Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Riktade DNA-metylering analys av Nästa generations sekvense

Published: February 24, 2015 doi: 10.3791/52488

Introduction

Det har gått över ett halvsekel sedan den första rapporten av naturligt förekommande DNA modifieringar i form av cytosin metylering 1. Cytosine metylering är en modifierad cytosin nukleotid bas där den 5: e kolet på basen ringen har en metylgrupp (5-MC), vanligast förekommande i CpG dinukleotiden motiv i däggdjursgenom. Den funktionella närvaro av 5-MC i genpromotorer förknippas i allmänhet med transkriptions förtryck, medan frånvaron är associerad med transkriptionsaktivitet 2.

Enorma framsteg har gjorts i vår förståelse av den roll som DNA-metylering i utveckling 3, transgeneration förökning av epigenetiska profiler 4, cancer patogenes 5,6, och ett antal andra forskningsområden. Många av dessa framsteg har kommit under de senaste åren som nya metoder har utvecklats för att profilera DNA-metylering 7. Med tillkomsten ochpopularisering av nästa generations sekvensering (NGS) tekniker finns det nu ett antal metoder för att profilera DNA-metylering över en hela genomet eller stora regioner i ett genom 8. Dessa tillvägagångssätt öppnar möjligheten till upptäckts studier som kvantifierar DNA metyleringsmönster och skillnader i DNA-metylering. Utöver dessa hypotesgenere metoder, det finns ett stort behov av riktade / hypotestestning DNA metylering kvantifiering metoder.

Pyrosequencing, metylering specifik PCR, och direkt Sanger-sekvensering av bisulfit konverterade DNA har varit de mest använda metoderna för analys av riktade områden (dvs, en promotorregion av en enda gen eller en CpG ö) 9-12. Alla dessa metoder är beroende av bisulfit konvertering, en kemisk deaminering reaktion där ometylerade cytosin s omvandlas till uracil-talet, medan metylerade cytosin s förbli intakt 13,14. PCR-amplifiering av bisulfite-konverterade DNA-resultat i ersättning av uracil-talet med tymin 15 medger differential metylering att läsa ut som en bas skillnad. Medan mycket användbart, de begränsningar i dessa metoder är låg kvantitativ exakthet, kort läslängd, och låg provkapacitet. För att lösa dessa begränsningar vi utvecklat en metod som vi har kallat Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS) 16. Målet med denna metod är att kunna analysera målgruppiska regioner av intresse i ett stort antal prover med höga kvantitativ noggrannhet.

BSAS använder delar av befintliga metoder (bisulfite konvertering och regionspecifika PCR-amplifiering) och kombinerar dem med enkla nästa generations bibliotekskonstruktion (transposome-medierad) 17 och bänk NGS 18 (Figur 1). Denna metod ger en mer kvantitativ och högre genomströmning metod för att undersöka cytosin metylering i någon region av intresse. Här presenterar vimetod i detalj och beskriva metoder för felsökning och kvalitet kontrollera BSAS processen.

Protocol

1. nukleinsyraisolering från Tissue

OBS: Co-isolering av DNA och RNA från samma vävnadsprov ger möjlighet att samla DNA för epigenetisk analys och parade RNA för genuttryck analys. Exemplet som ges här är en form av kolonnrening från experimentell vävnad men alternativa metoder för olika provtyper eller andra isoleringsmetoder kan användas. Det primära kravet är för högt renad nukleinsyra utan att förorena protein eller organiska lösningsmedel.

