Introduction
Bu doğal sitozin metilasyonu 1 şeklinde DNA değişiklikleri meydana gelen ilk rapordan bu yana yarım yüzyıl boyunca olmuştur. Sitozin metilasyonu taban halkası üzerinde 5 inci karbon bir metil grubu (5-mC), en sık memeli genomları CpG dinükleotid motifi meydana sahip bir modifiye sitozin nükleotid temelidir. yokluğu transkripsiyon aktivitesi 2 ile bağlantılı iken gen promoteri 5-Mc fonksiyonel mevcudiyeti genellikle, transkripsiyon baskı ile ilişkilidir.
Muazzam gelişmeler geliştirme 3 DNA metilasyon, epigenetik profiller 4, kanser patogenezi 5,6, ve diğer araştırma alanlarında sayısı transgeneration yayılma rolü anlayışımız yapılmıştır. Yeni yöntemler, DNA metilasyonu 7 profile geliştirilmiştir gibi bu ilerlemelerin çoğu son birkaç yıl içinde gelmiş. Gelişine veYeni nesil sekanslama (NGS) teknikleri yaygınlaşması hemen tüm genom ya da genom 8 geniş kısımlarının karşı DNA metilasyonu profil için bir dizi yöntem mevcuttur. Bu yaklaşımlar, DNA metilasyon desen ve DNA metilasyonu farklılıkları ölçmek keşif çalışmalarının olasılığını açın. Bu hipotez üreten yaklaşımlara ek olarak, hedef / hipotez testi DNA metilasyonu niceleme yöntemleri için önemli bir ihtiyaç vardır.
Pyrosequencing, metilasyon spesifik PCR ve bisülfit dönüştürülmüş DNA'nın doğrudan Sanger sıralama hedeflenen bölgelerin analizi için en çok kullanılan yöntemler olmuştur (yani, tek bir genin bir promotör bölgesi veya CpG ada) 9-12. Metillenmiş sitozin bozulmamış 13,14 devam ederken, bu yöntemlerin tümü, bisülfit dönüşümü, metillenmemiş sitozin en urasil en dönüştürülür kimyasal deaminasyon reaksiyona dayanır. Bisulfite- PCR amplifikasyonudiferansiyel metilasyonu temel farkı olarak okumak için izin timin 15 urasil yılların yerine dönüştürülmüş DNA sonuçları. Yüksek ölçüde yararlı ise de, bu yöntemlere sınırlamalar düşük sayısal hassasiyeti, kısa okuma süresi ve düşük numune sayısını içerir. Bu sınırlamaları gidermek için biz (BSAS) 16 bisülfit Amplikon Sıralama adlandırdığımız bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemin hedefi, yüksek sayısal hassasiyetle örneklerin çok sayıda ilgi konusu hedef genomik bölge analiz edebilmek için.
BSAS mevcut metodların elemanları (bisülfit dönüşümü ve bölgeye özgü PCR) kullanan ve basit nesil kütüphane yapısı (transposome aracılı) 17 ve tezgah üstü NGS 18 (Şekil 1) ile bir araya getirmektedir. Bu yaklaşım, söz konusu herhangi bir bölgede sitozin metilasyonu incelemek için daha nicel ve daha yüksek verimli bir yöntem temin etmektedir. Burada sunduğumuzdetaylı yöntem ve sorun giderme ve kalite BSAS sürecini kontrol etmek için yaklaşımlar tarif.
Protocol
Doku 1. Nükleik Asit İzolasyon
NOT: Aynı doku örneğinden DNA ve RNA'nın Eş-izolasyon gen ekspresyon analizi için epigenetik analiz için DNA ve RNA eşleştirilmiş toplamak için bir fırsat sunuyor. Burada verilen örnek kullanılabilecektir deneysel doku ancak farklı örnek tipleri veya başka bir izolasyon yöntemleri için alternatif yaklaşımlar sütun saflaştırma bir şeklidir. temel gereklilik proteini ya da organik çözücüler kirletmeden yüksek düzeyde saflaştırılmış bir nükleik asittir.
- Mekanik homojenizasyon için taze dondurulmuş ya da taze doku parçası seçin ve buz üzerinde yerleştirin. 2.0 ml yuvarlak alt mikrosantrifüj tüp saklayın veya aktarım dokusu.
- Doku içeren her bir tüpe, bir 5 mm paslanmaz çelik boncuk ekleyin. Hücre sayısı veya doku ağırlığı üreticinin önerileri doğrultusunda lizis tamponu uygun bir miktarda, ekleyin.
- Bir boncuk değirmeni mekanik homojenizasyon de kullanarak doku homojenize30 saniye için 30 Hz.
Not: frekans ve mekanik homojenleştirme süresi doku türüne bağımlıdır. Daha yumuşak dokular tamamen sert dokular optimizasyonu ayarlarken gerektiren ederken, önerilen ayarları kullanarak homojenize edecek. - Üreticinin protokolü takip edilerek, oda sıcaklığında, silika spin sütunları kullanılarak, DNA ve RNA izolasyonu yapınız.
- Buz üzerinde RNaz içermeyen su ve yerine 50 ul Zehir RNA. QPCR mRNA ifadesi analizi için RNA kullanın.
- TE tamponu, 100 | il DNA Zehir. DNA konsantrasyonu ve verimi artırmak için yıkama sıvısı kullanılarak DNA kolonu kapalı tekrarlayın elüsyon. Hedeflenen metilasyon miktar tayini için DNA kullanın.
- 230 nm, 260 nm, 280 nm ve 320 nm'deki soğurma gücü için standart bir spektrofotometre kullanılarak DNA ve RNA kalitesini değerlendirmek.
NOT: A260 / A280 oranı yüksek kalitede DNA ~ 1,8-2 olmalıdır. A260 / A280 oranı ~ 2 yüksek kaliteli RNA için olmalıdır. 230 mil Hint fazlalığı absorbans varlığıizolasyon prosedürü gelen ates kirleticiler. - Kalite, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir kılcal elektroforez fiş kullanılarak daha da RNA edin.
NOT: Yüksek kaliteli RNA RNA bütünlüğü numarası (RIN)> 8 olacak. rRNA zirveleri yanı sıra Elektroforegramda ekstra piklerin varlığı örnek kirlenmesini gösterir. - Üreticinin protokolüne uygun olarak floresan deneyi ile, DNA ve RNA ölçmek.
NOT: Bir florometrik testi kullanılarak tek başına spektrofotometre daha nükleik asitlerin miktarlarının daha duyarlı ve özgül olduğunu. - Mağaza -80 ° C 'de DNA ve RNA izole edilmiştir.
2. Hedef Belirleme ve Astar Tasarım
- Ilgili genomik bölge (ler) i belirlemek uygun referans genom sekansı üzerine oturtulmuş BSAS ile analiz edilmesi. Farklı şekilde ifade genlerin gen yükselticiler metilasyon kantitatif ortak hedefleridir.
- Siliko bisülfit-dönüştürmek bir hazırlayındizileme sonraki uyum için ed referans genom bir metin editörü .fasta dizisi dosyasını değiştirerek okur. 5'-3 'yönde, timin en (Şekil 2) ile CpG olmayan sitozin yer değiştirir.
- Tasarım astar bisülfit dönüştürülmüş DNA'dan ilgi bölgeleri yükseltmek için ayarlar.
- Seçin ve bir bisülfit spesifik PCR astar tasarım programı (Şekil 3) içine, 5'-3 'yönünde, ilgi dönüştürülmemiş bölgeyi kopyalayın.
Not: Optimal bisülfit-PCR amplikonu uzunluğu bisülfit ile muamele edilmesi fragmanları DNA olarak amplikon başına 250-400 bp ve 400> büyük bp bölgelerin yükseltilmesi için zordur. Örneğin, 1 kb'lik bir bölge ilgilenilen ise, birden fazla primer çiftleri bu bölgeyi kapsayacak şekilde tasarlanabilir. Tasarım amplikonlar kolay havuzu için eşit bp boyutta olması. Bu kitaplık üretimi için yeterli uzunluğa sahip olabilir, çünkü amplikon uzunlukları <250 bp kaçının. BSAS için optimal astar uzunluğu> olduğuAstar başına 20 bp. - İleri arasında, 55-65 ° C arasında bir Tm aralığı ve maksimum Tm farkını seçin ve 1-2 ° C arasında ters primerleri.
- En iyi ilgi bölgeyi kapsayacak primer çiftleri seçin. Bu PCR reaksiyonlarında önyargı neden olacağından, CpG siteleri içeren veya CpG sitelere doğrudan bitişik olan primerler seçmeyin. Akademik veya ticari herhangi bir sağlayıcıdan sipariş edilebilir standart PCR primerleri kullanın.
- 100 uM'lik bir çalışma stok RNas / DNase içermeyen su içinde liyofilize primerler sulandırın.
- Seçin ve bir bisülfit spesifik PCR astar tasarım programı (Şekil 3) içine, 5'-3 'yönünde, ilgi dönüştürülmemiş bölgeyi kopyalayın.
- -20 ° C'de saklayın PCR primerlerini gösterir. PCR reaksiyonları için stok çalışan 10 uM ila 100 uM primer stokunu.
3. bisülfit Özgül PCR Optimizasyonu
NOT: Genomik DNA'nın bisülfit dönüşümü için, bisülfit dönüşümü için farklı ticari kitler bir dizi mevcuttur. En iyi planlanmış deney uygun kiti veya protokolü seçin.
<ol>Not: 1 ug genomik DNA, dönüşüm girişi için kullanılıyorsa, bisülfitle dönüştürülmüş DNA'nın 1-2 ul optimizasyonu PCR reaksiyonları için yeterlidir.
- Tek bir amplikon hedef amplıfıkasyon optimizasyonu için aşağıdaki reaksiyon bir araya getirin. Birden çok numune için, bir 96-yuvalı PCR plaka reaksiyonları monte edin.
25 ul 2x reaksiyon tamponu
0.5 ul dNTP karışımı
5 ul 10 mcM İleri Astar (Final 1 uM)
5 ul 10 uM Ters Primer(Final 1 uM)
2 ul şablon bisülfit dönüştürülmüş DNA
0.4 ul (5 U / ul), DNA polimeraz
12.1 ul DNaz ücretsiz su (Final reaksiyon hacmi 50 ul) - Uygun bir yapışkan ya da ısı ile sızdırmaz bir film ile, PCR plakası kapatın.
- Uygun bir termal döngü reaksiyonu yerleştirin ve ısıtılmış kapak ile, aşağıdaki döngü koşulları kullanacaktır:
- 10 dakika boyunca 95 ° C'de bir ilk denatürasyon yapın.
- 30 saniye için 95 ° C'de denatüre.
- Primerlerin spesifik T m, 30 saniye boyunca tavlama kullanılır. Bir tav sıcaklığında optimizasyon reaksiyonları için primerin Tm'den birkaç ° C başlatın.
NOT: En tavlama sıcaklıkları, ayrıca bir sıcaklık aralığında test etmek için bir kademeli termal devir cihazı aracılığıyla belirlenebilir. - 30 saniye için 72 ° C 'de bir uzantı yapın. Uzun amplikonlarının için uzatma süresini uzatır.
- Tekrar 3.3.3.2-3.3.3.4 35 döngüleri adımlarıİlk optimizasyonu için tal. Yüksek devir sayıları gerekli olabilir ama genellikle reaksiyon eserler yaratacak klonal amplifikasyonlar önlemek için kaçınılmalıdır.
- 7 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma yapın.
- 4 ° C 'de reaksiyonlar tutun.
- PAGE elektroforezi ile amplikonları gözünüzde canlandırın. Seçenek olarak ise, üreticinin protokolüne uygun olarak bir kılcal elektroforez, DNA çipi kullanın.
- Buz ve girdap 5x yükleme boyası 6 ul PCR reaksiyonu, 24 ul karıştırın.
- O. GKD 2 tampon ve 800 ml 5x TBE 200 ml karıştırma çalıştırarak 1x TBE tampon çalışan 1 L olun GKD 2 O ve yükleme boyası olarak oyuk başına 0.5 ug bir son konsantrasyonda DNA merdiveni seyreltin.
- PCR reaksiyonları veya merdivenin 30 ul yük kuyu.
- 45 dakika ~ 200 V jel çalıştırın. İlk boya ön jel sonuna ulaştığında jel akışını durdurur.
- 5 ug / ml jel lekeGKD 2 O 100 ml, 10 mg / ml, 5 ul karıştırılarak etidyum bromid Tüm jel Kapak ve ~ 5 dakika inkübe izin.
- Görüntü 482 nm'lik bir uyarma dalga boyunda bir UV ışık kutusu ya da çok modlu görüntüleyici yoluyla jeli.
- , Boyut PCR amplikonlar merdiveni referans ve beklenen amplikon boyutundan diğer çoklu bant (Şekil 4A ve C) bakarak reaksiyonun özgünlüğünü belirler.
- Bir kez BS-PCR için uygun koşullar, deney numuneleri üzerinde BS-PCR işlemi gerçekleştirmek, tespit edilmiştir.
- Kalan primerler ve diğer reaksiyon bileşenlerinin amplıkonları arındırın. Silika kolon arıtma, SPRI boncuk ya da jel bazlı temizlik ve ölçümü gerçekleştirmek.
- 30 ul TE tampon maddesi içinde Elute amplikonlar.
- Üreticinin protokolleri kullanarak flüorometrik testi kullanılarak amplikonları sayısal olmalıdır.
- Numune başına birden fazla amplikonlar varsa, hacim başına eşit ağırlıkta onları havuz-20 ° C'de miktarları saklayın.
4. NGS Kütüphane Hazırlama ve Kütüphane QC
NOT: BSAS NGS kütüphane hazırlık çift indekslemesi ile basitleştirilmiş transposome-aracılı protokolünü kullanır (kütüphane hazırlık seti seçimi ile ilgili detaylar için malzemeler listesi bakınız). Bu yöntem, bisülfit dizileme uygulamaları 16,19 hiçbir sapma küçük geçerli ve gösterir edilmiş kitaplık oluşumu için son derece hızlı ve yüksek verimli bir yol sağlar. Çift indeksleme tek indeksleme daha numunelerin daha yüksek bir çoğullama sağlar. Diğer kütüphane hazırlık stilleri mümkün olabilir ancak test edilmemiştir.
- Bir 96-yuvalı PCR plaka BS PCR amplikonlarının gelen NGS kütüphaneleri hazırlayın. / 0.2 ng amplikonları seyreltilir 1 ng veya 0.2 ng / ml bir seyreltinin 5 ul bir son giriş kütlesi için ul. SPRI boncuklar kullanılarak oluşturulan kütüphanelerin temiz-up gerçekleştirin. W kitaplıkları izole edilmesi için 50-90 ul SPRI boncuk kullanınBu protokol i. SPRI tanelerin hacim kütüphanesinin hedef boyutu ve istenen dizilim reaksiyonları, döngü sayısına bağlıdır.
NOT: boncuk tekrar süspansiyon bir mikroplate çalkalayıcı ya da plaka vortexer kullanın.- Boncuklar kütüphanelerin Zehir ve yeni bir 96 oyuklu plakaya transfer ve -20 ° C'de muhafaza edilmek üzere ısı yalıtımlı bir film ile kapatın.
- Kitaplıkları (Şekil 4B ve D) büyüklüğü ve konsantrasyonunun belirlenmesi.
- Üreticinin protokollerine göre çip boyutunda bir kapiler elektroforez DNA Run kütüphaneleri.
- Tespit edilen kütüphane tepe ortalama büyüklüğü ve üretici protokollerine göre molaritede bir tahmin belirlemek için bir yüksek hassasiyet kılcal elektroforez, DNA deneyi kullanın.
- Bilinen konsantrasyonda oluşturulacak kütüphaneler ve kullanımı standartlarında adaptör dizisiyle göre tasarlanmış primerler kullanılarak, qPCR kütüphaneleri ölçmek.
- Çalışma qPCR yenidenüreticinin protokollerine göre saf niceleme ayarlarını kullanarak gerçek zamanlı aletindeki eylemler.
- Kütüphanelerin molar konsantrasyonları hesaplamak için qPCR gelen kütüphanelerin boyutunu ve molar kantitatif kullanın.
- Üreticinin protokollerine göre çip boyutunda bir kapiler elektroforez DNA Run kütüphaneleri.
- PH 8.5'da% 0.1 Tween-20 ile, 10 mM Tris-Cl kullanılarak 4 nM'ye kütüphaneleri seyreltin. -20 ° C de ısı ile sızdırmaz bir film ile sızdırmaz bir 96 gözlü PCR plaka saklayın kütüphaneleri.
Bir Masaüstü Sequencer kullanma 5. Ardışık Kütüphaneler
- Çözülme ve üreticinin talimatlarına göre reaktifler hazırlamak.
- Buz üzerinde 4nM kütüphaneleri çözülme.
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.2 N NaOH 1 ml olun.
- Eşit hacimli miktarda Havuz 4nM kütüphaneler, çoklu kütüphaneler ise kullanılacak.
- Seyreltin ve arzu edilen son molar konsantrasyonunda üreticinin talimatlarına göre bir araya toplanmış kütüphaneleri denatüre.
- Seyreltilmiş tutun ve denatürehazır olana kadar buz üzerinde toplanmış kütüphane reaktif kartuş üzerinde yüklemek için.
- Bir örnek levha örnek adlarını içeren ve ilgili indeks bilgi üretmek ve sadece dosyaları .fastq oluşturmak için belirtin.
- Sequencer karşılık gelen örnek levha klasöründe yükleyin örnek levha.
- Iyi gelen reaktif kartuşu 600 seyreltilmiş ul ve denatüre kütüphanede toplam ekleyin.
- Tamamlanması için sıralama reaksiyonları çalıştırın.
6. Metilasyon miktar tayini Veri Analizi
NOT: hem ticari hem de açık kaynak dahil NGS veri analizi için mevcut birden çok program vardır. Çalışan programlarda Detayları her özel paketi ile bulunabilir. Genel talimatlar Bu yazılım paketi için özel komutlar ile birlikte her adımda verilir. (Bu protokolde kullanılan yazılımlar ile ilgili ayrıntılar için malzemeler listesi bakınız).
- Uygun se içine Aktar .fastq.gz dosyalarıkırpma okuma kullanılmak üzere kalite puanları (Qscores) istinat analiz boru hattı quencing. (Bu örnek program için 'Import' seçin ve okur oluşturmak için kullanılan sıralama yöntemini seçin. Içe dosyaları okumak .fastq.gz seçin ve okuma 'Genel altında' Sil kalite puanları 'seçimini kaldırarak uygulamaları düzeltmek için .fastq dosyaları Qscores korumak Finish 'Seçenekler' ithal okur ve seçin için. Bir yer seçin '.)
- Trim ve bir NGS veri analizi boru hattı aşağıdaki ayarları kullanarak okur korumak. (Bu program için 'NGS Çekirdek Araçlar' başlığı altında 'Trim Dizileri' seçin ve kesileceği okur seçin.)
- Sadece ≥ Q30 puanları içeren okur saklayın. (Bu program için 'kalite puanları kullanarak Trim' seçin ve 0.001 sınırını ayarlamak.)
- Koru sadece ≤ 1 belirsiz nükleotid içeren okur. (Bu program için 'Trim belirsiz nükleotidleri' seçin ve ayarlayın1. 'belirsizlikler sayısı' okur kesilmiş kaydetmek için bir konum seçin ve 'Son'u seçin.)
- Harita 2.2 dan siliko bisülfit dönüştürülen gen referans okur kesilmiş. (Örnek yazılım için 'NGS Çekirdek Araçlar' başlığı altında 'Harita Referans okur' seçeneğini seçin. Kesilmiş seçin haritalanmış ve 'sonraki' seçiniz. Dönüştürülen referans dizisi seçin ve 'referans maskeleme' başlığı altında 'hayır maskeleme' seçeneğini belirleyin okur. Seç ' sonraki '.)
- Uyumsuzluklara, eklemeler, çıkarmalar ve bir maksimum ceza atayın. İlgili parametreler okuma uzunluğunun% 100% 90 sekans özdeşliğine sahip bir haritada için gerekli olan şekilde gerçekleştirilir. Örnek yazılımı için, uyumsuzlukları, yerleştirmeler, ve silme işlemleri için 3 puan atayın. Referans eşlenen okuma uzunluğu minimum kısmı için 1 puan atama, okuma ve referans haritalanmıştır arasındaki kimlik minimum kısmı için 0.9 puan atayın.
- Hizalama çıkışı için bağımsız bir dosya olarak her bir örnek oluşturur. Örnek yazılımı için seçin 'tek başına Oluştur eşlemelerini okumak' 'Çıktı seçenekleri' ve 'Sonuç taşıma' altında 'Kaydet' başlığı altında. Okuma haritalama kaydetmek ve 'Finish' seçmek için bir konum seçin.
- Eşleştirilmiş okur bir varyant arayarak iş akışı çalıştırın. Örnek yazılımı için, 'resequencing Analizi' başlığı altında 'Probabilistik Varyant Algılama' seçeneğini analiz edilecek okuma haritalama seçin ve 'sonraki' seçeneğini seçin. Seç 'filtreleri Oku' altında 'non-spesifik maçları Yoksay' ve 'gelecek' seçeneğini seçin.
- Dizisi dep de olduğundan emin olun1.000 'Önemi' altında 'asgari kapsama' ayarlayarak ≥ 1000 X inci.
- Varyant çağrısı hem ileri hem de mevcut olduğundan emin olun ve okur ters. Örnek yazılımı için, seçeneğini 'ileri hem de varlığını gerektir ve standları ters' 'Varyant filtreleri' başlığı altında ve 'sonraki' seçeneğini seçin.
- İhracat hizalanmış, varyant açıklamalı tablo olarak veri çağırdı. Örnek yazılımı için, 'Çıktı seçenekleri' başlığı altında 'açıklamalı tablo oluşturun' seçin ve varyant tablo dosyasını kaydetmek için bir konum seçin. 'Finish' seçin.
- Trim ve bir NGS veri analizi boru hattı aşağıdaki ayarları kullanarak okur korumak. (Bu program için 'NGS Çekirdek Araçlar' başlığı altında 'Trim Dizileri' seçin ve kesileceği okur seçin.)
- Varyant tablo dosyasından ilgi bölgesinde açıklamalı CpG siteleri varyant frekansları kullanılarak 5-mC yüzdesini hesaplayın. CG referans C'de sitozinin frekansı 5-mC yüzdesidir.
NOT: Çok metillenmiş CpG yıllardan için algoritmaları çağrılarak varyantı kullanırken, timinler ile CpG sitosinler değiştirin. Bu olduklarını gösteren edecekCpG evinde sitozin frekansı sonuçlanan, varyantları gibi fy sitozin en haritası çizilmiştir. - İlk C yüzdesi referans (C) CpG sitelerinde değil hesaplayarak bisülfit dönüşüm verimliliği (bsc) belirleyin. Referans T'nin (C MPT) eşlenen toplam C en toplam T'nin eşlenen (T mp) sayısına göre olmayan CpG C en yüzdesini ve bölme çarpın. 100 eksi hesaplanan frekans o kütüphanede (Denklem 1) bisülfit dönüşüm verimliliği (bsc) 'dir.
Denklem 1. bisülfit dönüşüm verimliliği.
NOT: memeli genomları (kök hücre 20 potansiyel hariç), CpG olmayan sitosin metilasyon çok düşük miktarlarda içeren, bitki genomu önemli miktarda içerir. Bu Referenc bisülfit dönüşüm verimi belirlemek içinE genomları, bir uygun yol 21 genomu ve yukarıda tarif edildiği gibi dönüştürme verimliliğini hesaplama bitkide mevcut mitokondriyal genom ya da kloroplast genomuna veya bilinen metillenmemiş genlerin bir kısmını sırası etmektir. Bisülfit dönüşümü verimliliği dönüştürülmemiş Cı potansiyel olarak sigara CpG metilasyon kaynaklanan, çoğu durumda ≥98% olmalıdır.
Representative Results
BSAS düzgün Şekil 5 benzeyecek dönüştürülen referans dizisine hizalanmış okur. CpG dinükleotidleri açıkça tespit edilebilir ve metilasyon devletler eşlenen okur CpG siteleri baz çağrıları gözlemleyerek tahmin edilebilir. Örneğin, metilasyon kontrolleri ile,% 0 metilasyonu tüm T'nin (Şekil 5A) içeren CpG bölgelerinin eşleştirilmiş okur neden olur. % 100 metilasyon kontrolleri eşlenen okur tüm C'nin (Şekil 5B) içeren CpG siteleri okur neden olur.
CpG siteleri sitozin frekansı (C / C + T) kantitasyonu orijinal numunede metilasyon frekansını verir. Tüm genom metilasyon kontrol (n = 3 / metilasyon oranı) elde edilen temsili bir standart eğri, her metilasyon oranı (Şekil 6) ölçümde metilasyon kantitatif doğrusallığı olarak hassas gösterir. Toplam Bu yöntemin bir örneği olarak, RNA ve DNA birlikte-izo edildi fare beyincik ve retina (n = 4 / grup) yonunun. Seçici olarak retinal doku içinde ifade rodopsin ifade, QPCR kullanılarak ölçüldü. İfade sadece retinanın (Şekil 7A) 'de tespit edilmiştir. Bsas kullanarak, CpG metilasyon düzeyi rodopsin promotör bölgenin ölçüldü. Promotör bölgenin genelinde kümülatif metilasyon düzeyi retina (p <0.001, parametrik t-testi) (Şekil 7B) içinde <% 15 oranla beyincik>% 80 idi. Site-spesifik metilasyon kantitatif gelen BSAS metilasyon niceleme yararları ve metilasyon seviyesi herhangi bir genomik bölgenin karşısında bir CpG özgü olarak karşılaştırılabilir. Retina örneklerinde (p <0.001, her CpG yerinde parametrik t-testi) (Şekil 7C) göre rodopsin promotör genelinde CpG metilasyon düzeyi serebellar örneklerde anlamlı derecede yüksek bulundu.
1highres.jpg "/>
Şekil 1:. BSAS yöntemin şematik, bu yöntemde, genomik DNA, urasillere için unmethylation sitosinler değiştirmek için dönüştürülmüş bisülfıttir. Daha sonra, PCR sırasında bu urasiller timinler değiştirilir. PCR amplifikasyon ilgi bölgelerine yönelik ve yüksek sadece bu dizilerin için zenginleştirir edilir. Elde edilen PCR amplikonları, basit tagmentation süreci boyunca çift endeksli kitaplıkları yapılır. Daha sonra kütüphane bir tezgah üstü nesil dizisi üzerinde dizildi ve dizilim sitosin en temel özgü bir şekilde tespit edilir siliko dönüştürülen bir referans dizisi ile yüzde metilasyon eşleştirilir okunur.
Şekil 2:. Ilgilenilen bölgenin silico bisülfit dönüşüm herhangi genomik referans ilgi Herhangi bir bölge SELEC olabilirsiliko bisülfit dönüşüm için ted. CpG olmayan sitosinler timin referans sekansı içinde değiştirilir. CpG sitosinler bisülfit olarak sitosinler referans dönüştürülür kalır.
Şekil 3:. Primer yerleşim bisülfit PCR primerleri siliko bisülfit bir karşı tasarlanmış referans dizisi dönüştürülür. Primerler, bu CG dinükleotidleri üzerine binmeyecek şekilde tasarlanmış ya da CG dinükleotidleri bitişik dizayn edilmelidir.
Şekil 4: yüksek ve kalitesiz PCR amplikonlarının ve sıralama kütüphaneleri örnekleri Temsilcisi Elektroferogram izleri ve jel gösterisi (A) tek bir yüksek olan transposome-aracılı kütüphane nesil için ideal bir amplikon.konsantrasyon ürünü. Bu amplikonundan oluşturulan (B) Kütüphane (C) Kalitesiz PCR amplikonlar boyutu, konsantrasyon düşük olabilir. Yüksek konsantrasyon ve hatta boyut dağılımı gösterir ve birden fazla ürün ve / veya astar dimerleri içerirler. Bu kalitesiz amplikonlar (D) neden düşük konsantrasyonda ve düşük boyut dağılımı ile kütüphane nesil başarısız olacaktır.
Şekil 5: metilasyon kontrollerden dizileme çıkışlarının örnekler. Silico (A) CpG siteleri ile başvuru sıralama kırmızı vurgulanan dönüştürülmüş. Eşlenen 0% metilasyon kontrolü CpG siteleri seçilen bölge gösteren timinler (açgözlülük vurgulamak) haritalama için okur. Eşlenen (B)% 100 metilasyon kontrolü CpG siteleri sitozin en (mavi vurgulamak) eşleme gösterir okur.
Şekil 6:. Metilasyon bir kontrol aralığı boyunca Metilasyon kantitasyonu, 100,% 0 ile% metilasyon oranlarının (N = 3 / oranı) karıştırılan tüm genom metilasyon kontrol bsas kullanılarak ölçüldü. Nicel karşı beklenen kantitatif çiziliyor metilasyon kontrol kantitatif lineerliğini göstermektedir. Tüm kontroller karşısında, metilasyon kantitatif yüksek hassasiyetli oldu.
Şekil 7: doku örneklerinden eşleştirilmiş DNA metilasyonu ve gen ekspresyon analizi örneği. (A), fare serebellar ve retina dokusu rodopsin nispi mRNA ifadesi. (B), serebellar ve retina DNA (*** p <0.001, parametre t-testi) arasında BSAS ile miktarı rodopsin ortalama promotör metilasyonu. <fare beyincik ve retina DNA kopyalama başlangıç sitesine [TSS]) göre rodopsin promotörünün (+ 6'ya -244 karşısında güçlü bir> C), CpG site-spesifik metilasyon seviyesi.
Discussion
BSAS örnekler ve hedeflerin sayısı, her iki dizi, yüksek ölçüde yetenekleri ile odaklanmış doğru DNA metilasyonu kantitatif sağlar. Ayrıca, transposome-aracılı tagmentation kullanarak bu kütüphane nesil hızlı, daha az girdi DNA olduğunu gerektirir ve geleneksel kesme ve sonraki adaptör ligasyonu teknikleri daha az adımları içerir. Mevcut yöntemlere göre bu gelişmeler söz konusu herhangi bir hedef alanının taban düzeyinde bir DNA metilasyon analizi için izin verir. Ayrıca, BSAS tüm genom bisülfit 22 veya yakalamak 23 yaklaşımlar kullanılarak tespit edilmiştir ilgi alanlarının (farklı olarak metilasyon bölgeleri (DMRs), CpG adaları, düzenleyici bölgeler) teyidi için yeni bir yöntem sağlamaktadır. Ortogonal onay yaklaşımları ve daha nicel yöntemler kullanarak kesin Epigenomic çalışmaların analitik titizlik geliştirir. BSAS ile elde edilen yüksek okuma derinliği yeniden, dar bir güven aralığı doğru kantitatif için izin verirhassas kantitatif 16 engellenmesi hususundaki. Ayrıca, tek bir deneyde birçok örnekleri çalıştırmak için yeteneği istatistiksel gücünü artıracak tüm genom yöntemleri teyitleri, örnek boyutunu artırabilirsiniz; Birçok akım epigenetik çalışmalar zayıflık. Önemli olarak, BSAS epigenetik araştırmalar için test edilebilir hipotez oluşumu için izin veren bir baza spesifik CpG metilasyon nicelendirilmesine içerir. Örneğin, belirli bir tepki elemanı artış metillenmesi hipotezler azalmış bir transkripsiyon faktörü bağlanma neden olur. Eşleştirilmiş mRNA ekspresyon verileri ile kombine BSAS, doku ya da hücre popülasyonunda tek bir parça içinde epigenetik düzenleme ve mRNA hem elde edilmesi için bir yöntem temin etmektedir. Düzenleme ve ifade Eşli ölçümleri de bilimsel titizlik ve bulguların etkisini artırmak.
BSAS protokolü içinde kritik adımlar astar tasarım, amplikon optimizasyonu, ve kütüphane nesil / includeQC. Primerler uygun şekilde tasarlanmış ve farklı verimlilik 8'de yükseltmek değilse PCR önyargı tanıtıldı. Bu tür enzimatik olarak% 100 ve% 0 sitosin metile standart olarak metilasyon standartlarının kullanımı, eğer varsa metilasyon niceleme önyargı, derecesini belirlemek için kullanılır ve metilasyon 16 hesaplarken uygun bir yöntem olup, kontrol edilebilir. Tek bir yüksek-kaliteli amplikonu üretmek için PCR reaksiyonları optimize Benzer şekilde, dikkatli olunmalıdır. Herhangi bir amplikon protokolü detaylı önerilen edilen kılavuzları kullanarak, mevcut ise, optimizasyon adımları artan PCR devir sayıları ya da bsDNA giriş miktarını içerir. Astar-dimer dahil olmak üzere birden PCR ürünleri, varsa, optimizasyon adımları, bsDNA giriş miktarını azaltarak PCR primer molar giriş konsantrasyonları azalan, tavlama sıcaklıkları artan ya da PCR döngüsü sayısının azaltılması sayılabilir. Bu optimizasyon prosedürleri biri ya da bir kombinasyonu tek bir HIG oluşturmak için yeterli sonucu verirh-kalite amplikonu. Alternatif olarak, astar yeniden tasarlama tek amplikon veren yok primer setleri için iyi bir yaklaşımdır. Yeniden tasarımı uygun veya mümkün değildir, bu bölgeler için, hem ters primerler CpG siteleri CpG ileri primerler sitelerde ve adenin en ve guanin en az sitozin ve timin en en çalışabilir olmak üzere primer setleri dejenere. Ancak, bu primer setleri önyargı oluştuğunu hiçbir PCR bu protokol kapsamı dışında bir işlem sağlamak için daha fazla optimizasyon gerekiyor. Kalite kütüphaneleri başarı için son derece önemlidir. QC tedbirler sıralama önce kütüphanelerin boyutu, kalitesi ve miktarını belirlemek için yapılır emin olun. Dizileme reaksiyonları, düşük kaliteli kütüphanelerinin girişi ile başarısızlığa eğilimlidir. Metilasyon kantitatif olarak Önyargı metilasyon frekansları hem ileri hem de mevcut ve sıralama okur ters olması sağlanarak azaltılabilir. Ayrıca, CpG sitelerine hizalama üsleri kalite puanları yüksek işbirliği için ≥Q30 olmalıdırölçümde nfidence. Diğerleri, yukarıda açıklanan ölçümleri sağlanması, bisülfit dönüştürülmüş DNA 19 tagmentation reaksiyonlarında hiçbir önyargı önceden az göstermiş olsa da, düşük önyargı metilasyon kantitatif onay verir.
BSAS anda, ancak bu yöntemin, gelecekteki açılımı bu bisülfit dönüşümü 24 önce potasyum perrutenat sokulması 5-MC ve 5-HMC ayırt deneysel adımlar ayrıca CpG 5-HMC eşleştirilmiş ölçümleri sağlayacak, CpG bölgelerinin metilasyon ile ölçer. Bu DNA metilasyonu gen ifadesi düzenleyici rolleri belirlemek amacıyla, eşleştirilmiş metilasyon için izin vererek 5-MC ve 5-HMC ve anlatım verilerini hem BSAS programı etkisini artıracaktır. PCR amplikonlarının Transposome aracılı kütüphane hazırlanması büyütülmüş bölgelerden uçlarında azalma dizileme derinliği neden yoktur. Bu nedenle, yüksek ölçüde ilgi çekici bölgelerinde amplikonların ortasında bulunması için dizayn edilmelidir. NasılBSAS üretir, çünkü şimdiye kadar, sıralama> 1,000 X, güçlendirilmiş bölgelerin uçları yakın ölçümler yüksek kalır 5-Mc kantitatif doğruluk derinliklerinde okudum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
| Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
| Agencourt AMPure XP - PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 ml |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
| twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
| Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
| Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
| Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
| 0.1-10 μl Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
| 2-200 μl Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
| 50-1,000 μl Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
| MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
| 2.0 ml Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300 cycles |
| KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
| ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
| Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
| Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5x (1 L) |
| Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5x (10 ml) |
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
| UltraPure 10 mg/ml Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384-well block |
| DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
| SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
| QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
| TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
| Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
| TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| 384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
| Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
| EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
| ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |
References
- Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & Development. 16 (1), 6-21 (2002).
- Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
- Heard, E., Martienssen, R. A. Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms. Cell. 157 (1), 95-109 (2014).
- Baylin, S. B. DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice. Oncology. 2, Suppl 1. S4-S11 (2005).
- Baylin, S. B. The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).
- Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).
- Mikeska, T., et al. Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis. The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).
- Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In. Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).
- Dikow, N., et al. Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA. Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).
- Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues. Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).
- Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method. Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).
- Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine. Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).
- Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues. Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).
- Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing. Epigenetics & Chromatin. 6 (1), 33 (2013).
- Caruccio, N. Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition. Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Adey, A., Shendure, J. U. ltra-low-input tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing. Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).
- Smallwood, S. A., et al. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).
- Wang, J., et al. Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation. Plant Methods. 7, 39 (2011).
- Lister, R., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Ivanov, M., et al. In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes. Nucleic Acids Research. 41 (6), e72 (2013).
- Booth, M. J., et al. Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).
