Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

الزرد خلية قرنية إإكسبلنتس لدراسة الهجرة الجماعية خلية وعودة التظهرن في شفاء الجروح الجلدية

Published: February 25, 2015 doi: 10.3791/52489
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 1
1Biomedical Sciences Program, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Midwestern University

Summary

keratocytes الزرد الهجرة في أوراق خلية من إإكسبلنتس وتقديم نموذج في المختبر لدراسة آليات الهجرة الخلية الجماعية في سياق الظهارية التئام الجروح. هذه البروتوكولات بالتفصيل وسيلة فعالة لإقامة الثقافات يزدرع الأولية لاستخدامها في المقايسات الهجرة الجماعية الخلية.

Abstract

نظرا لخصائص متحركة فريدة من نوعها، فصل keratocytes الأسماك من منذ فترة طويلة تستخدم الثقافات يزدرع لدراسة آليات الهجرة خلية واحدة. ومع ذلك، عندما يتم تأسيس إإكسبلنتس، وهذه الخلايا أيضا تتحرك بشكل جماعي، والحفاظ على العديد من الميزات التي تجعل الفرد keratocytes نموذجا جذابا لدراسة الهجرة: سرعة معدلات الحركة، واسعة النطاق، الأكتين الغنية صفاحات مع كابل الأكتين عمودي، وبسرعة ثابتة نسبيا و اتجاه الهجرة. في إإكسبلنتس وقت مبكر، وinterconversion السريع لخلايا المهاجرة بشكل فردي مع أولئك الذين يهاجرون جماعيا يسمح دراسة دور التصاقات خلية خلية في تحديد النمط من الهجرة، وتشدد على الروابط الجزيئية بين وضعي للهجرة. الخلايا في إإكسبلنتس في وقت لاحق تفقد قدرتها على الهجرة بسرعة وبشكل جماعي باعتباره الظهارية لالوسيطة الانتقال يحدث ويتم التعبير عن الجينات المرتبطة التئام الجروح والتهاب تفاضلي. وهكذا، يمكن إإكسبلنتس خلية قرنية بمثابة نموذج في المختبر لعودة التظهرن الذي يحدث أثناء الجلدي التئام الجروح ويمكن أن تمثل نظاما فريدا لدراسة آليات الهجرة الخلية الجماعية في سياق برنامج محدد للتغيرات التعبير الجيني. هي مجموعة متنوعة من خطوط الزرد متحولة والمعدلة وراثيا المتاحة، والتي تسمح إإكسبلنتس التي ستنشأ من السمك مع خلفيات وراثية مختلفة. وهذا يسمح للدور البروتينات المختلفة داخل هذه العمليات التي ينبغي معالجتها بشكل فريد. البروتوكولات المذكورة هنا تصف طريقة سهلة وفعالة لإقامة هذه الثقافات يزدرع لاستخدامها في مجموعة متنوعة من المقايسات المتعلقة بالهجرة خلية الجماعية.

Introduction

وقد ركزت دراسات الحركة خلية تقليديا على الخلايا المهاجرة بشكل فردي. وقد أثبتت Keratocytes مثقف من الأسماك والبرمائيات إإكسبلنتس أن يكون نظام نموذج قوي لدراسة آليات حركية الخلية باستخدام النمذجة كلا التجريبية والرياضية تقترب 1-6. وساعد العمل التجريبي على الخلايا المهاجرة بشكل فردي عن طريق السريع، وسلاسة الحركة مزلق من الخلايا، مع الحفاظ على شكل موحد، والسرعة، والاتجاه. ومع ذلك، في الجسم الحي، والخلايا في كثير من الأحيان تتحرك بشكل جماعي مع الحفاظ على تقاطعات خلية خلية، وخاصة خلال مرحلة التطور الجنيني، التئام الجروح، والانبثاث. وهكذا، الهجرة الخلية الجماعية هي منطقة النمو وبارزة على نحو متزايد من البحوث في مجال الهجرة الخلية. وقد تم مؤخرا وصف الهجرة الجماعية من هذه الخلايا 7 ولها العديد من المزايا الفريدة التي تجعل من نظام قوي لدراسة الهجرة الخلية الجماعية في نموذج التئام الجروح.

ove_content "> وعندما التقطه جداول من الزرد الكبار تخدير، لا تزال بعض الأنسجة الظهارية التي تعلق على الجانب السفلي من الجدول. عند إضافة مستنبت الخلية، وهذه الخلايا الظهارية، أو keratocytes، تهاجر بسرعة كوحدة جماعية من الحجم الكبير. و يمكن الاطلاع على ثقافة يزدرع باعتبارها الظهارية الجرح نموذج الشفاء، حيث تقوم الخلايا تهاجر بعيدا عن يزدرع كما يفعلون عبر مصفوفة المؤقت جرح سرير لإعادة تأسيس ظهارة سليمة. وتشير البيانات الحديثة إلى أن هذا خارج الحي يقلد الثقافة العديد من الميزات لل في الجسم الحي التئام الجروح في الزرد الكبار. معدلات إغلاق الجرح 8 تترجم إلى سرعة هجرة مماثلة لتلك التي لوحظت في فيفو السابقين نظام 7. وبالإضافة إلى ذلك، في جرح في الجسم الحي الشفاء نموذج، والمعاملة مع الوارفارين تشير إلى أن الإرقاء ليس له تأثير على معدل للشفاء، بينما العلاج مع الهيدروكورتيزون لتقليل استجابة مناعية لا يؤخر عودة التظهرن 8