  1. Välj en bit färskfryst eller färsk vävnad för mekanisk homogenisering och placera på is. Store eller överföringsvävnaden till en 2,0 ml rundbottnad mikrocentrifugrör.
  2. Lägg en 5 mm rostfri pärla till varje rör innehåller vävnad. Lägg en lämplig mängd lysbuffert, baserat på tillverkarens förslag av cellantalet eller vävnadsvikt.
  3. Homogeni vävnaden med hjälp av en kulkvarn mekanisk homogenisering på30 Hz för 30 sek.
    OBS: Frekvensen och varaktigheten av mekanisk homogenisering är beroende av vävnadstyp. Mjukare vävnader kommer helt homogenisera med hjälp av de rekommenderade inställningarna, medan tuffare vävnader kräver inställning optimering.
  4. Utför DNA och RNA-isolering med användning av silika spinnkolonner vid rumstemperatur efter tillverkarens protokoll.
    1. Eluera RNA i 50 pl RNas-fritt vatten och lägg på is. Använd RNA för mRNA expressionsanalys av qPCR.
    2. Eluera DNA i 100 pl TE-buffert. Upprepa eluering off DNA-kolonn med användning eluenten att öka DNA-koncentration och avkastning. Använd DNA för målinriktad metylering kvantifiering.
  5. Bedöma kvaliteten på DNA och RNA med en vanlig spektrofotometer för absorbans vid 230 nm, 260 nm, 280 nm och 320 nm.
    OBS: A260 / A280 förhållandet skall vara ~ 1,8-2 för hög kvalitet DNA. A260 / A280 förhållandet skall vara ~ 2 för hög kvalitet RNA. Närvaron av överskott av absorbans vid 230 nm indicrar föroreningar från isoleringsförfarandet.
  6. Kvalitet kontrollera RNA ytterligare genom att använda en kapillär elektrofores Chips enligt tillverkarens instruktioner.
    OBS: Hög kvalitet RNA kommer att ha ett RNA integritet nummer (RIN)> 8. Förekomsten av extra toppar i electropherogram förutom rRNA toppar indikerar provkontaminering.
  7. Kvantifiera DNA och RNA genom fluorescenstest enligt tillverkarens protokoll.
    OBS: Om du använder en fluorometrisk analys är känsligare och mer specifik för att kvantifiera nukleinsyror än spektrofotometri ensam.
  8. Store isolerade DNA och RNA vid -80 ° C.

2. Mål Identifiering och Primer Design

  1. Bestäm iska regionen (er) av intresse för att analyseras av BSAS baserat på lämplig referensarvsmassa. Genpromotorer av differentiellt uttryckta gener är vanliga måltavlor för metylering kvantifiering.
  2. Förbered en in silico bisulfite-converted referens genomet för senare anpassning av sekvense läser genom att förändra .fasta sekvens filen i en textredigerare. I 5'-3 'orientering, byt icke-CpG cytosin talet med tymin s (Figur 2).
  3. Design primer sätter att förstärka områden av intresse från bisulfit konverterade DNA.
    1. Välj och kopiera oomvända regionen av intresse, i 5'-3 'orientering, i en bisulfit-specifik PCR primer designprogram (Figur 3).
      OBS: En optimal bisulfite-PCR amplikon längd är 250-400 bp per amplikon som bisulfit behandlingsfragment DNA och det är svårt att förstärka stora> 400 regioner bp. Om, till exempel, är av intresse en region av en kb, kan multipla primerpar vara utformade för att täcka detta område. Design amplikonema vara lika bp storlek för enkel sammanslagning. Undvik amplikon längder <250 bp eftersom dessa kan vara otillräcklig längd för biblioteks generation. En optimal primerlängden för BSAS är>20 bp per grundfärg.
    2. Välj ett Tm intervallet 55-65 ° C och en max Tm skillnad mellan framåt- och bakåtriktade primrar av 1-2 ° C.
    3. Välj primerpar som bäst täcker regionen av intresse. Välj inte primers som innehåller CpG webbplatser eller är i direkt anslutning till CpG platser, eftersom detta kommer att orsaka bias i PCR-reaktionerna. Använd standard PCR-primers som kan beställas från någon antal akademiska eller kommersiella leverantörer.
    4. Lös frystorkade primers i RNas / DNas fritt vatten vid en arbets lager av 100 iM.
  4. Förvara PCR-primers vid -20 ° C. Späd 100 iM primer lager till 10 ^ M arbetar lager för PCR-reaktioner.

3. bisulfit Specifik PCR Optimering

OBS: För bisulfit omvandling av genomiskt DNA, ett antal olika kommersiella kit för bisulfit omvandling finns. Välj kit eller protokoll som bäst passar den planerade experimentet.

