में हैं। मौजूदा तरीकों पर इन सुधारों हित के किसी भी लक्ष्य का सटीक आधार स्तर के डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, BSAS पूरे जीनोम bisulfite 22 या कब्जा 23 तरीकों का उपयोग पहचान की गई है कि ब्याज के क्षेत्रों (विभिन्न मेथिलिकरण क्षेत्रों (DMRs), CPG द्वीप समूह, विनियामक क्षेत्रों) की पुष्टि के लिए एक नया तरीका प्रदान करता है। ओर्थोगोनल पुष्टि दृष्टिकोण और अधिक मात्रात्मक सटीक विधियों का प्रयोग epigenomic अध्ययन के विश्लेषणात्मक कठोरता में सुधार। BSAS के साथ हासिल की उच्च पढ़ें गहराई रहे हैं, एक संकीर्ण विश्वास अंतराल में सटीक quantitation के लिए अनुमति देता हैसटीक quantitation के 16 में sulting। साथ ही, एक ही प्रयोग में कई नमूने चलाने की क्षमता सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि होगी जो पूरे जीनोम के तरीकों की पुष्टि के लिए नमूने का आकार बढ़ाने के लिए कर सकते हैं; कई मौजूदा epigenetic अध्ययन की एक कमजोरी। महत्वपूर्ण बात है, BSAS epigenetic अनुसंधान के लिए परीक्षण योग्य परिकल्पना की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है जो एक आधार विशिष्ट CPG मेथिलिकरण quantitation, प्रदान करता है। इस तरह के एक विशेष प्रतिक्रिया तत्व में वृद्धि हुई मिथाइलेशन के रूप में परिकल्पना की कमी हुई एक विशिष्ट प्रतिलेखन कारक के बंधन में परिणाम होगा। बनती mRNA अभिव्यक्ति डेटा के साथ संयुक्त BSAS, ऊतक या सेल की आबादी का एक टुकड़ा भीतर epigenetic विनियमन और mRNA अभिव्यक्ति दोनों प्राप्त करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। विनियमन और अभिव्यक्ति की बनती माप भी वैज्ञानिक कठोरता और निष्कर्षों के प्रभाव को बढ़ा सकते हैं।

    BSAS प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम प्राइमर डिजाइन, amplicon के अनुकूलन, और पुस्तकालय पीढ़ी / शामिलक्यूसी। प्राइमरों अच्छी तरह से डिजाइन और अलग अलग क्षमता 8 बजे बढ़ाना नहीं कर रहे हैं अगर पीसीआर पूर्वाग्रह शुरू की है। ऐसे enzymatically उत्पन्न 100% और 0% साइटोसिन methylated मानकों के रूप में मेथिलिकरण मानकों का उपयोग करते हैं, यदि कोई हो मेथिलिकरण quantitation के पूर्वाग्रह के, डिग्री का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और मेथिलिकरण 16 बढ़ाता है जब एक उचित पद्धति नियंत्रण किया जा सकता है। एक भी उच्च गुणवत्ता वाले amplicon पैदा करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाओं के अनुकूलन इसी प्रकार, जब ध्यान रखा जाना चाहिए। कोई amplicon के प्रोटोकॉल में विस्तृत सुझाव दिया दिशानिर्देशों का उपयोग मौजूद है, तो अनुकूलन के चरणों में वृद्धि पीसीआर चक्र नंबर या bsDNA इनपुट राशि शामिल है। प्राइमर-dimers सहित कई पीसीआर उत्पादों, कर रहे हैं, अनुकूलन कदम, bsDNA इनपुट मात्रा कम पीसीआर प्राइमर दाढ़ इनपुट सांद्रता कम है, annealing के तापमान में वृद्धि, या पीसीआर चक्र संख्या घटते शामिल हैं। इन अनुकूलन प्रक्रियाओं में से एक या एक संयोजन एक एकल hig के उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त परिणाम पैदावारएच गुणवत्ता amplicon। वैकल्पिक रूप से, प्राइमरों redesigning एक भी amplicon उपज नहीं है कि प्राइमर सेट के लिए एक अच्छा तरीका है। नया स्वरूप उपयुक्त है या संभव नहीं है, जहां उन क्षेत्रों के लिए, दोनों रिवर्स प्राइमरों में CPG स्थलों पर CPG आगे प्राइमरों में साइटों और एडिनाइन की और गुआनिन है पर साइटोसिन की और थाइमिन का काम कर सकते हैं सहित प्राइमर सेट पतित। हालांकि, इन प्राइमर सेट पूर्वाग्रह उत्पन्न हो रही है कोई पीसीआर, इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर एक प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए आगे अनुकूलन की जरूरत है। गुणवत्ता पुस्तकालयों की सफलता के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण हैं। QC उपायों अनुक्रमण पहले पुस्तकालयों के आकार, गुणवत्ता और मात्रा निर्धारित करने के लिए बाहर किया जाता है सुनिश्चित करें। अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं कम गुणवत्ता पुस्तकालयों के निवेश के साथ असफलता की संभावना है। मेथिलिकरण quantitation में पूर्वाग्रह मेथिलिकरण आवृत्तियों आगे दोनों में मौजूद हैं और अनुक्रमण पढ़ता रिवर्स कि सुनिश्चित करने के द्वारा कम किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, CPG साइटों के लिए aligning अड्डों की गुणवत्ता स्कोर उच्च सह के लिए ≥Q30 होना चाहिएquantitation में nfidence। दूसरों के ऊपर वर्णित मेट्रिक्स, यह सुनिश्चित करने bisulfite परिवर्तित डीएनए 19 की tagmentation प्रतिक्रियाओं में कोई पक्षपात करने के लिए पहले से थोड़ा दिखाया है जबकि कम पूर्वाग्रह मेथिलिकरण quantitation की पुष्टि के लिए अनुमति देता है।

    BSAS वर्तमान में हालांकि, इस पद्धति के भविष्य के विस्तार में इस तरह के bisulfite रूपांतरण 24 से पहले पोटेशियम perruthenate शुरू करने के रूप में 5-एम सी और 5 HMC के बीच भेद प्रायोगिक कदमों के अलावा के साथ CPG 5-HMC की बनती माप की अनुमति देगा, CPG स्थलों पर मिथाइलेशन के उपाय। यह डीएनए मेथिलिकरण के जीन की अभिव्यक्ति नियामक भूमिकाओं का निर्धारण करने के क्रम में, बनती मिथाइलेशन के लिए अनुमति देकर 5-एम सी और 5 HMC, और अभिव्यक्ति डेटा दोनों BSAS उपयोगिता के प्रभाव में वृद्धि होगी। पीसीआर amplicons के Transposome की मध्यस्थता पुस्तकालय तैयारी परिलक्षित क्षेत्रों के सिरों पर कमी आई अनुक्रमण गहराई में परिणाम होता है। इसलिए, उच्च ब्याज के क्षेत्रों amplicons के बीच में निवास करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए। केसीBSAS उत्पन्न करता है क्योंकि कभी, अनुक्रमण> 1000 एक्स, परिलक्षित क्षेत्रों के सिरों के पास माप उच्च बनी हुई है 5-एम सी के मात्रात्मक सटीकता की गहराई से पढ़ा है।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agilent 2100 Bioanlyzer Agilent G29393AA
    Agilent RNA 6000 Nano kit Agilent 5067-1511
    Agilent High Sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
    Typhoon 9200 Amersham/GE Healthcare Life Sciences
    Agencourt AMPure XP - PCR Purification Beckman Coulter A63880 5 ml
    PowerPac Basic Power Supply Bio Rad 164-5050
    twin.tech PCR plate 96  Eppendorf 951020362 semi-skirted
    Heatsealing Film Eppendorf 0030127838
    Heatsealing Foil Eppendorf 0030127854
    Heat Sealer Eppendorf 5390000.024
    0.1-10 μl Tips Eppendorf 0030073.002
    2-200 μl Tips Eppendorf 0030073.045
    50-1,000 μl Tips Eppendorf 0030073.100
    MixMate  Eppendorf 5353000.014
    1.5 ml Microcentrifuge Tubes Eppendorf 0030121.023
    Centrifuge 5424 Eppendorf 5424000.010
    2.0 ml Microcentrifuge Tube Eppendorf 022363352
    Nextera XT DNA Sample Preparation Kit Illumina FC-131-1024 24 rxn
    Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001 24 indexes
    MiSeq Desktop Sequencer Illumina
    MiSeq Reagent Kit v2 Illumina MS-102-2002 300 cycles
    KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit KAPA Biosystems KK4824
    Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit Life Technologies P7589
    Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit Life Technologies R11490
    ProFlex 96-well PCR system Life Technologies 4484075
    Novex 6% TBE DNA gel Life Technologies EC6261BOX 10-well
    Novex TBE Running Buffer Life Technologies LC6675 5x (1 L)
    Novex Hi-Density TBE Sample Buffer Life Technologies LC6678 5x (10 ml)
    1 Kb Plus DNA Ladder Life Technologies 10787-018
    Xcell SureLock Mini-Cell Life Technologies EI0001
    UltraPure 10 mg/ml Ethidium Bromide Life Technologies 15585-011
    7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001 384-well block
    DynaMag-96 Side Skirted Life Technologies 12027
    SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices/VWR 89429-532
    AllPrep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204
    Stainless Steel Beads Qiagen 69989 5 mm
    CLC Genomics Workbench Qiagen Software for methylation pipeline
    QIAQuick PCR Purification kit Qiagen 28104 50 rxn
    TissueLyser II Retsch/Qiagen 85300
    Nuclease-Free Water Sigma W4502
    TRIS hydrochloride Sigma PHG0002-100G
    Tween-20 Sigma P9416-50ML
    NanoDrop 2000 Thermo Scientific
    384-well Full-Skirted Plate, Standard Thermo Scientific AB-1384
    Absolute qPCR Seal Thermo Scientific AB-1170
    EZ DNA Methylation-Lightning kit Zymo Research D5030 50 rxn
    ZymoTaq DNA Polymerase Zymo Research E2001 50 rxn

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    References

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    आण्विक जीवविज्ञान अंक 96 epigenetics डीएनए मेथिलिकरण अगली पीढ़ी के अनुक्रमण जैव सूचना विज्ञान जीन अभिव्यक्ति साइटोसिन CPG जीन अभिव्यक्ति विनियमन
    डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा लक्षित
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    Masser, D. R., Stanford, D. R., Freeman, W. M. Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing. J. Vis. Exp. (96), e52488, doi:10.3791/52488 (2015).

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