يصف بروتوكول المعروضة هنا كيفية تأسيس الزرد الثقافات خلية قرنية يزدرع أن ضمان الاتساق واستنساخ للاستخدام في العديد من المقايسات البيولوجية. هذه الثقافات يزدرع هي مقنعة خاصة في نموذج المختبر للهجرة الخلايا الجماعية لعدة أسباب. أولا، keratocytes الزرد هي الخلايا الأولية المستخدمة في غضون ساعات من إقامة الثقافات يزدرع. ولذلك، فإن هذه الخلايا لا خضعت لتغيرات مورفولوجية والتعبير الجيني المرتبط مرور الخلايا الأولية 9-13. ثانيا، هذا النظام يمثل نموذجا لدراسة عودة التظهرن ردا على إصابة 14، وكجزء من الاستجابة للإصابة، وهو الظهارية لالوسيطة TRيبدأ ansition (EMT) عملية كما يتضح من التغيرات في التعبير الجيني وإعادة ترتيب هيكل الخلية 14،15. وهكذا، تم التعرف على التغييرات خلفية في التعبير الجيني والحركة التي تحدث في الخلايا غير المعالجة وتوفير إطار لتفسير التغييرات مع العلاج. وعلاوة على ذلك، فإن خلية قرنية الأسماك والقرنية البشرية وتعادل وظيفيا. على حد سواء هي الخلايا الظهارية الأولية من الأنواع الخاصة بكل منها ولعب دورا رئيسيا في الظهارية التئام الجروح. الثالث، الزرد الكبار تكتسب الاعتراف كنظام نموذج لمجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان 16-18 بما في ذلك سرطان الجلد وغيرها من أنواع السرطان 19-21، الجرح الجلدي الشفاء 8،14 والأنسجة تجديد 22-24.

المزايا الفنية لهذا النظام النموذجي هي مقنعة على حد سواء. وتتوفر من غير الهادفة للربح، ومرافق مركزية وهناك عدد متزايد من خطوط متحولة والمعدلة وراثيا. على وجه التحديد، ومشروع الطفرة اسماك الزرد (ZMP) في معهد ويلكوم ترست سانجر يهدف إلى إنشاء أليل خروج المغلوب في كل بروتين الترميز الجينات في الجينوم الزرد. حاليا، فقد تحور الجينات 11892، ما يقرب من 45٪ من الجينوم، مع 24088 الأليلات يتميز. وبالإضافة إلى ذلك، ZMP تقبل المقترحات وسوف تولد تدق الرافضة مجانا. الطرق الحديثة في ضربة قاضية الجينات في اليرقات والكبار الزرد 25-28 توفر المرونة اللازمة لدراسة وظيفة الجينات الهامة تنمويا التي النهج المعدلة وراثيا هي إشكالية أو غير عملية.

بسبب بمعدلات سريعة للغاية على من الحركة من ~ 145 ميكرون / ساعة بعد وقت قصير من إنشاء الثقافات 29، فحوصات يمكن أن تكتمل بسرعة (عادة في 24 ساعة أو أقل). كما التجارب يمكن أن تكتمل بسرعة والثقافات تنمو بشكل جيد في RT، العديد من العقبات التقنية المرتبطة يتم تجنب المقايسات الثدييات الهجرة الخلية التي تنطوي المجهري الفيديو. وبالإضافة إلى ذلك، في سن تشديد ميزانيات البحوث، zebrafوبسهولة وبتكلفة زهيدة الحفاظ على العش.

هيكل وسلوك يزدرع معقد. وبما أن الأسماك لا تنزف عند إزالة النطاق، وأنه من غير المرجح أن أكثر بكثير من طبقات البشرة السطحية وإزالتها مع الحجم. تظهر Keratocytes أن يكون نوع من الخلايا السائد في يزدرع عندما تتم إزالة المقاييس في البداية من الأسماك كما تظهر الغالبية العظمى من الخلايا لوصمة عار مع الأجسام المضادة لمكافحة E-كادهيرين 14. وعلاوة على ذلك، ليس هناك أي دليل من الخلايا الليفية في ثقافة الأولية كما تقرره غياب فيمنتين تلطيخ المناعي 14. ومع ذلك، مع إزالة القشور المتكررة، يبدو أن هناك العديد من العدلات في النباتى (انظر فيديو 1). لقد حددنا هذه الخلايا كما العدلات بناء على الملاحظات الشكلية من حجمها، بسرعة الحركة، وهجرتهم من ورقة خلية عندما تتعرض لLPS (لا تظهر البيانات). بالإضافة إلى ذلك، هذه الخلايا وصمة عار الطرافة الزاهيةح أجسام مضادة لعامل عصاري خلوي العدلات وكذلك مع مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة مفتش الثانوية، مما يدل على أن لديهم FcRs وفيرة على سطحها (لا تظهر البيانات). طبقات خلايا متعددة موجودة ضمن النباتى. المجهر متحد البؤر يكشف وجود طبقة واحدة بالقرب من الحافة الأمامية لأكثر من طبقتين من keratocytes بالقرب من النطاق مع العدلات مرئية فوق، تحت، وبين الأوراق خلية قرنية الخلية.