<ol>
  • Använd mellan 200 ng till 2 pg av genomiskt DNA. För optimeringsexperiment, köra flera omvandlingsreaktioner för att ha tillräcklig bisulfit konverterade DNA för flera BS PCR-reaktioner.
  • Använd små (t.ex. 10 pl) elutionsvolymerna för bisulfit konverterade DNA för att upprätthålla höga DNA-koncentrationer.
    OBS: 1-2 pl bisulfit konverterade DNA är tillräcklig för optimering PCR-reaktioner om 1 ug iskt DNA användes för konvertering ingång.
  • Amplify bisulfit konverterade DNA genom bisulfit specifik PCR. BS-PCR-reaktioner kräver hjälp av en Taq-polymeras som kan förstärka bisulfit konverterade DNA.
    1. Montera följande reaktion för målamplifiering optimering av en enda amplikon. För flera prover, montera reaktioner i en 96-brunnars PCR-platta.
      25 pl 2x reaktionsbuffert
      0,5 pl dNTP-blandning
      5 pl 10 pM Forward Primer (Slutlig 1 pM)
      5 pl 10 pM Reverse Primer(Slutlig 1 pM)
      2 pl mall bisulfit konverterade DNA
      0,4 | il (5 U / ul) DNA-polymeras
      12,1 l DNas fritt vatten (Final reaktionsvolym 50 l)
    2. Täta PCR plattan med lämpligt lim eller värmeförseglad film.
    3. Placera reaktion i en lämplig termocyklern och använda följande cykelförhållanden med en uppvärmd lock:
      1. Utför en initial denaturering vid 95 ° C i 10 min.
      2. Denaturera vid 95 ° C under 30 sek.
      3. Anneal under 30 sekunder vid varje enskild Tm av primers som används. Start vid en glödgningstemperatur några ° C under Tm av primern för optimeringsreaktioner.
        OBS: Bästa glödgningstemperaturer kan också bestämmas med hjälp av en gradient termocykler för att testa olika temperaturer.
      4. Utför en förlängning vid 72 ° C under 30 sek. Förläng förlängningstiden för längre amplikoner.
      5. Upprepa steg 3.3.3.2-3.3.3.4 för 35 cykler tilltal för inledande optimering. Högre cykelnummer kan vara nödvändigt men bör generellt undvikas för att förhindra klon förstärkningar som kommer att skapa reaktions artefakter.
      6. Utför en slutlig förlängning vid 72 ° C under 7 min.
      7. Håll reaktioner vid 4 ° C.
    4. Visualisera amplikoner efter PAGE elektrofores. Alternativt kan du använda en kapillär elektrofores DNA-chip enligt tillverkarens protokoll.
      1. Blanda 24 pl av PCR-reaktionen med 6 | il 5x laddningsfärg på is och skaka.
      2. Gör 1 liter 1x TBE löpbuffert genom att blanda 200 ml 5x TBE löpande buffert och 800 ml DDH 2 O. Späd DNA-stege för en slutlig koncentration av 0,5 pg per brunn i DDH 2 O och laddningsfärg.
      3. Last brunnar med 30 pl PCR-reaktioner eller stege.
      4. Kör gelen vid 200 V under ~ 45 minuter. Stoppa gelen springa när den första färgfronten når slutet av gelen.
      5. Fläck gelén med 5 | ig / mletidiumbromid genom att blanda 5 ìl av 10 mg / ml i 100 ml DDH 2 O. Täck hela gelén och låt inkubera i ~ 5 min.
      6. Bild gelen via en UV-ljuslåda eller multimodal kameran vid en excitationsvåglängd av 482 nm.
      7. Med hänvisning till stegen, storlek PCR amplikoner och avgöra specificitet reaktionen genom att leta efter andra än den förväntade produkten storleken flera band (Figur 4A och C).
    5. När optimala förutsättningar för BS-PCR har bestämts, utför BS-PCR på experimentella prover.
      1. Rena amplikoner från kvarvarande primers och andra reaktionskomponenter. Utför kiseldioxidkolonn rening, SPRI pärla, eller gel-baserade sanering och kvantifiering.
      2. Eluera amplikoner i 30 pl TE-buffert.
      3. Kvantifiera amplikoner använder fluorometrisk analys med hjälp tillverkarens protokoll.
      4. Om det finns flera amplikoner per prov, pool dem lika vikt per volymbelopp och förvara vid -20 ° C.
  • 4. NGS Bibliotek Förberedelser och biblioteks QC

    OBS: BSAS NGS bibliotek beredningen använder en förenklad transposome medierad protokoll med dubbla indexering (se Material Lista för information om biblioteksförberedande kit val). Denna metod ger en extremt snabb och hög genomströmning rutt för biblioteks konstruktion som har validerats och visar liten eller ingen bias i bisulfit sekvenseapplikationer 16,19. Dual-indexering möjliggör en högre multiplexering av prover än enstaka indexering. Andra biblioteksberednings stilar kan vara möjliga men har inte testats.

    1. Förbered NGS bibliotek från BS PCR amplikoner i en 96-brunnars PCR-platta. Späd amplikoner till 0,2 ng / l för en slutlig ingång massa av 1 ng, eller 5 ìl av 0,2 ng / l utspädning. Utför en sanering av genererade biblioteken använder SPRI pärlor. Använd 50-90 il SPRI pärlor för isolering bibliotek wed detta protokoll. Volymen av SPRI pärlor beror på målet storlek bibliotek och cykel antal önskade sekvenseringsreaktioner.
      OBS: Använd en mikro shaker eller platt vortexer att resuspendera pärlor.
      1. Eluera biblioteken utanför pärlorna och överför till en ny 96-brunnar och täta med värmeförsegling film för förvaring vid -20 ° C.
    2. Bestämma storlek och koncentration av bibliotek (fig 4B och D).
      1. Kör bibliotek på ett kapillärelektrofores-DNA limnings Chips enligt tillverkarens protokoll.
        1. Använd en hög känslighet kapillärelektrofores DNA-analys för att bestämma den genomsnittliga storleken på detekterade bibliotekstoppar och en uppskattning av molaritet enligt tillverkarens protokoll.
      2. Kvantifiera bibliotek med qPCR, använder primers utformade mot adaptersekvenserna i de genererade bibliotek och använda standarder med en känd koncentration.
        1. Kör qPCR reåtgärder på en realtidsinstrument som använder de absoluta kvantifiering inställningarna enligt tillverkarens protokoll.
        2. Använd storlek biblioteken och molar kvantifiering från qPCR att beräkna molära koncentrationerna av biblioteken.
    3. Späd bibliotek till 4 nM med användning av 10 mM Tris-Cl med 0,1% Tween-20 vid pH 8,5. Förvara bibliotek i en 96-brunnars PCR-platta förseglas med värmeförseglingsfilm vid -20 ° C.

    5. Sekvense Bibliotek Använda en Benchtop Sequencer

    1. Tina upp och förbereda reagenser enligt tillverkarens anvisningar.
    2. Tina 4 Nm bibliotek på is.
    3. Gör en ml av 0,2 N NaOH i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    4. Pool 4 nM biblioteken i lika volym mängder, om flera bibliotek ska användas.
    5. Späd och denaturera poolade biblioteken enligt tillverkarens instruktioner till den önskade slut molkoncentration.
      1. Håll utspätt och denaturerapoolade biblioteket på is tills den ska laddas på reagenskassett.
    6. Generera en provblad som innehåller provnamn och motsvarande indexinformation och ange att endast generera .fastq filer.
      1. Lastprovarket i motsvarande mapp provarket på sequencern.
    7. Lägg totalt 600 pl utspätt och denaturerad bibliotek till reagenspatronen i motsvarande brunn.
    8. Kör sekvense reaktioner på färdigställande.

    6. Metylering Kvantifiering Data Analysis

    OBS: Det finns flera program tillgängliga för NGS dataanalys inkluderande både kommersiell och öppen källkod. Detaljer om program som körs kan hittas med varje specifikt paket. Allmänna instruktioner ges vid varje steg tillsammans med de särskilda kommandon för detta programpaket. (Se Materiallista för information om programvara som används i detta protokoll).

    1. Importera .fastq.gz filer till lämpligt sequencing analys pipeline behålla kvalitetsresultat (Qscores) för användning i läsning trimning. (I det här exemplet programmet välja 'Importera' och välj sekvenseringsmetod som används för att generera läser. Välj .fastq.gz läsa filer att importera, och behålla Qscores från .fastq filer för läsning trimning applikationer genom att avmarkera "göra kvalitetsresultat" under "Allmänt Alternativ ". Välj en plats för den importerade läser och välj" Slutför ".)
      1. Trim och behålla läser använder följande inställningar i en NGS dataanalys pipeline. (För det här programmet väljer "Trim Sekvenser" under "NGS Kärn Verktyg" och välj läser ska trimmas.)
        1. Behåll bara läser innehåller ≥ Q30 poäng. (För det här programmet välja 'Trim använder kvalitetsresultat "och sätta gränsen till 0,001.)
        2. Behåll bara läser innehåller ≤ 1 tvetydiga nukleotid. (För det här programmet väljer "Trim tvetydiga nukleotider" och ställ in"Maximalt antal tvetydigheter" till 1. Välj en plats att spara trimmas läser och välj "Slutför".)
      2. Karta trimmas läser den in silico bisulfit konverterade gen referens från 2,2. (För exemplet programvaran väljer 'Karta Läser till Referens "under" NGS kärn Tools. Välj trimmas läser kartläggas och välj "nästa". Välj den konverterade referenssekvensen och välj "nej maskering" under "referens maskering". Välj " Nästa ".)
        1. Tilldela ett maximistraff för obalanser, insättningar och borttagningar. Ställ in parametrar så att 100% av den lästa längden krävs att kart med 90% sekvensidentitet. Till exempel programvara, tilldela en poäng av 3 för felpassningar, insättningar och borttagningar. Tilldela ett resultat på 1 för minimal bråkdel av läslängd mappas till referens, och tilldela en poäng på 0,9 för minimal bråkdel av identitet mellan kartlagt läsa och referens.
        2. För uppriktning utgång genererar varje prov som en oberoende fil. Till exempel mjukvara, välj "Skapa fristående läsa mapp" under "Output alternativ" och "Spara" under "Resultat hantering". Välj en plats att spara den lästa kartläggning och välj "Slutför".
      3. Kör en variant kallar arbetsflöde på mappade läser. För exemplet mjukvara, välj "Probabilistisk Variant Detection" under "återsekvenseringsanalys", välj lästa kartläggning som ska analyseras och välj "nästa". Välj "Ignorera ospecifika matcher" under "Läs filter" och välj "nästa".
        1. Kontrollera att sekvensen är vid en depe ≥ 1000 X genom att ställa in "minsta täckning" under "Betydelse" till 1.000.
        2. Se till att varianten samtalet är närvarande i både framåt och bakåt läser. Till exempel mjukvara, välj "Kräv närvaro i både framåt och bakåt står" under "Variant filter" och välj "nästa".
        3. Export linje, kallas varianten uppgifter som en kommenterad bord. Till exempel mjukvara, välj "Skapa kommenterad bord" under "Output options 'och välj en plats att spara varianten tabellen filen. Välj "Slutför".
    2. Beräkna 5-MC procentsats använder variant frekvenser vid kommenterade CpG platser i regionen av intresse från varianten tabellen filen. Frekvensen av cytosin vid en referens C i CG är den 5-mC procentsats.
      OBS: När du använder variant ringer algoritmer för högt metylerade CpG s, byt CpG cytosiner med thymines. Detta kommer att identify den mappade cytosin s som varianter, vilket resulterar i cytosin frekvens CpG s.
    3. Bestäm bisulfite verkningsgrad (BSC) genom att först beräkna andelen C är inte i CpG platser i referens (C). Multiplicera andelen icke CpG C talet av antalet totala T: s mappas (T mp), och dividera med totalt C: s mappas vid referens T: s (C MPT). 100 minus frekvens fram är den bisulfite omvandlingseffektivitet (BSC) i det biblioteket (ekvation 1).

    Ekvation 1

    Ekvation 1. Bisulfite verkningsgrad.
    OBS: Även däggdjurs genomen innehåller mycket små mängder av icke-CpG cytosin metylering (med undantag eventuellt av stamceller 20), växt genomen innehåller en betydande mängd. För att bestämma effektiviteten bisulfite omvandling i dessa reference-genom, är en lämplig väg att sekvensera en del av den mitokondriella genomet eller kloroplast genomet eller kända ometylerade gener som finns i växtgenom 21 och beräkna verkningsgrad som beskrivs ovan. Effektivitet bisulfite omvandling bör vara ≥98% i de flesta fall, med oomvända C: s potentiellt härrör från icke CpG metylering.

    Representative Results

    BSAS läser korrekt inriktad på konverterade referenssekvensen kommer att likna Figur 5. CpG dinukleotider kan tydligt identifieras och metylering stater kan uppskattas genom att observera bas samtal på CpG platser i den mappade läser. Till exempel, med metylering kontroller, kommer 0% metylering resultera i alla läsningar mappas till CpG sites containing T: s (figur 5A). 100% metylering kontroller kommer att resultera i alla läser mappade läser till CpG webbplatser som innehåller C: s (figur 5B).

    Kvantifiering av cytosin frekvens (C / C + T) vid CpG platser ger den metylering frekvensen i det ursprungliga provet. En representativ standardkurva genereras från hela genomet metylering kontroller (n = 3 / metylering ratio) visar linearitet metylering kvantifiering samt precision i kvantifiering vid varje metylering förhållande (Figur 6). Som ett exempel på denna metod totalt, RNA och DNA sam-iso ler från mus cerebellum och näthinnan (n = 4 / grupp). Rodopsin uttryck, selektivt uttryckt i näthinnevävnad, mättes med hjälp av qPCR. Uttryckning detekterades endast i näthinnan (figur 7A). Använda BSAS var CpG metylering nivåer kvantifieras i rodopsin promotorregionen. Ackumulerade metylering nivåer över promotorregionen var> 80% i lillhjärnan jämfört med <15% i näthinnan (p <0,001, parametrisk t-test) (Figur 7B). BSA metylering kvantifiering nytta av platsspecifik metylering kvantifiering och metylering nivåer kan jämföras på ett CpG specifikt över varje given iska region. CpG metylering nivåer över hela rodopsin promotorn var påtagligt högre i cerebellära prover jämfört med näthinnan prover (p <0,001, parametrisk t-test vid varje CpG plats) (Figur 7C).

    1highres.jpg "/>
    Figur 1:. Schematisk bild av BSAS metod I denna metod är iskt DNA bisulfite konverterade att modifiera unmethylation cytosiner till uraciler. Därefter under PCR dessa uraciler ändras till thymines. PCR-amplifiering riktas mot områden av intresse och mycket berikar för just dessa sekvenser. De resulterande PCR amplicons görs till dubbla-indexe bibliotek genom en enkel tagmentation process. Därefter biblioteken sekvens på en bänk nästa generations sekvense och sekvense läser mappas till in silico konverterade referenssekvens och procent metylering av cytosin s bestäms i en bas-specifikt sätt.

    Figur 2
    Figur 2:. I silico bisulfite konvertering av regionen av intresse Alla regionen av intresse från någon genomisk hänvisning kan vara selected för in silico bisulfite konvertering. Icke-CpG-cytosiner ersätts med tymin s i referenssekvensen. CpG cytosiner kvar cytosiner i bisulfit konverterade referens.

    Figur 3
    Figur 3:. Primer placering Bisulfite PCR-primers är utformade mot en in silico-sulfit konverterade referenssekvens. Primers ska utformas så att de inte överlappar CG dinukleotider eller utformade intill CG dinukleotider.

    Figur 4
    Figur 4: Exempel på hög och dålig kvalitet PCR amplikoner och sekvensebibliotek Representativa electropherogram spår och gel show (A) perfekt amplicon för transposome medierad bibliotek generation med en enda hög.produktkoncentration. (B) Biblioteket alstras från denna amplikon visar hög koncentration och även storleksfördelning. (C) Dålig kvalitet PCR-amplikoner kan vara låg i storlek, koncentration, och innehåller flera produkter och / eller primerdimerer. Dessa dåliga amplicons kommer att leda till (D) misslyckades biblioteks generation med låg koncentration och distribution låg storlek.

    Figur 5
    Figur 5: Exempel på sekvense utgångar från metylering kontroller. (A) I silico konverterade referenssekvense med CpG platser markerade i rött. 0% metylering kontroll mappas läser för det valda området visar thymines (girighet markera) kartläggning vid CpG platser. (B) 100% metylering kontroll mappas läser visa cytosin s (blå markering) kartläggning vid CpG platser.


    Figur 6:. Metylering kvantifiering inom en rad olika metylering kontroller hela genom metylering kontroller blandas vid metylering nyckeltal (n = 3 / ratio) från 0% till 100% var kvantifieras med hjälp BSAS. Plotta kvantifiering av förväntade kontra kvantifierade demonstrerar linearitet metylering kontroll kvantifiering. Över alla kontroller, det var hög precision i metylering kvantifiering.

    Figur 7
    Figur 7: Exempel på parade DNA-metylering och genuttrycksanalys från vävnadsprover. (A) Rhodopsin relativ mRNA-uttryck från mus cerebellär och näthinnevävnad. (B) Rhodopsin genomsnittlig promotor metylering kvantifieras genom BSAS mellan cerebellär och retinal DNA (*** p <0,001, parametrisk t-test). <strong> C) CpG platsspecifika metylering nivåer över rodopsin promotor (-244 till +6, i förhållande till transkriptionsstartstället [TSS]) i mus lillhjärnan och näthinnan DNA.

    Discussion

    BSAS möjliggör fokuserad, noggrann DNA-metylering kvantifiering med hög genomströmning kapacitet i både antal prover och antal mål. Dessutom detta bibliotek generation använder transposome-medierad tagmentation kräver mindre input DNA, är snabbare och innehåller färre steg än traditionell kapning och efterföljande adapter ligeringstekniker. Dessa förbättringar jämfört med befintliga metoder möjliggör exakt bas-nivå DNA-metylering analys av eventuella mål av intresse. Dessutom ger BSAS en ny metod för bekräftelse av regioner av intresse (differentiellt metylering regioner (DMRs), CpG-öar, regulatoriska regioner) som har identifierats med hjälp av hela genomet bisulfit 22 eller fånga 23 tillvägagångssätt. Använda ortogonala bekräftelse metoder och mer kvantitativt exakta metoder förbättrar analytiska stringens av epigenomiska studier. Den höga lästa djupet uppnås med BSAS tillåter en exakt kvantifiering i en smal konfidensintervall, reha hört i exakt kvantifiering 16. Dessutom kan möjligheten att köra många prover i ett enda experiment öka provstorleken för bekräftelser av hela genomet metoder, vilket kommer att öka den statistiska kraften; en svaghet i många nuvarande epigenetiska studier. Viktigt ger BSAS en bas specifik CpG metylering kvantifiering, vilket möjliggör generering av testbara hypoteser för epigenetisk forskning. Hypoteser som ökad metylering vid en specifik svarselement kommer att resultera i minskad bindning av en specifik transkriptionsfaktor. BSAS, kombinerat med parade mRNA expressionsdata, ger en metod för att erhålla både epigenetisk reglering och mRNA uttryck i en enda bit vävnad eller cellpopulation. Kopplade mätningar av reglering och uttryck ökar också den vetenskapliga stringens och effekterna av resultaten.

    Kritiska steg inom BSAS protokollet inkluderar primer design, amplikon optimering och bibliotek generation /QC. PCR partiskhet införs om primers inte är utformade på rätt sätt och förstärker på olika effektivitet 8. Användningen av metylering standarder, såsom enzymatiskt genererade 100% och 0% cytosin metylerade standarder, kan användas för att bestämma graden, om någon, av metylering kvantifiering partiskhet, och är en riktig metod kontroll vid kvantifiering metylering 16. På samma sätt bör man vara försiktig när man optimerar PCR-reaktioner för att generera en enda hög kvalitet amplicon. Om ingen amplikon är närvarande med hjälp av de föreslagna riktlinjerna anges i protokollet, optimeringssteg inkluderar ökande PCR cykelnummer eller bsDNA ingångsbelopp. Om det finns flera PCR-produkter, inklusive primerdimerer, optimeringssteg inkluderar minskande bsDNA ingångsbelopp, minskar de PCR primer molära inmatningskoncentrationer, ökar glödgningstemperaturer, eller minska PCR-cykel nummer. Ett eller en kombination av dessa optimeringsförfaranden ger tillräckliga resultat för att generera en enda high-kvalitet amplicon. Alternativt omkonstruktion primers är en bra metod för primeruppsättningar som inte ger en enda amplikon. För de regioner där redesign är inte lämpligt eller möjligt, degenererade primeruppsättningar inklusive både cytosin s och tymin s vid CpG platser i termins primers och adenin-talet och guanin-talet på CpG platser i omvända primers kan fungera. Men dessa primeruppsättningar behöver ytterligare optimering för att säkerställa att ingen PCR partiskhet sker, en process som inte omfattas av detta protokoll. Bibliotek Kvalitet är oerhört viktigt för att lyckas. Se till att QC åtgärder genomförs för att bestämma storlek, kvalitet och kvantitet av biblioteken innan sekvensering. Sekvenseringsreaktioner är benägna att misslyckas med inmatning av biblioteken låg kvalitet. Bias i metylering kvantifiering kan mildras genom att säkerställa att metylering frekvenser är närvarande i både framåt och bakåt sekvense läser. Dessutom bör tiotals baser inriktnings till CpG platser kvalitets vara ≥Q30 för hög confidence i kvantifiering. Medan andra har visat tidigare liten eller ingen bias i tagmentation reaktioner av bisulfit konverterade DNA 19, se till måtten ovan beskrivna medger bekräftelse av låga partiskhet metylering kvantifiering.

    BSAS mäter idag metylering vid CpG platser, dock kommer framtida utbyggnader av denna metod tillåter parade mätningar av CpG 5-HMC med tillägg av experimentella åtgärder skiljer mellan 5-MC och 5-HMC t.ex. införa kalium perrutenat innan bisulfite konvertering 24. Detta kommer att öka effekten av BSAS användbarhet genom att tillåta parade metylering, både 5-MC och 5-HMC och expressionsdata för att bestämma genuttryck reglerande roller DNA-metylering. Transposome-medierad bibliotek beredning av PCR amplikoner leder till minskad sekvensedjup i ändarna av förstärkta regioner. Därför bör regioner med hög ränta utformas för att bosätta sig i mitten av amplikoner. Hurnågonsin, eftersom BSAS genererar sekvense läste djup> 1,000 X, den kvantitativa noggrannhet på 5-MC mätningar nära ändarna av förstärkta regioner är fortsatt hög.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agilent 2100 Bioanlyzer Agilent G29393AA
    Agilent RNA 6000 Nano kit Agilent 5067-1511
    Agilent High Sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
    Typhoon 9200 Amersham/GE Healthcare Life Sciences
    Agencourt AMPure XP - PCR Purification Beckman Coulter A63880 5 ml
    PowerPac Basic Power Supply Bio Rad 164-5050
    twin.tech PCR plate 96  Eppendorf 951020362 semi-skirted
    Heatsealing Film Eppendorf 0030127838
    Heatsealing Foil Eppendorf 0030127854
    Heat Sealer Eppendorf 5390000.024
    0.1-10 μl Tips Eppendorf 0030073.002
    2-200 μl Tips Eppendorf 0030073.045
    50-1,000 μl Tips Eppendorf 0030073.100
    MixMate  Eppendorf 5353000.014
    1.5 ml Microcentrifuge Tubes Eppendorf 0030121.023
    Centrifuge 5424 Eppendorf 5424000.010
    2.0 ml Microcentrifuge Tube Eppendorf 022363352
    Nextera XT DNA Sample Preparation Kit Illumina FC-131-1024 24 rxn
    Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001 24 indexes
    MiSeq Desktop Sequencer Illumina
    MiSeq Reagent Kit v2 Illumina MS-102-2002 300 cycles
    KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit KAPA Biosystems KK4824
    Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit Life Technologies P7589
    Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit Life Technologies R11490
    ProFlex 96-well PCR system Life Technologies 4484075
    Novex 6% TBE DNA gel Life Technologies EC6261BOX 10-well
    Novex TBE Running Buffer Life Technologies LC6675 5x (1 L)
    Novex Hi-Density TBE Sample Buffer Life Technologies LC6678 5x (10 ml)
    1 Kb Plus DNA Ladder Life Technologies 10787-018
    Xcell SureLock Mini-Cell Life Technologies EI0001
    UltraPure 10 mg/ml Ethidium Bromide Life Technologies 15585-011
    7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001 384-well block
    DynaMag-96 Side Skirted Life Technologies 12027
    SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices/VWR 89429-532
    AllPrep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204
    Stainless Steel Beads Qiagen 69989 5 mm
    CLC Genomics Workbench Qiagen Software for methylation pipeline
    QIAQuick PCR Purification kit Qiagen 28104 50 rxn
    TissueLyser II Retsch/Qiagen 85300
    Nuclease-Free Water Sigma W4502
    TRIS hydrochloride Sigma PHG0002-100G
    Tween-20 Sigma P9416-50ML
    NanoDrop 2000 Thermo Scientific
    384-well Full-Skirted Plate, Standard Thermo Scientific AB-1384
    Absolute qPCR Seal Thermo Scientific AB-1170
    EZ DNA Methylation-Lightning kit Zymo Research D5030 50 rxn
    ZymoTaq DNA Polymerase Zymo Research E2001 50 rxn

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).
    2. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & Development. 16 (1), 6-21 (2002).
    3. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
    4. Heard, E., Martienssen, R. A. Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms. Cell. 157 (1), 95-109 (2014).
    5. Baylin, S. B. DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice. Oncology. 2, Suppl 1. S4-S11 (2005).
    6. Baylin, S. B. The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).
    7. Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).
    8. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).
    9. Mikeska, T., et al. Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis. The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).
    10. Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In. Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).
    11. Dikow, N., et al. Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA. Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).
    12. Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues. Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).
    13. Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method. Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).
    14. Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine. Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).
    15. Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues. Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).
    16. Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing. Epigenetics & Chromatin. 6 (1), 33 (2013).
    17. Caruccio, N. Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition. Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).
    18. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
    19. Adey, A., Shendure, J. U. ltra-low-input tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing. Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).
    20. Smallwood, S. A., et al. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).
    21. Wang, J., et al. Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation. Plant Methods. 7, 39 (2011).
    22. Lister, R., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
    23. Ivanov, M., et al. In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes. Nucleic Acids Research. 41 (6), e72 (2013).
    24. Booth, M. J., et al. Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).

    Tags

    Molecular Biology Epigenetik DNA-metylering nästa generations sekvensering bioinformatik genuttryck cytosin CpG genuttryck reglering
    Riktade DNA-metylering analys av Nästa generations sekvense
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Masser, D. R., Stanford, D. R.,More

    Masser, D. R., Stanford, D. R., Freeman, W. M. Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing. J. Vis. Exp. (96), e52488, doi:10.3791/52488 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter