Introduction
Det har vært over et halvt århundre siden den første rapporten av naturlig forekommende DNA modifikasjoner i form av cytosin metylering en. Cytosin metylering er en modifisert cytosin nukleotid-base hvor den 5. karbon på basisringen har en metylgruppe (5-MC), som oftest forekommer i CpG-dinukleotid motiv i pattedyr genomer. Den funksjonelle nærvær av 5-mC i genet promotorer er vanligvis forbundet med transkripsjonen undertrykking, mens fraværet er forbundet med transkripsjonen aktivitet 2.
Store fremskritt er gjort i vår forståelse av rollen av DNA metylering i utvikling 3, transgeneration forplantning av epigenetiske profiler 4, kreft patogeneserelaterte 5,6, og en rekke andre forskningsområder. Mange av disse fremskrittene har kommet i de siste årene som nye metoder har blitt utviklet for å profilere DNA metylering 7. Med advent ogpopularisering av neste generasjons sekvensering (NGS) teknikker er det nå en rekke metoder for å profilere DNA metylering over en hel genom eller store regioner av et genom 8. Disse tilnærmingene åpner muligheten for oppdagelse studier som kvantifiserer DNA-metylering mønstre og forskjeller i DNA metylering. I tillegg til disse hypotese generer tilnærminger, er det et betydelig behov for målrettet / hypotesetesting DNA-metylering kvantiteringsstandarder metoder.
Pyrosekvensering, metylering spesifikk PCR, og direkte Sanger-sekvensering av bisulfit konverterte DNA har vært de mest brukte metoder for analyse av målrettede regioner (dvs. en promoter-regionen i et enkelt gen eller en CpG island) 9-12. Alle disse metodene er avhengige av bisulfite konvertering, en kjemisk deaminering reaksjon hvor unmethylated cytosin-er omgjort til uracil-tallet, mens denaturert cytosin er fortsatt intakt 13,14. PCR-amplifisering av bisulfittkatalysertkonverterte DNA resulterer i erstatning av uracil er med tymin 15 slik at differensial metylering for å lese ut som en base forskjell. Mens svært nyttig, er begrensningene til disse metodene omfatter lav kvantitativ nøyaktighet, kort lese lengde, og lav prøvekapasitet. For å møte disse begrensningene vi utviklet en metode vi har kalt Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS) 16. Målet med denne fremgangsmåte er å være i stand til å analysere target genomiske regioner av interesse i et stort antall prøver med kvantitativ nøyaktighet.
BSAS bruker elementer av eksisterende metoder (bisulfite konvertering og regionspesifikk PCR forsterkning) og kombinerer dem med enkle neste generasjons bibliotek konstruksjon (transposome-mediert) 17 og stasjonære maskiner NGS 18 (figur 1). Denne tilnærmingen gir for en mer kvantitativ og høyere gjennomstrømning metode for å undersøke cytosin metylering i en region av interesse. Her presenterer vimetode i detalj og beskrive framgangsmåter for feilsøking og kvalitet sjekke BSAS prosessen.
Protocol
1. nukleinsyreisolering fra Tissue
MERK: Co-isolering av DNA og RNA fra samme vevsprøve tilbyr muligheten til å samle inn DNA for epigenetisk analyse og paret RNA genekspresjon analyse for. Eksempelet gitt her er en form for kolonnerensing fra eksperimentell vevet, men alternative tilnærminger for ulike samplings eller andre isoleringsmetoder kan anvendes. Det primære krav er for høyt renset nukleinsyre uten å forurense protein eller organiske oppløsningsmidler.
- Velg et stykke ferskt frosset eller ferskt vev for mekanisk homogenisering og legg på is. Store eller overføre vev til en 2,0 ml rundbunnet mikrosentrifugerør.
- Tilsett en 5 mm rustfritt stål vulst til hvert rør inneholdende vev. Tilsette en passende mengde av lyseringsbuffer, basert på produsentens forslag av celletallet eller vev vekt.
- Homogenisere vev ved hjelp av en kulemølle mekanisk homogenisering på30 Hz til 30 sek.
MERK: hyppighet og varighet av mekanisk homogenisering er avhengig av vevstype. Mykere vev vil helt homogen bruke de anbefalte innstillingene, mens tøffere vev krever innstilling optimalisering. - Utføre DNA og RNA isolert ved hjelp av silikagel spinnkolonner ved romtemperatur etter produsentens protokoll.
- Elute RNA i 50 mL av RNase-fritt vann og plass på is. Bruk RNA mRNA uttrykk analyse av qPCR for.
- Eluere DNA i 100 ul TE-buffer. Gjenta eluering av DNA-kolonne under anvendelse av elueringsmiddel til å øke DNA-konsentrasjon og utbytte. Bruke DNA for målrettet metylering kvantifisering.
- Vurdere kvaliteten av DNA og RNA ved anvendelse av en standard spektrofotometer for absorbans ved 230 nm, 260 nm, 280 nm og 320 nm.
MERK: A260 / A280 ratio bør være ~ 1,8 til 2 for høy kvalitet DNA. A260 / A280 ratio bør være ~ 2 for høy kvalitet RNA. Tilstedeværelsen av overskudd av absorbans ved 230 nm indiskates forurensninger fra isoleringsprosedyren. - Kvalitet sjekke RNA ytterligere ved hjelp av en kapillær elektroforese chip i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Høy kvalitet RNA vil ha et RNA integritet nummer (RIN)> 8. Tilstedeværelsen av ekstra topper i elektroferogrammet foruten rRNA topper indikerer forurensning av prøven. - Kvantifisere DNA og RNA av fluorescerende assay i henhold til produsentens protokoll.
MERK: Ved hjelp av en fluorometrisk analysen er mer sensitiv og spesifikk for kvantifisering av nukleinsyrer enn spektrofotometri alene. - Lagres isolert DNA og RNA ved -80 ° C.
2. Target Identifisering og Primer Design
- Bestem den genomiske region (r) av interesse å bli analysert ved BSAS basert på den aktuelle referansegenomsekvensen. Gene arrangører av differensielt uttrykte gener er felles mål for metylering kvantifisering.
- Forberede en in silico bisulfite-konvertereed referanse genom for senere justering av sekvense leser ved å endre .fasta sekvens filen i en tekst editor. I 5'-3 'retning, erstatte ikke-CpG cytosin-tallet med tymin-tallet (figur 2).
- Design primer sett å forsterke områder av interesse fra bisulfite konverterte DNA.
- Velge og kopiere uomvendte regionen av interesse, i 5'-3 'retning, inn i en sulfitt-spesifikke PCR-primer design program (figur 3).
MERK: En optimal bisulfite-PCR amplicon lengde er 250-400 bp per fragment som bisulfitt behandlings fragmenter DNA, og det er vanskelig å forsterke store> 400 bp regioner. Hvis, for eksempel, er av interesse for en region av 1 kb, kan flere primerpar være utformet for å dekke dette området. Design amplikonene å være like bp størrelse for enkel pooling. Unngå amplicon lengder <250 bp fordi disse kan være utilstrekkelig lengde for bibliotek generasjon. En optimal primer lengde for BSAS er>20 bp per primer. - Velg en T m spekter av 55-65 ° C og en maks T m forskjell mellom forover og revers primere av 1-2 ° C.
- Velg primerparene som best dekker regionen av interesse. Ikke velg primere som inneholder CpG områder eller er i direkte tilknytning til CpG områder, da dette vil føre til skjevhet i PCR reaksjoner. Bruk standard PCR primere som kan bestilles fra en rekke akademiske og kommersielle leverandører.
- Rekonstituere frysetørkede primere i RNase / DNase gratis vann på en fungerende lager på 100 mikrometer.
- Velge og kopiere uomvendte regionen av interesse, i 5'-3 'retning, inn i en sulfitt-spesifikke PCR-primer design program (figur 3).
- Oppbevar PCR primere ved -20 ° C. Fortynne 100 mikrometer primer lager til 10 mikrometer arbeids lager for PCR reaksjoner.
3. Bisulfite Spesifikk PCR Optimization
NB: For bisulfitt omdannelse av genomisk DNA, en rekke forskjellige kommersielle kits for bisulfitt omdannelse er tilgjengelig. Velg kit eller protokoll som passer best til det planlagte forsøket.
<ol>MERK: 1-2 ul av bisulfitt konverterte DNA er tilstrekkelig for optimalisering PCR-reaksjoner dersom 1 pg genomisk DNA ble brukt til omdannelse inngang.
- Montere den etterfølgende reaksjon for target-amplifikasjon optimalisering av et enkelt fragment. Til flere prøver, montere reaksjoner i en 96-brønners PCR-plate.
25 ul 2x reaksjon buffer
0,5 mL dNTP Mix
5 mL 10 mm Forward Primer (Final 1fiM)
5 mL 10 mikrometer Reverse Primer(Final 1fiM)
2 ul mal bisulfite konvertert DNA
0,4 mikroliter (5 U / mikroliter) DNA polymerase
12.1 mL DNase fritt vann (Final reaksjon volum 50 mL) - Forsegl PCR-plate med den passende klebemiddel eller varmeforseglet film.
- Plasser reaksjon på en hensiktsmessig termosykler og bruke følgende sykkelforholdene med et oppvarmet lokk:
- Utføre en innledende denaturering ved 95 ° C i 10 min.
- Denaturering ved 95 ° C i 30 sek.
- Glødning i 30 sekunder ved den spesifikke T m av primere som brukes. Start ved en glødetemperatur noen få ° C under T m av primeren for optimalisering reaksjoner.
MERK: Best varmebehandlingstemperaturer kan også bestemmes ved anvendelse av en gradient termosykler for å teste et område av temperaturer. - Utføre en forlengelse ved 72 ° C i 30 sek. Forlenge forlengelse tid for lengre amplikonene.
- Gjenta trinn 3.3.3.2-3.3.3.4 for 35 sykluser tiltal for første optimalisering. Høyere sykkel tallene kan være nødvendig, men bør generelt unngås for å hindre klonale presiseringer som vil skape reaksjons gjenstander.
- Utfør en endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 min.
- Hold reaksjoner ved 4 ° C.
- Visualisere amplikonene etter side elektroforese. Alternativt kan du bruke en kapillær elektroforese DNA chip i henhold til produsentens protokoll.
- Bland 24 ul av PCR-reaksjonen med 6 ul 5x lasting fargestoff på is og virvle.
- Lag 1 liter 1x TBE buffer ved å blande 200 ml 5x TBE buffer og 800 ml DDH 2 O. Fortynn DNA stige til en endelig konsentrasjon på 0,5 ug per brønn i DDH 2 O og lasting fargestoff.
- Last brønner med 30 mL av PCR reaksjoner eller stige.
- Kjør gelen ved 200 V i ~ 45 min. Stopp gel kjørt når den første fargestoff fram når enden av gelen.
- Flekk gelen med 5 mikrogram / mletidiumbromid ved blanding av 5 ul av 10 mg / ml i 100 ml DDH 2 O. Dekk hele gel og la inkuber for ~ 5 min.
- Bilde gelen via en UV-lysboks eller multimodal bildefanger ved en eksitasjonsbølgelengde på 482 nm.
- Under henvisning til stigen, størrelse PCR amplikoner og bestemme spesifisiteten av reaksjonen ved å se etter flere bånd enn den forventede amplikon størrelse (figur 4A og C).
- Når optimale forhold for BS-PCR har blitt bestemt, utføre BS-PCR på eksperimentelle prøver.
- Rens amplikonene fra resterende primere og andre reaksjonskomponenter. Silika kolonne rensing, SPRI perle, eller gel-basert opprydding og kvantifisering utføre.
- Eluer amplikonene i 30 ul TE buffer.
- Kvantifisere amplikonene bruker fluorometrisk analyse ved hjelp av produsentens protokoller.
- Hvis det er flere amplikonene per prøve, basseng dem på lik vekt per volumbeløp og butikk ved -20 ° C.
4. NGS Bibliotek Forberedelse og Bibliotek QC
MERK: BSAS NGS bibliotek forberedelse bruker en forenklet transposome-mediert protokoll med dual-indeksering (Se Materialer listen for detaljer om bibliotek forberedelse kit utvalg). Denne metoden gir en ekstremt rask og høy gjennomstrømming rute for bibliotek konstruksjon som er validert og viser liten eller ingen skjevhet i bisulfitt sekvense applikasjoner 16,19. Dual-indeksering tillater en større multipleksing av prøvene enn enkelt indeksering. Andre bibliotek forberedelse stiler kan være mulig, men har ikke blitt testet.
- Forberede NGS biblioteker fra BS PCR amplikonene i en 96-brønns PCR plate. Fortynn amplikonene til 0,2 ng / ul i et sluttinngangs masse av 1 ng, eller 5 pl av 0,2 ng / ul fortynning. Utfør en opprydding av genererte biblioteker bruker Spri perler. Bruk 50-90 mL Spri perler for å isolere biblioteker wed denne protokollen. Volumet av Spri perler avhenger av målstørrelse av biblioteket og syklusen antall ønskede sekvenseringsreaksjoner.
MERK: Bruk en mikro shaker eller plate vortexer å suspendere perler.- Eluere bibliotekene av perlene og overføring til en ny 96-brønners plate og forsegling med varmeforseglende film for lagring ved -20 ° C.
- Bestemme størrelsen og konsentrasjonen av biblioteker (figur 4B og D).
- Kjør bibliotekene på en kapillær elektroforese DNA sizing chip i henhold til produsentens protokoller.
- Bruk en høy følsomhet kapillarelektroforese DNA-analyse for å bestemme den gjennomsnittlige størrelsen på oppdagede bibliotek topper og en estimering av molariteten henhold til produsentens protokoller.
- Kvantifisere biblioteker ved qPCR, ved hjelp av primere designet mot adapter sekvensene i de genererte biblioteker og bruke standarder med kjent konsentrasjon.
- Kjør qPCR rehandlinger på en real-time instrument ved hjelp av de absolutte kvantiteringsstandarder innstillinger i henhold til produsentens protokoller.
- Bruk av størrelsen av biblioteker, og det molare mengde fra qPCR å beregne de molare konsentrasjoner av bibliotekene.
- Kjør bibliotekene på en kapillær elektroforese DNA sizing chip i henhold til produsentens protokoller.
- Fortynn biblioteker til 4 nM ved anvendelse av 10 mM Tris-Cl med 0,1% Tween-20 ved pH 8,5. Oppbevar bibliotek i en 96-brønners PCR-plate forseglet med varmeforseglende film ved -20 ° C.
5. Sekvense Biblioteker Bruke en Benchtop Sequencer
- Tine opp og forberede reagenser i henhold til produsentens instruksjoner.
- Tine 4 nM bibliotekene på is.
- Lage en ml 0,2 N NaOH i en 1,5 ml mikro tube.
- Pool 4 nM biblioteker i like volummengder, hvis flere biblioteker skal brukes.
- Fortynne og denaturering sammenslåtte bibliotekene i henhold til produsentens instruksjoner til den ønskede slutt molar konsentrasjon.
- Hold utvannet og denatureresamlet bibliotek på is inntil klar til å laste på reagensforpakningen.
- Generere en prøve ark med prøvenavn og tilhørende indeksinformasjon og spesifisere å generere .fastq filer.
- Last prøve ark i tilsvarende prøvearket mappe på sequencer.
- Legg til sammen 600 mL utvannet og denaturert bibliotek til reagensforpakningen i den tilsvarende godt.
- Kjør sekvense reaksjoner på ferdigstillelse.
6. Metylering Kvantitering Data Analysis
MERK: Det er flere programmer tilgjengelig for NGS dataanalyse inkludert både kommersielle og åpen kildekode. Detaljer om kjørende programmer kan bli funnet med hver enkelt pakke. Generelle instruksjoner er gitt på hvert trinn sammen med de spesifikke kommandoer for denne programvarepakken. (Se Materialer listen for detaljer om programvare som brukes i denne protokollen).
- Import .fastq.gz filer til passende sequencing analyse rørledning beholde kvalitetspoeng (Qscores) for bruk i lese trimming. (For dette eksempelet program velg "Import" og velg sekvense metode som brukes til å generere lyder. Velg .fastq.gz lese filer som skal importeres, og beholde Qscores fra .fastq filer for lese trimming applikasjoner ved å fjerne merkingen 'Forkast kvalitetspoeng' under 'Generelt alternativer '. Velg en plassering for den importerte leser og velger' Fullfør '.)
- Trim og beholde leser ved hjelp av følgende innstillinger i en NGS dataanalyse rørledning. (For dette programmet velge 'Trim Sekvenser' under 'NGS Kjerne Tools', og velg leser for å bli trimmet.)
- Beholde bare leser som inneholder ≥ Q30 score. (For dette programmet velge 'Trim bruker kvalitetspoeng "og setter grensen til 0.001.)
- Beholde bare leser inneholder ≤ en tvetydig nukleotid. (For dette programmet velge 'Trim tvetydige nukleotider' og still'Maksimalt antall tvetydigheter "til 1. Velg et sted å lagre trimmet leser og velg" Finish ".)
- Kart trimmet leser til i silico bisulfite konvertert genet referanse fra 2.2. (For eksempel programvare velger 'Kart Leser til Reference "under" NGS Kjerne Tools'. Velg trimmet leser for å bli kartlagt og velg "Neste". Velg den konverterte referansesekvensen og velg "ingen maskering 'under' henvisning maskering". Velg " neste ".)
- Tildele en maksimumsstraff for uoverensstemmelser, innsettinger og slettinger. Sett parametre slik at 100% av leselengde er nødvendig for å kartlegge med 90% sekvensidentitet. For eksempel programvare, tildele en score på 3 for uoverensstemmelser, innsettinger og slettinger. Tildele en score på 1 for minimum brøkdel av lese lengde kartlagt til referanse, og tildele en score på 0,9 for minimal brøkdel av identitet mellom kartlagt lese og referanse.
- For innretting utgang genererer hver prøve som en selvstendig fil. For eksempel programvare, velger du "Opprett frittstående lese kartlegginger" under "Output options" og "Lagre" under "Resultat håndtering". Velg en plassering for å lagre lesekartlegging og velg "Finish".
- Kjør en variant ringer arbeidsflyt på kartlagt leser. For eksempel programvaren, velger 'Probabilistic Variant Detection' under 'resequencing Analysis', velg lese kartlegging som skal analyseres og velg "neste". Velg 'Ignorer uspesifikke kampene' under 'Les filtre "og velg" Neste ".
- Sikre at sekvensen er på en depth på ≥ 1000 X ved å sette 'minimum dekning "under" Betydning "til 1000.
- Kontroller at varianten samtalen er til stede i både forover og bakover leser. For eksempel programvaren, velger 'Krev tilstedeværelse i både forover og bakover stands "under" Variant filtre "og velg" neste ".
- Eksport justert, variant kalt data som en annotert tabellen. For eksempel programvare, velger du "Opprett annotert tabell 'under" Output options "og velg et sted å lagre variant tabellfilen. Velg "Finish".
- Trim og beholde leser ved hjelp av følgende innstillinger i en NGS dataanalyse rørledning. (For dette programmet velge 'Trim Sekvenser' under 'NGS Kjerne Tools', og velg leser for å bli trimmet.)
- Beregn 5-MC prosent bruker variant frekvenser ved kommenterte CpG steder i regionen av interesse fra variant tabellfilen. Frekvensen av cytosin ved en referanse C i CG er den 5-mC prosent.
MERK: Når du bruker variant ringer algoritmer for høyt denaturert CpG-tallet, erstatte CpG cytosines med thymines. Dette vil Identify det kartlagt cytosin er som varianter, noe som resulterer i cytosine frekvens på CpG-tallet. - Bestem bisulfitt konverteringseffektivitet (BSC) ved først å beregne prosentandelen av C er ikke i CpG områder i referanse (C). Multiplisere andelen av ikke CpG C-årene av antall totale Ts kartlagt (T mp), og dividere med totalt C er kartlagt ved referanse Ts (C MPT). 100 minus frekvensen beregnet er bisulfitt konverteringseffektivitet (BSC) for at biblioteket (ligning 1).
Ligning 1. Bisulfite omdannelseseffektiviteten.
MERK: Mens pattedyr genomer inneholder svært lave mengder av ikke-CpG cytosin metylering (med unntak potensielt av stamceller 20), plante genomer inneholder en betydelig mengde. For å bestemme bisulfitt konverteringseffektiviteten i disse referansebrenslete genomer, er en egnet vei for å sekvensere et parti av mitokondrie genome eller kloroplastgenomer eller kjente unmethylated gener til stede i anlegget genomer 21 og beregning av konverteringseffektivitet, som beskrevet ovenfor. Bisulfitt konverteringseffektivitet bør være ≥98% i de fleste tilfeller, med det uomdannede Cs potensielt oppstår fra ikke CpG metylering.
Representative Results
BSAS leser riktig justert til konverterte referansesekvensen vil likne Figur 5. CpG dinukleotider kan tydelig identifiseres og metylering stater kan anslås ved å observere grunn samtaler på CpG områder i kartlagt leser. For eksempel, med metylering kontroller, vil 0% metylering resultere i alle leser kartlagt til CpG områder som inneholder T-tallet (figur 5A). 100% metylering kontrollene vil resultere i alle leser kartlagt leser til CpG nettsteder som inneholder C-tallet (Figur 5B).
Kvantitering av cytosin frekvens (C / C + T) på CpG områder gir den metylering frekvens i den opprinnelige prøven. En representativ standard kurve generert av hele genomet metylering kontroller (n = 3 / metylering forhold) viser linearitet av metylering kvantifisering samt presisjon i kvantifisering ved hver metylering forholdet (figur 6). Som et eksempel på denne metoden totalt RNA og DNA ble ko-iso lert fra mus lillehjernen og retina (n = 4 / gruppe). Rhodopsin ekspresjon, selektivt uttrykt i retinalt vev, ble målt ved hjelp av qPCR. Uttrykket ble bare påvist i netthinnen (figur 7A). Ved hjelp BSAS ble CpG metylering nivåer kvantifisert i rhodopsin promoter regionen. Kumulative metylering nivå på tvers av promoter-regionen var> 80% i lillehjernen i forhold til <15% i retina (p <0,001, parametrisk t-test) (figur 7B). Bsas metylering kvantiteringsstandarder fordeler fra stedsspesifikke metylering kvantifisering og metylering nivåer kan sammenlignes på en CpG-spesifikk basis over en gitt genomisk region. CpG metylering nivåer over rhodopsin promoter var betydelig høyere i lillehjernen prøvene sammenlignet med netthinnen prøver (p <0,001, parametrisk t-test på hvert CpG område) (figur 7C).
1highres.jpg "/>
Figur 1:. Skjematisk av BSAS metode I denne metoden, er genomisk DNA bisulfite konverterte til å endre unmethylation cytosines til uraciler. Deretter, i løpet av PCR disse uraciler er endret til thymines. PCR forsterkning er rettet mot områder av interesse og høyt beriker for nettopp disse sekvensene. De resulterende PCR amplikonene er laget i dual-indeksert bibliotekene gjennom en enkel tagmentation prosess. Deretter bibliotekene er sekvensert på en benkeplate Bøk neste generasjon sequencer og sekvense leser blir konvertert til den i silico konvertert referansesekvensen og prosent metylering av cytosin er bestemmes i en base-spesifikk måte.
Figur 2:. I silico bisulfite konvertering av regionen av interesse Enhver regionen av interesse fra noen genomisk referansen kan være selected for i silico bisulfite konvertering. Ikke-CpG cytosines er erstattet med tymin s i referansesekvensen. CpG cytosines forbli cytosines i bisulfit konvertert referanse.
Fig. 3: Primer plassering Bisulfite PCR-primere er utformet mot en in silico bisulfitt omdannet referansesekvens. Grunning er å være utformet slik at de ikke overlapper CG dinukleotider eller utformet i tilknytning til CG dinukleotider.
Figur 4: Eksempler på høy og dårlig kvalitet PCR amplikonene og sekvense biblioteker Representative elektroferogrammet spor og gel viser (A) ideell amplicon for transposome-mediert bibliotek generasjon med en enkelt høy.Konsentrasjonen produktet. (b) Bibliotek generert fra dette fragment viser høy konsentrasjon og med størrelsesfordeling. (C) Dårlig kvalitet PCR amplikoner kan være lav i størrelse, konsentrasjon og inneholde flere produkter og / eller primer-dimerer. Disse dårlig kvalitet amplikonene vil føre til (D) mislyktes bibliotek generasjon med lav konsentrasjon og lav størrelsesfordeling.
Figur 5: Eksempel på sekvense utgangene fra metylering kontroller. (A) I silico konvertert referanse sekvensering med CpG områder markert med rødt. 0% metylering kontroll kartlagt leser i utvalet viser thymines (grådighet høydepunkt) kartlegging på CpG nettsteder. (B) 100% metylering kontroll kartlagt leser vise cytosin-tallet (blå høydepunkt) kartlegging ved CpG nettsteder.
Figur 6:. Metylering kvantifisering tvers av en rekke metylering kontroller hele genomet metylering kontroller blandet ved metylering forhold (n = 3 / ratio) fra 0% til 100% ble kvantifisert ved hjelp BSAS. Plotting kvantifisering av forventet versus kvantifisert demonstrerer linearitet av metylering kontroll kvantifisering. På tvers av alle kontroller, det var høy presisjon i metylering kvantifisering.
Figur 7: Eksempel paret DNA metylering og analyse av genuttrykk fra vevsprøver av. (A) Rhodopsin relativ mRNA uttrykk fra mus lillehjernen og retinal vev. (B) Rhodopsin gjennomsnittlig promoter metylering kvantifisert ved BSAS mellom lillehjernen og retinal DNA (*** p <0,001, parametrisk t-test). <strong> C) CpG stedsspesifikke metylering nivåer på tvers rhodopsin promoter (-244-6 i forhold til transkripsjon start stedet [TSS]) i musehjernen og retina DNA.
Discussion
BSAS åpner for fokusert, nøyaktig DNA metylering kvantifisering med høy gjennomstrømning evner i både antall prøver og antall mål. I tillegg gir denne bibliotek generering med transposome-mediert tagmentation krever mindre inngangs DNA, er raskere og inneholder færre trinn enn tradisjonelle skjær og påfølgende adapterligeringsteknikker. Disse forbedringer over eksisterende metoder tillater presis bass-nivå DNA metylering analyse av noen mål av interesse. Dessuten gir BSAS en ny metode for bekreftelse av regioner av interesse (differensielt metylering regioner (DMRs), CpG øyer, regulatoriske regioner) som har blitt identifisert ved hjelp av hele genomet bisulfitt 22 eller fange 23 tilnærminger. Ved hjelp av ortogonale bekreftelse tilnærminger og mer kvantitativt presise metoder forbedrer analytisk rigor av epigenomic studier. Den høye lese dybde oppnås med BSAS åpner for nøyaktig kvantifisering i en smal konfidensintervall, reværender i presis kvantifisering 16. I tillegg kan evnen til å kjøre mange prøver i et enkelt eksperiment øke utvalgsstørrelsen for bekreftelser av hele genomet metoder, som vil øke den statistiske styrken; en svakhet ved mange av dagens epigenetiske studier. Viktigere, gir BSAS en base spesifikke CpG metylering kvantifisering, som gir mulighet for generering av testbare hypoteser for epigenetisk forskning. Hypoteser som økt metylering ved en bestemt responselement vil resultere i minsket binding av et spesifikt transkripsjonsfaktor. BSAS, kombinert med sammenkoblede mRNA-ekspresjon data, tilveiebringer en fremgangsmåte for å oppnå både epigenetisk regulering og mRNA-ekspresjon i et enkelt stykke vev eller cellepopulasjon. Sammenkoblede målinger av regulering og uttrykk også øke den vitenskapelige rigor og virkningen av funnene.
Kritiske trinn innenfor BSAS protokollen inkluderer primer design, amplicon optimalisering, og bibliotek generasjon /QC. PCR skjevhet introduseres hvis primere ikke er utformet på riktig måte og forsterke på ulike effektivitet 8. Bruken av metylering standarder, for eksempel enzymatisk generert 100% og 0% cytosin denaturert standarder, kan anvendes for å bestemme grad, om noen, av metylering kvantifisering forspenning, og det er en skikkelig metodekontroll ved kvantifisering av 16 metylering. Likeledes bør man være forsiktig når optimalisere PCR reaksjoner for å generere en enkelt høy kvalitet amplicon. Hvis ingen amplicon er til stede ved bruk av de foreslåtte retningslinjene beskrevet i protokollen, optimalisering skritt inkluderer økende PCR syklus tall eller bsDNA innspill beløp. Hvis det er flere PCR-produkter, inkludert primer-dimerer, optimaliseringstrinn omfatter avtagende bsDNA inngangs beløp, redusere den PCR-primer molare inngangs konsentrasjoner, øker varmebehandlingstemperaturer, eller redusere PCR-syklusnummer. En eller en kombinasjon av disse optimaliseringsprosedyrer gir tilstrekkelige resultater for å generere en enkelt high-kvalitet amplicon. Alternativt omstrukturere primere er en god tilnærming for primersettene som ikke gir en eneste amplicon. For de regionene der redesign er ikke egnet eller mulig, utarte primersettene inkludert både cytosin og tymin er på CpG områder i termin primere og adenin-tallet og guanin er på CpG steder i revers primere kan fungere. Men disse primersettene trenger ytterligere optimalisering for å sikre at ikke noe PCR skjevhet oppstår, en prosess utenfor omfanget av denne protokoll. Kvalitet biblioteker er svært viktig for å lykkes. Sikre at QC tiltak gjennomføres for å bestemme størrelse, kvalitet og kvantitet av biblioteker før sekvensering. Sekvenseringsreaksjoner er utsatt for svikt med input av lav kvalitet-biblioteker. Skjevhet i metylering kvantifisering kan reduseres ved å sikre at metylering frekvenser er til stede i både forover og bakover sekvense leser. I tillegg bør kvalitetspoeng av baser samkjøre til CpG områder være ≥Q30 for høy confidence i kvantifisering. Mens andre har vist tidligere lite til ingen skjevhet i tagmentation reaksjoner av bisulfite konverterte DNA 19, som sikrer de beregninger som er beskrevet ovenfor åpner for bekreftelse av lav skjevhet metylering kvantifisering.
BSAS måler tiden metylering på CpG områder vil imidlertid fremtidige utvidelser av denne metoden tillater målinger av parede CpG 5-HMC med tillegg av eksperimentelle fremgangsmåten for å skjelne mellom fem-mC og 5-HMC for eksempel innføring av kalium-perrutenat før bisulfitt omdannelse 24. Dette vil øke effekten av BSAS verktøyet ved å tillate for paret metylering, både 5-MC og 5-HMC, og uttrykk data for å bestemme genuttrykk regulatoriske roller DNA metylering. Transposome-mediert bibliotek fremstilling av PCR-amplikoner resulterer i redusert sekvense dybde ved endene av amplifiserte områder. Derfor bør regioner av høy interesse være utformet for å ligge i midten av amplikoner. Hvordangang, fordi BSAS genererer sekvense les dybder på> 1000 X, kvantitativ nøyaktighet på 5-mC målinger i nærheten av endene av amplifiserte områder forblir høy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
| Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
| Agencourt AMPure XP - PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 ml |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
| twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
| Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
| Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
| Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
| 0.1-10 μl Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
| 2-200 μl Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
| 50-1,000 μl Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
| MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
| 2.0 ml Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300 cycles |
| KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
| ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
| Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
| Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5x (1 L) |
| Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5x (10 ml) |
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
| UltraPure 10 mg/ml Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384-well block |
| DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
| SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
| QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
| TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
| Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
| TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| 384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
| Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
| EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
| ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |
References
- Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & Development. 16 (1), 6-21 (2002).
- Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
- Heard, E., Martienssen, R. A. Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms. Cell. 157 (1), 95-109 (2014).
- Baylin, S. B. DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice. Oncology. 2, Suppl 1. S4-S11 (2005).
- Baylin, S. B. The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).
- Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).
- Mikeska, T., et al. Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis. The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).
- Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In. Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).
- Dikow, N., et al. Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA. Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).
- Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues. Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).
- Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method. Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).
- Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine. Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).
- Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues. Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).
- Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing. Epigenetics & Chromatin. 6 (1), 33 (2013).
- Caruccio, N. Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition. Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Adey, A., Shendure, J. U. ltra-low-input tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing. Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).
- Smallwood, S. A., et al. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).
- Wang, J., et al. Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation. Plant Methods. 7, 39 (2011).
- Lister, R., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Ivanov, M., et al. In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes. Nucleic Acids Research. 41 (6), e72 (2013).
- Booth, M. J., et al. Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).