في نقاط زمنية مبكرة، الخلايا على حافة متعدد الطبقات يزدرع استقطاب، وبدء الهجرة الجماعية للkeratocytes من يزدرع بأسعار الأولى من ~ 145 ميكرون / ساعة. المنطقة التي تغطيها يزدرع يزيد بسرعة، مما يؤدي إلى خلية نشر والتوتر داخل ورقة، وانخفاض معدل مسبقا من الحافة الأمامية. ويلاحظ interconversions السريع بين الخلايا القائد والتابعين على حافة الرائدة خلال تشكيل وإغلاق الثقوب تشكلت عفويا خلال ورقة 7. وبما أنوتستمر عملية EMT بدأت مع يزدرع، شظايا ورقة وتفقد keratocytes المتخصصة، والقدرة على الحركة السريعة لها. التعبير الجيني والتغيرات المورفولوجية تتفق مع EMT، التئام الجروح، والاستجابات الالتهابية تحدث خلال 7 أيام من الثقافة مع إإكسبلنتس التي يجري النظر فيها قابلة للحياة لنحو 10 أيام 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا البروتوكول يتوافق مع مبادئ الرعاية اخر احصاء الحيوان في رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة الغرب الأوسط.

1. إعداد التخدير، المعدات، والإعلام

  1. Dechlorinate ما يقرب من 1.5 L من ماء الصنبور باستخدام إما وكيل تجاري dechlorinating (متوفر في محلات الحيوانات الأليفة) أو عن طريق السماح موقف المياه لمدة 24 ساعة. الحصول على ثلاثة أكواب 1 L وملء مع كل 500 مل إزالة الكلور المياه. تسمية واحدة لعقد الأسماك قبل أي إجراء واحد لتحقيق الانتعاش. إلى الدورق الثالث، إضافة 100 ميكروغرام / مل من تريكين methanesulfonate. يصبح هذا الكأس الذي سيتم تخدير الأسماك.
  2. ملء علبة الضحلة مع الثلج، تدفئة مستنبت (RPMI 1640، و 10٪ FBS (مصل بقري جنيني)، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 100 ميكروغرام / مل الكانامايسين، 25 ملي HEPES) إلى RT، وجمع ملاقط الجواهري نظيفة و. ملاقط نظيفة عن طريق إميرالغناء النصائح في 70٪ من الإيثانول ويمر عبر ناسخ بنسن، والسماح للإيثانول ليحرق.
  3. تقرر ما إذا كان سيتم تنفيذ الإجراء بدون تكبير، مع التجاري، فوق المنضدة مضاءة العدسة المكبرة مع 2 - 10X التكبير، أو تشريح المجهر (هذا يعتمد كليا على تفضيل شخصي).

2. إنشاء الثقافات يزدرع

  1. قبض على العدد المرغوب فيه من السمك ووضعه في كوب القابضة. نقل سمكة واحدة إلى كوب التخدير. فمن الأفضل لتخدير الأسماك بشكل فردي.
  2. رصد آثار التخدير من خلال مراقبة السباحة والخيشومية حركة الأسماك. كما تقدم التخدير، وحركة الخيشومية تبطئ وسوف الأسماك تسبح بطريقة متقطعة وكثيرا رأسا على عقب. نظر الأسماك تخدير في أقرب وقت توقف حركة الخيشومية. لا تترك الأسماك لفترات أطول في الحمام التخدير لأن ذلك قد يؤدي إلى وفاة الأسماك.
  3. إزالة الأسماك من كوب التخدير ونقلإلى جليد، ووضع الأسماك أفقيا مع الذيل التي تواجه يد تمسك ملاقط. إذا شهدت مع هذه التقنية وإذا الأسماك متعددة يجب أن تستخدم لجعل إإكسبلنتس، والنظر في وضع الأسماك القادمة في الكأس التخدير في هذا الوقت.
  4. لإزالة المقاييس، ملاقط موقف موازية للأسماك مع تلميح عند حافة النطاق. خفض الجانب المسطح من ملاقط قليلا إلى جانب الأسماك للتسبب في نطاق لرفع من جسم السمكة. فهم على نطاق ومع ملاقط، نتف، ومكان (بدون قلب) في صحن زراعة الأنسجة. كرر الإجراء، وإزالة بحد أقصى 12 المقاييس من الكبار كبير (6 من كل جانب)، وتجنب المنطقة الخيشومية، والخط الجانبي، وزعانف.
  5. ضع السمك في دورق الانتعاش ومراقبة للتأكد من أنه يتعافى من آثار التخدير. في هذا الوقت، والأسماك يمكن نقل مرة أخرى إلى خزان فردي. السماح للأسماك لاستعادة لمدة 21 يوما على الأقل للسماح لكامل تجديد النطاق.
  6. تبعا لالتصميم التجريبي، وضع ما يصل إلى 20 في موازين البلاستيك 35 ملم الأنسجة طبق المعالجة الثقافة أو 4-6 المقاييس في الزجاج طبق السفلي. تسمح المقاييس على الانضمام إلى الطبق قبل أن يضيف بلطف وسائل الإعلام حتى لا فصل المقاييس من الطبق.
    ملاحظة: مع الخبرة، يمكن معالجة الأسماك متعددة قبل إضافة وسائل الإعلام إلى الطبق الأول.
  7. إضافة 1.2 مل من وسائل الإعلام كاملة (انظر 1.2 أعلاه) في كل 35 مم الطبق.
  8. ويفضل احتضان الثقافات يزدرع في 28 ° C في CO 2 5٪ للفترة من الوقت المطلوب مع أو بدون معالجة إضافية. بدلا من ذلك، احتضان الثقافات على خشبة المسرح المجهر ساخنة أو داخل غرفة زراعة الخلايا الحية للفحص المجهري الفيديو.

3. Brightfield والفيديو المجهر

  1. أطباق موقف تحتوي على أوراق خلية على خشبة المسرح المجهر والبداية التركيز باستخدام عدسة الهدف 4X.
    يمكن أن تستخدم ارتفاع تكبير، اعتمادا على التجربة: ملاحظة. بمناسبة موقعوكل ورقة خلية و / أو توجيه الطبق على المسرح تسهيل التقاط الصور مع مرور الوقت مع الأوراق في تقريبا نفس التوجه.
  2. إزالة أطباق من الحاضنة وصورة في نقاط زمنية مختلفة، وفقا لكل بروتوكول تجريبي ووضع مرة أخرى في حاضنة إذا كانت هناك حاجة الصور الثابتة فقط على الإطار الزمني التجريبي.
  3. أثناء أداء المجهري الفيديو، والانتباه إلى ما يلي:
    1. ضع / ورقة خلية الناشئة على نطاق وداخل مجال الرؤية من هذا القبيل أن ورقة خلية المهاجرة يبقى في مجال الرؤية لمدة شريط الفيديو.
      ملاحظة: هذا قد يستغرق بعض الخبرة في مراقبة كيف تهاجر الخلايا من تحت نطاق. لأشرطة الفيديو القصيرة، وهذا هو أقل أهمية من لأشرطة الفيديو أطول.
    2. لأطر زمنية أقصر، في احتضان RT. لأطر زمنية أطول (18+ ساعة)، استخدم مرحلة ساخنة أو غرفة الحضانة للحفاظ على درجة الحرارة، وتوازن درجة الحموضة، وتقليل التبخر من ثقافة مedium.

4. التثبيت لالمناعي المجهر

  1. إعداد وقبل الدافئة جميع الحلول إلى 28 ° C. من أجل عرض keratocytes تحت مضان، وتنمو الثقافات يزدرع كما هو موضح أعلاه باستخدام 35 مم أطباق زراعة الأنسجة من الزجاج السفلي. بدلا من ذلك، استخدم الشرائح غرفة زجاجية.
  2. إضافة 0.8 مل من 4٪ بارافورمالدهيد في 1.1x PBS إلى كل طبق. لا تقم بإزالة سائل الإعلام والثقافة أولا. في احتضان RT لمدة 5 دقائق ثم نضح لإزالة الحل.
  3. إضافة 0.8 مل من 4٪ بارافورمالدهيد في 1.1x PBS إلى كل طبق. في احتضان RT لمدة 5 دقائق ثم نضح لإزالة الحل.
  4. إلا باستخدام بروابط خارجية أو الحواتم الخارجية، وخلايا permeabilize بإضافة 0.5 مل من 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X. في احتضان RT لمدة 5 دقائق ثم نضح لإزالة الحل.
  5. إضافة 0.5 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X واحتضان لمدة 1 ساعة (في RT) أو O / N (في 4 درجات مئوية).
    ملاحظة: اعتمادا على الظروف التجريبية، فاويمكن أن يضاف lloidin في هذه الخطوة.
  6. بعد الحضانة، ونضح لإزالة الحل والمضي قدما في تلوين الأجسام المضادة. بدلا من ذلك، تخزين الأطباق الثقافة عن طريق إضافة على الأقل 1 - 2 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X ل3-4 أسابيع في 4 درجات مئوية.

بروتوكول 5. المناعي

  1. إعداد حلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: إذا توصيات الشركة المصنعة ليست متاحة، لتخفيف بداية جيدة من الأجسام المضادة الأولية (في 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X) هو 1: 500 لبولكلونل و1: 1،000 لالاجسام المضادة. لتخفيف انطلاق جيدة لالأجسام المضادة الثانوية هو 1: 1،000. ضبط هذه التخفيفات من الأوراق المالية الأصلية التي تم الحصول عليها من الشركة المصنعة أعلى إذا كانت الإشارة ضعيفة وأقل عند إشارة قوية وخلفية مشكلة.
  2. نضح BSA 1٪ في حل برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 1 ساعة (في RT) أو O / N (في 4 درجات مئوية). إزالة حل الأجسام المضادة الأولية، ضع في نظيفة والمسمى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، وتجميد في -20 ° C.
    ملاحظة: هذا يسمح لإعادة استخدام الأجسام المضادة الأولية، إذا لزم الأمر.
  3. غسل الطبق 3-5 مرات مع 1X PBS، وإزالة والتخلص من PBS بعد كل غسل.
  4. إضافة 0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية. إذا رغبت في ذلك، إضافة phalloidin fluorescently المسمى (التالية أوصى تركيز أي الشركة المصنعة) خلال هذه الخطوة. احتضان لمدة 1 ساعة (في RT) أو O / N (في 4 درجات مئوية).
    ملاحظة: استخدام phalloidin fluorescently المسمى-تسمح لرؤية خيوط الأكتين. لقد وجدنا أن phalloidin المسمى 488 يعمل بشكل أفضل في keratocytes الزرد لدينا، ولكن fluorophores أخرى يمكن استخدامها.
  5. إزالة والتخلص من حل الضد الثانوية.
  6. غسل الطبق 3-5 مرات مع 1X PBS، وإزالة والتخلص من PBS بعد كل غسل.
    ملاحظة: يمكن تخزين طبق، مغطاة بعيدا عن الضوء، في 4 درجات مئوية إذا كان غير قادر على المنافسةث فورا؛ تأكد من إضافة برنامج تلفزيوني 1X في طبق قبل تخزينها لضمان الخلايا لا تجف ولكن الحار لRT (20 - 30 دقيقة)، ثم إزالة PBS فقط قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  7. عندما تصبح جاهزة لمراقبة، إضافة 2-3 قطرات من المتوسطة المتزايدة، مع أو بدون دابي، اعتمادا على احتياجات التجريبية، في طبق وترك الجلوس لمدة 10 دقيقة في RT.
    ملاحظة: نحن نستخدم المتاحة تجاريا، القائم على الجلسرين المتوسطة المتزايدة مع دابي، ولكن وسائل الإعلام الأخرى المتصاعدة يمكن استخدامها. السماح 10 دقيقة للالمتوسطة المتزايدة للجلوس في صحن يسهل إزالة سهلة من ساترة الزجاج من قاع الطبق.
  8. بعد الحضانة، والضغط برفق على جانبي الطبق لتخفيف وإزالة ساترة. إضافة قطرة إضافية من وسائل الاعلام المتزايدة على شريحة زجاجية ووضع ساترة، وخلايا أسفل، على الشريحة.
    ملاحظة: فكر ختم ساترة إلى الشريحة استخدام طلاء الأظافر واضح إذا تحتاج الشريحة إلى أن تبقى لمدة أطول من 1 - 2 أيام.
  9. مراقبة الشريحة تحت المجهر مضان.
    ملاحظة: وقد أخذت معظم صورنا باستخدام 40X 63X أو عدسة موضوعية تحت الغمر النفط، ولكن عدسة موضوعية محددة تستخدم سوف تعتمد على بروتوكول تجريبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما هو موضح في الشكل رقم 1، ورقة من keratocytes يمكن ملاحظة المهاجرة خارج من تحت نطاق غضون ساعات من تأسيس ثقافة يزدرع. أحيانا، وهي خلية قرنية المهاجرة بشكل فردي والتي قد كسر بعيدا عن ورقة المهاجرة بشكل جماعي ويمكن ملاحظة. وبالإضافة إلى ذلك، كما تم تأسيس يزدرع من الأسماك التي كانت قد التقطه سابقا، هناك وفرة العدلات المهاجرة من خلال ورقة. في فترات أطول الثقافة، شظايا ورقة خلية قرنية كخلايا الخضوع EMT 14.

معدل الأولي للتقدم ورقة سريع للغاية ولكن هذا المعدل يتباطأ بسرعة مع انتشار الخلايا (تقاس من حيث المساحة والمسافة التي تزيد النوى ~ 1.8 و 3.1 ~ أضعاف على التوالي) خلال ساعة 48 الأولى من ثقافة (الشكل 2A-C). لا ترتبط الزيادة السريعة مع تكاثر الخلايا. بعد وصفها لمدة 24 ساعة مع deoxyuridine الفلورسنت ثيميدين التناظرية إيثينيل (EDU)، ~ 10٪ من خلايا تظهر أدلة على انقسام الخلايا، وهو معدل أقل بكثير مما ظهر في خطوط الخلايا تحولت ولكن أكثر اتساقا مع الخلايا المشاركة في reepithelization في الثقافات عضوي النمط الإنسان 30. في أوقات لاحقة، شظايا ورقة (ظاهرة المرتبطة EMT لوحظ في هذا النظام 14) مما يجعل وقت مبكر من طليعة من الصعب قياس.

المنطقة التي تغطيها صفائح بعد 24 ساعة، ويمكن استخدامها كشاشة السريع لقدرة مركبات لتغيير الهجرة الخلية الجماعية 15،31. عند إضافة العلاج في الوقت الذي يتم إنشاء إإكسبلنتس، يمكن أن ينظر إلى الاستجابة للجرعة في منطقة ورقة. بعض السيتوكينات الثدييات (على سبيل المثال، TGF-1 15)، كيموكينات (مثل CXCL12) ومثبطات جزيء صغير يتميز الأصل في نظم الثدييات (على سبيل المثال، MMP-2، -9، و-13 مثبطات 31) وقد استخدمت بنجاح. ومع ذلك، لا يتم توزيع المناطق ورقة في 24 ساعة عادة ( الشكل 3C).

في كثير من الحالات، ويلاحظ آثار العلاج (ق) على الهجرة الجماعية في فترات زمنية أقصر. في هذه الحالات، المجهري الفيديو يمكن استخدامها لفحص استجابة من ورقة المهاجرة جماعي للعلاج. عندما يضاف للذوبان RGD تحتوي على الببتيد إلى مستنبت (لوحة ثالثة في الشكل 4) لتعطيلتشكيل dhesion، وصفاحات في طليعة من ورقة ينكمش بسرعة وبعد ذلك الحافة الأمامية لليفصل رقة وتتراجع. كما تتراجع الورقة بأكملها في أقل من 2 دقيقة، ويمكن رد ورقة للعلاج يكون سريعا.

لتقييم توطين البروتينات داخل ورقة أو داخل الخلايا القائد والتابعين، الورقة بأكملها يمكن أن تكون ثابتة وملطخة، كما هو مبين في الشكل (5). ويجب توخي الحذر أثناء عملية التثبيت كما تتعطل الأوراق الخلية بسهولة. في أيدينا، تم العثور على العديد من الأجسام المضادة إلى المجالات الوظيفية للبروتينات في الثدييات (وخاصة من البروتينات عصاري خلوي) لعبور الرد في إإكسبلنتس الزرد لدينا.

الشكل (1)
الشكل 1. الهجرة الجماعية للأوراق الخلية. وبعد إنشائها في ثقافة يزدرع، keratocytes الهجرةمن تحت نطاق كوحدة جماعية. (A) يوضح كمية النسبي من الخلايا التي هاجروا بعيدا عن نطاق بعد فقط 2 ساعة في الثقافة، مع (BE) اتخذت كل ساعة بعد ذلك (3 - 6 ساعة، على التوالي). وقد تم نقل كل الصور في التكبير 100X. يظهر تسلسل كامل في فيديو 1؛ وقد اتخذ إطار واحد كل 30 ثانية خلال الفترة الزمنية 6 ساعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. خصائص الهجرة الجماعية. معدل الأولي من قبل الحافة الأمامية، ويقاس في عدة نقاط، سريع ولكن يبطئ خلال ساعة 24 الأولى في الثقافة (A). قياس المسافة النوى ومنطقة الخلية باستخدام جultures ثابتة في 4 و 24 ساعة وملطخة دابي وphalloidin كمرجع تشير إلى أنه خلال الفترة الزمنية نفسها، سواء المسافة النوى (تقاس من وسط كل نواة)، ويزيد من مساحة الخلية (التي تقاس على أنها منطقة مغلقة من قبل الأكتين القشرية الهيكل الخلوي، (B) و (C) على التوالي). يمثل كل رسم بياني لمتوسط ​​(± SEM) من ثلاث تجارب مستقلة في ثلاث نسخ. تم تعديل هذا الرقم من Rapanan وآخرون. 7 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الفحص الهجرة الجماعية باستخدام ورقة خلية المساحة، وعندما تضاف إلى مستنبت خلال إنشاء ثقافة، peptانخفاض بيئة تطوير متكاملة Z-PLG-NHOH (طيف واسع MMP) وجزيء صغير SB-3CT (MMP2 و 9 محددة) مثبطات منطقة ورقة الخلية بعد 24 ساعة في الثقافة (A). وبما أن مجال صفائح الخلايا غير المعالجة يتم توزيع أضعافا مضاعفة (B)، وينبغي رسم البيانات والوساطات مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​تحديدها كما هو موضح في النص، وأشارت في الزرقاء (إشارة الحد العلوي أو URL والحد الأدنى المرجعية أو LRL. ( C)). الفرق بين الوسيط وURL وLRL تحديد حجم أشرطة الخطأ في الرسم البياني (مظللة باللون الأخضر الفاتح). تم تعديل هذا الرقم من ماكدونالد وآخرون 31 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)الشكل 4. إضافة ذوبان RGD الببتيد يؤدي إلى ورقة المرجعة. وخلال المعالجة وبعد إضافة لالببتيد RGE التي تحتوي على، تواصل رقة خلية للمضي قدما. 15 ثانية بعد إضافة لالببتيد التي تحتوي على RGD، هناك انخفاض في صفاحات على حافة الرائدة (تدرج). بعد 30 ثانية إضافية، وتبدأ الورقة إلى التراجع، وتراجع الذي يستمر خلال مدة الفيديو (إجمالي طول الفيديو ~ 5 دقائق، انظر فيديو 2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
كانت ملطخة الشكل 5. المناعي الفحص. الخلايا مع أجسام مضادة لالمجال الحفاز لMMP14a (أحمر) و counterstained مع fluorescently المسمى (488) phalloidin (الأخضر) و / أو دابي(الأزرق). (A) و (B) يمثل ورقة 4 ساعة النموذجية المنبثقة عن نطاق بينما (C) و (D) تظهر جزء من ورقة 24 ساعة نموذجية. وقد تم نقل كل الصور في 400X التكبير. لاحظ أن شدة MMP14a تلطيخ أعلى في طليعة من أوراق الخلايا الناشئة (ينظر في (ب) و (D)) وأقدام صفاحية بارز وينظر في الخلايا زعيم (A) و (C)). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية لنجاح ثقافة خلية قرنية النباتى هو السماح للنطاق التمسك الطبق الثقافة لحوالي 2-3 دقائق قبل إضافة مستنبت. ما يقرب من 75٪ من المقاييس ستلتزم وتنمو ورقة (وعدد من الثقافات التي أنشئت لكل تجربة تحتاج إلى تعديل وفقا لذلك). أوراق خلية قرنية لا تشكل حول كل نطاق وإزالتها من الأسماك ووضعها في الثقافة لعدة أسباب. أولا، دابي تلطيخ إإكسبلنتس يكشف عن أن بعض المقاييس لديها عدد قليل من الخلايا المرفقة، وبالتالي من المتوقع أن هذه المقاييس لن يكون ورقة من keratocytes. ثانيا، قدرة إإكسبلنتس التمسك طبق زراعة الأنسجة هي شرط أساسي للهجرة ورقة. أحد المحددات الرئيسية للما إذا كانت المقاييس تلتزم وثقافة يزدرع ناجحة يتم تأسيس هو الوقت المناسب بين وضع المقياس على سطح النمو، وإضافة وسائل الإعلام. الوقت غير كاف على الالتزام دون وسائل الاعلام سيؤدي إلى جداول floatinز في وسائل الإعلام (وأحيانا مع الأنسجة مرئية المرفقة)، في حين لفترة طويلة جدا وسوف فترة يؤدي إلى قشور ملتصقة مع أي نمو (المقرر يفترض أن تجفيف للخروج من يزدرع مع بقايا الخلايا مرئية على حافة بيع). الوقت بين وضع الحجم في صحن وإضافة النمو المتوسطة قد تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا، وعوامل مثل درجة الحرارة والرطوبة داخل غرفة المختبر قد تؤثر على كيفية خلايا السرعة التي يمكن التمسك الطبق دون جفاف.

ورغم أن عدد، والأجسام المضادة المحددة الزرد المتاحة تجاريا آخذ في الازدياد، مجموعة متنوعة من الكواشف المتاحة يمكن أن تحد. ويعتبر وتناظر 85٪ بين مستمنع والبروتين المستهدف عادة ضرورية لمتصالبة. ومع ذلك، مجالات وظيفية مثل المواقع المفعلة، ومواقع التفاعل البروتين البروتين، ومواقع للتعديل هي أكثر الحفظ من مناطق أخرى من البروتين، يمكن أن الأجسام المضادة المعادية للالببتيد الموجهة إلى هذه المناطق تكون في كثير من الأحيانتستخدم حتى لو التماثل الكلي منخفضة. على سبيل المثال، على الرغم من MMP14a الزرد له هوية الإجمالية 68٪ مع ortholog البشري (نتوقع قيمة = 0)، وجزء من زيادات الهوية إلى 79-96٪ في المواقع الحفازة وبروتين ملزمة بينما مواقع قطع وبالمثل الحفظ جدا 31. وتشير البيانات إلى أن الأجسام المضادة توجيه إلى موقع نشط حفاز من MMP14a البشري عبر يتفاعل مع الزرد keratocytes الثقافات. اقتراح أن تلطيخ في أوراق الزرد قد توطين للخلايا امتدت في طليعة 31 يتسق مع بيانات أخرى تشير إلى أن MMP14 قد تكون بمثابة جهاز استشعار الميكانيكية 32.

وليس من الممكن لخلق يزدرع معقمة تماما من الأسماك السباحة في مياه الأحواض المائية غير المعقّم. كما تم الانتهاء من معظم التجارب لدينا في غضون 24 ساعة، نختبر أي مشاكل مع التلوث الجرثومي أو الفطري من إإكسبلنتس. ومع ذلك، عندما يتم المطلوب فترات حضانة أطول، والحفاظ على العقم سقد تصبح إإكسبلنتس F قضية. عند التخطيط لتجربة تنطوي 3 أيام أو أكثر من الحضانة، واتخاذ العديد من الاحتياطات لزيادة احتمال أن الثقافات لا تزال غير ملوثة. أولا، لتقليل الحمل البكتيري، يسمح الأسماك على السباحة لمدة 1 ساعة في 3 تغييرات من جديد، إزالة الكلور ماء الصنبور مع أو بدون إضافة 100 ميكروغرام / مل الكانامايسين. ثانيا، يتم تبادل وسائل الإعلام على أساس يومي للحفاظ على مستويات كافية من المضادات الحيوية وتقليل عدد البكتيريا الحالية. للحضانات طويلة ولا سيما (> 5 أيام) يتم تنفيذ ثلاثة يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X مع بعضها الصرف سائل الإعلام. ومع ذلك، وهذا يدخل متغير التي يجب أخذها بعين الاعتبار في التصميم التجريبي عندما يتم التعامل مع الثقافة يزدرع مع مركب خارجي لأن هذا سوف تحتاج إلى استبداله مع وسائل الإعلام. وبالإضافة إلى ذلك، سيتم إزالة السيتوكينات وعوامل النمو التي يفرزها يزدرع مع بعضها الصرف سائل الإعلام. لكن، وكما عدد الخلايا منخفضة وحجم وسائل الإعلامهو كبير في خلية قرنية يزدرع نموذجي، وهذا التأثير قد لا تكون كبيرة.

كما قشور السمك تتطلب 3 أسابيع لتجديد كامل 33، ونحن نوصي السماح للأسماك لاستعادة لهذه الفترة من الزمن قبل استخدام المتكرر للأسماك في التجارب. على الرغم من أن إصلاح طبقة الظهارية يحدث أكثر من ذلك بكثير بسرعة، ونحن نفترض أن الانتظار هذه المدة الزمنية بين استخدام نفس السمك يقلل من فرصة للآثار الالتهابية الجهازية التي تم الإبلاغ عنها في الجلدي التئام الجروح في الأسماك 34.

منذ فترة طويلة تستخدم إإكسبلنتس لدراسة سلوك الخلايا الظهارية. إإكسبلنتس من مجموعة متنوعة واسعة من أنواع الأسماك والبرمائيات لها خصائص مماثلة متحركة على المستويات الفردية والجماعية الهجرة الخلية 3-6،35-37. هذه الخلايا لها خصائص تختلف اختلافا واضحا متحركة من إإكسبلنتس الثدييات ولكن يظهر الهيكل العام والتنظيم لديهم درجة عالية من التشابه 8،30،38 14.

لقد وجدنا أن هذا البروتوكول يسمح لنا لدراسة الهجرة الجماعية للkeratocytes الزرد باستخدام إإكسبلنتس الخلية الأولية أن نموذج المراحل المبكرة من التئام الجروح 14. إجراء التجارب باستخدام الثقافات الأولية التي أنشئت حديثا يتجنب القضايا المرتبطة مرور التسلسلي الخلايا الأولية أو استخدام خطوط الخلايا المتحولة. ويمكن استخدام إإكسبلنتس لدراسة دور EMT في الجلدي التئام الجروح كما بدأت EMT عندما يتم تأسيس الثقافات. دراساتنا تشير إلى أن هذه إإكسبلنتس الأولية تحاكي بشكل أكثر دقة السلوك الطبيعي والهجرة من keratocytes داخل الطبقة الظهارية جرح في الجسم الحي. يوفر هذا البروتوكول الأساس لإنشاء الثقافات الأولية لاستخدامها في المقايسات الهجرة وكذلك لفحص التغيرات في الجينات و / أو البروتين التعبير في مجموعة وعلى ما يبدو لا نهاية لها من كونديت التجريبيةأيونات. الإجراءات هي سريعة وسهلة وغير مكلفة، قابلة للتكرار، ومناسبة للاستخدام في أي مؤسسة بحثية.

وباختصار، توفر هذه التقنية يزدرع مقايسة السريع للهجرة الجماعية خلية في سياق نموذج التئام الجروح التي تمر EMT. وجود العديد من أنواع الخلايا في طبقات متعددة لجدول توجيه يوفر التعقيد إلى هذا فيفو السابقين نظام الثقافة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من جانب صناديق من الغرب الأوسط الكلية الجامعية للعلوم الصحة منح البحوث تسهيل منح لEEH ومكتب جامعة الغرب الأوسط للبحوث والبرامج التي ترعاها منحت جماعية غرانت إلى KJL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) MatTek P35GC-1.5-14-C 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 VWR 21909-460 We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
  2. Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
  3. Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
  4. Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
  5. Kolega, J. The Movement of Cell Clusters. J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).
  6. Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
  7. Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
  8. Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
  9. Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
  10. Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
  11. Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
  12. Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
  13. Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
  14. McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
  15. Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
  16. Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
  17. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
  18. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
  19. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).
  20. Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).
  21. Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
  22. Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
  23. Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
  24. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  25. Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
  26. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
  27. Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
  28. Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
  29. Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
  30. Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
  31. McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
  32. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
  33. Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
  34. Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
  35. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
  36. Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
  37. Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
  38. Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 96، الهجرة الخلية الجماعية، reepithelization، الزرد، خلية قرنية، الظهارية للانتقال الوسيطة، التصاق خلية خلية، الجلدي التئام الجروح
الزرد خلية قرنية إإكسبلنتس لدراسة الهجرة الجماعية خلية وعودة التظهرن في شفاء الجروح الجلدية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rapanan, J. L., Pascual, A. S.,… More

Rapanan, J. L., Pascual, A. S., Uppalapati, C. K., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing. J. Vis. Exp. (96), e52489, doi:10.3791/52489 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter