Summary
斑马鱼角膜基质细胞的表外植迁移，并提供了一个体外模型集体细胞迁移的上皮伤口愈合的情况下机制的研究。这些协议的细节，以建立初级外植体培养在集体细胞迁移测定法使用的有效方式。
Abstract
由于其独特的游动性，鱼角膜分离从外植体培养物早已被用于研究单个细胞迁移的机制。然而，当外植体建立，这些细胞还集体移动，保持了许多这使得个体角膜一个有吸引力的模型来研究移民的特点：蠕动较快速度，广泛的肌动蛋白丰富的片层具有垂直肌动线，相对恒定的速度和迁移的方向。在早期的外植体，细胞与那些迁移统称单独迁移的快速互允许的细胞 - 细胞粘连在确定迁移模式中的作用的研究，并强调迁移的两种模式之间的分子联系。在后来的外植体的细胞失去其迅速地和集体迁移能力，上皮至间质转变发生和伤口愈合和炎症相关的基因的差异表达。因此，角膜外植体可以作为一种体外模型为皮肤创伤愈合过程中发生，并且可以代表一个独特的系统来研究集体细胞迁移的机制中所定义的基因表达的变化方案的情况下的表皮细胞再生。多种突变体和转基因斑马鱼线是可用的，其允许外植体可以从鱼具有不同遗传背景的确立。这允许不同的蛋白质，这些过程中的作用，以唯一地寻址。这里所概述的协议描述一种简单而有效的方法，用于在各种相关的集体细胞迁移测定的建立这些外植体培养中使用。
Introduction
细胞运动性的研究已经传统上集中于单独迁移细胞。角膜从鱼类和两栖类植培养已证明是一个功能强大的模型系统使用实验和数学建模方法1-6来研究细胞运动的机制。上单独迁移细胞的实验工作是由细胞的快速，平稳的滑行动作的帮助下，同时保持一个统一的形状，速度和方向。然而， 在体内 ，细胞频繁移动的统称，同时保持细胞-细胞连接，尤其是在胚胎发育，伤口愈合，和转移。因此，集体细胞迁移是研究细胞迁移的领域内不断增长和日益突出的区域。这些细胞的迁移集体最近被描述7，它有很多独特的功能，这使它成为一个强大的系统来研究集体细胞迁移的伤口愈合模型。
ove_content“>当秤从麻醉的成年斑马鱼弹拨，一些上皮组织保持附着到刻度的底面。当细胞培养基中加入，这些上皮细胞，或角膜，快速地迁移至自规模集体单元的外植体培养物可被看作是一种上皮伤口愈合模型中，其中细胞远离外植体，因为它们会在整个伤口床，以重新建立完整的上皮的临时基质迁移。最近的数据表明，这种体外培养模仿的许多特征在体内在成年斑马鱼伤口愈合。伤口闭合率8转换为类似于在体外系统7观察到的迁移速度，另外， 在体内伤口愈合模型中，与华法林治疗表明，止血对率没有影响愈合，而用氢化可的松治疗，以降低免疫反应不耽误表皮细胞再生8这里介绍的协议描述了如何建立斑马鱼角膜外植体培养，以确保在许多生物测定使用的一致性和可重复性。这些外植体培养在集体细胞迁移的体外模型中特别引人注目的几个原因。首先，斑马鱼角膜是建立植文化小时内使用原代细胞。因此，这些细胞未经历与主细胞9-13的通道相关联的形态和基因表达的变化。其次，该系统是一款型号为表皮细胞再生的响应研究伤人14，作为回应伤人，上皮间质潮流的一部分启动ansition（EMT）的过程就证明了基因表达的变化和细胞骨架重排14,15。因此，发生在未处理的细胞中的基因表达和运动的背景变化已被鉴定并提供了一个上下文来解释与治疗的变化。另外，鱼角膜和人类角质形成细胞在功能上是等效的;两者均为各自物种的初级上皮细胞和播放在上皮伤口愈合的关键作用。第三，成年斑马鱼正获得承认作为模型系统，适用于各种包括黑素瘤和其它癌症19-21，皮肤伤口愈合8,14和组织再生22-24人类疾病16-18中。
这个模型系统的技术优势也同样引人注目。可从非营利性的，集中的设施越来越多的突变和转基因株系。具体而言，斑马鱼突变项目（ZMP）在威康信托基金会桑格研究所的目标是创建在每个蛋白质编码基因的斑马鱼基因敲除等位基因。目前，他们已经突变11892个基因，基因组的大约45％，具有24088的等位基因特征。另外，ZMP接受建议，并会产生剔除装置收费。最近的基因敲除的方法在幼虫和成年斑马鱼25-28提供了灵活性，研究发育的重要基因，这些基因转基因方法是有问题的或不切实际的功能。
由于它们的非常迅速的〜145微米/小时运动速率建立培养物29后不久，测定可以迅速地完成（一般在24小时以下）。由于实验可以迅速完成，文化发展以及在室温，用几个涉及视频显微镜哺乳动物细胞迁移试验是避免相关的技术障碍。此外，在紧缩研究预算的年龄，斑马鱼肥胖是容易且廉价地维护。
外植体的结构和行为是复杂的。作为当比例尺被去除鱼不流血，这是不可能的比浅表皮层得多的规模被除去。角膜细胞似乎是主要的细胞类型的外植体时秤最初从鱼除去细胞的绝大部分出现染色用抗E-钙粘蛋白抗体14。此外，没有任何证据表明在初始培养的成纤维细胞作为判断不存在波形蛋白染色通过免疫荧光14。但是，随着反复除垢，似乎有在植众多嗜中性粒细胞（见视频1）。当暴露于LPS我们已经确定了这些细胞作为基于它们的大小，迅速地运动，并且其迁移出电池板的形态观察结果的中性粒细胞（数据未示出）。此外，这些细胞染色鲜艳的智慧h的抗体，以嗜中性粒细胞胞质因子，以及与各种次级IgG抗体，这表明它们具有在其表面上丰富FcR的（数据未示出）。多个细胞层是外植体中存在。共焦显微镜揭示邻近前缘的单个层的存在，以在靠近刻度角膜的两个以上的层，嗜中性粒细胞可见上方，下方，和之间的细胞角膜片。
在早期时间点，将细胞在多层植两极分化的边缘，引发角膜的集体的迁移，从外植体以约145微米/小时的初始速率。涵盖的外植体的面积急剧增加，从而导致细胞的片内扩散，张力，并前进前缘的下降速率。领导者和从动单元之间快速互变是在前缘的自发形成的孔的片材7内的形成和封闭过程中观察到的。由于与外植体开始的EMT过程继续，片材片段和角膜细胞失去其专业化，快速运动。于7天培养的基因表达，并与EMT一致的形态变化，伤口愈合，和炎症反应发生植正在考虑可行大约10天14。
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Protocol
该协议符合AVMA动物福利原则实验动物的照顾和使用，已被批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在中西部的大学。
1.准备麻醉，设备，及媒体
- 脱氯约1.5升使用一个商业脱氯剂（可在宠物商店），或者通过让水静置24小时自来水。获得3 1升的烧杯中，并填写每用500毫升水脱氯。标签之一任何操作之前，拿着鱼和一个用于恢复。到第三烧杯中，加入三卡因甲磺酸盐的100微克/毫升;这将成为其中的鱼类会被麻醉的烧杯中。
- 填充浅盘用冰冷却，温热的培养基（RPMI 1640,10％FBS（胎牛血清），50微克/毫升庆大霉素，100μg/ ml的卡那霉素，25毫米的HEPES）至RT，并收集干净珠宝商的镊子。干净的镊子由音麦唱在70％的乙醇的前端，并穿过本生灯，允许乙醇以烧掉。
- 决定是否将被放大，而不执行的程序，与商业，台式照明放大镜2 - 10X放大倍率，或解剖显微镜（完全依赖于个人偏好）。
2.建立植文化
- 捉在保持烧杯鱼和地点的所需数目。传输单个鱼麻醉烧杯中;最好是单独麻醉鱼。
- 监测麻醉通过观察鱼的游泳和鳃运动的影响。随着麻醉的进展，刺运动减慢，鱼会游泳不正常，经常倒挂;考虑鱼只要鳃运动停止麻醉。不要让鱼更长时间的麻醉洗澡，因为这可能会导致鱼的死亡。
- 从麻醉烧杯并转移除去鱼冰，水平放置鱼面临的手拿着镊子的尾巴。如果经历了该技术，如果多个鱼将被用于制造植体，考虑在此时将所述下一个鱼在麻醉烧杯中。
- 要去除鳞屑，位置镊子平行与尖鱼的规模优势。踩下镊子的平侧面略成鱼的侧，以使刻度从鱼的身体提升。把握规模镊子，勇气，和地点（无反转）在组织培养皿。重复该过程，除去一个最大值，从一个大的成人（6从各侧）12秤，避免了鳃区域，侧线，和翅片。
- 将鱼放入烧杯中恢复和监控，以确保它从麻醉的效果恢复。此时，鱼可以被转移回单个罐。让鱼恢复了至少21天，以便完整规模的再生。
- 根据实验设计，将高达塑料35mm组织培养处理的培养皿20天平或4 - 每个玻璃底菜6尺度。让秤坚持的菜才轻轻添加媒体以免分离从盘刻度。
注意：使用的经验，前介质被添加到第一盘的多个鱼都可以加工。 - 添加1.2毫升完整的媒体（见1.2以上）到每个35mm培养皿。
- 在5％CO 2孵育优选外植体培养在28℃的时间有或没有额外的处理所需的时间。另外，孵育在加热的显微镜阶段或活细胞培养室视频显微镜内的文化。
3，明场和视频显微镜
- 含有细胞片上显微镜阶段，最初位置菜肴聚焦用4X物镜。
注：较高的放大倍数也可以使用，这取决于实验。标记的位置每个电池板和/或在舞台上的菜取向将有助于拍摄图像随着时间的推移与片材在大致相同的方向。 - 去除碗碟从培养箱和照片在不同时间点，根据每个实验方案，并放置放回培养箱如果需要在实验时间帧仅静止图像。
- 在执行视频显微镜，要注意以下几点：
- 定位的视场，使得迁移细胞片仍然在视为视频的持续时间的字段中的尺度/新兴细胞片。
注意：这可能需要在观察细胞如何从规模下，迁移了一些经验。对于短视频，这是不到更长的录像的关注。 - 对于较短的时间框架，在室温下孵育。对于较长的时间段（18+小时），使用加热阶段或孵化室要保持温度，酸碱度平衡，并尽量减少文化米蒸发edium。
- 定位的视场，使得迁移细胞片仍然在视为视频的持续时间的字段中的尺度/新兴细胞片。
4.固定的免疫荧光显微镜
- 准备和预暖的所有解决方案，以28°C。为了查看角膜荧光下，上面用玻璃底的35mm组织培养皿中所描述的增长外植体文化。另外，使用玻璃玻片。
- 在1.1倍PBS添加0.8毫升4％多聚甲醛的每一道菜。不先取出培养基。 在室温下孵育5分钟，然后吸出，除去该溶液中。
- 在1.1倍PBS添加0.8毫升4％多聚甲醛的每一道菜。在室温下孵育5分钟，然后吸出，除去该溶液中。
- 除非使用外部配体或外部的表位，通透细胞在1X PBS中加入0.5ml的0.2％的Triton X-100。在室温下孵育5分钟，然后吸出，除去该溶液中。
- 加毫升1％的0.5 BSA的1×PBS中并孵育1小时（RT）或O / N（在4℃）。
注：根据实验条件，PHAlloidin可以在这个步骤中加入。 - 孵育后，吸出物，除去溶液，并继续进行抗体染色。在4℃4周 - 2毫升1％的BSA在1×PBS中进行3 - 可替代地，通过将至少1存储培养皿。
5.免疫荧光协议
- 根据制造商的建议制备初级和次级抗体溶液。
注意：如果制造商的建议都无法使用，一个良好的开端稀释的初级抗体（以在1×PBS中的1％BSA）为1：500的多克隆和1：1000用于单克隆抗体;一个良好的开端稀释的二抗是1：1000。调节从制造商处获得更高的原始股票的这些稀释液，如果信号较弱，低级如果信号强和背景是一个问题。 - 吸在1×PBS溶液中的1％BSA中。加入0.5毫升初级抗体溶液孵育1小时（RT）或O / N（在4℃）。 除去第一抗体溶液，放入一个干净的和标记的1.5 ml离心管，并冷冻在-20℃。
注意：这允许第一抗体的再利用，如果需要的话。 - 与1X PBS 5次，删除和每次冲洗后丢弃的PBS - 洗碟3。
- 加入0.5毫升二抗溶液。如果需要的话，在该步骤中添加荧光标记的鬼笔环肽（以下任何制造商建议的浓度）。孵育1小时（RT）或O / N（在4℃）。
注：使用荧光标记的鬼笔允许肌动蛋白丝的可视化;我们已经发现，488标记的鬼笔环肽时，最好在我们的斑马鱼角膜，但其它的荧光团都可以使用。 - 取下并丢弃二抗溶液。
- 与1X PBS 5次，删除和每次冲洗后丢弃的PBS - 洗碟3。
注：该盘可以存储，涵盖了从光，在4℃，如果无法争夺瓦特立刻;请确保的1×PBS被加入到培养皿存储，以确保细胞不干燥而温暖至室温之前（20 - 30分钟），然后取出PBS中继续下一步骤之前，为了。 - 当准备观察，加2 - 3滴的安装介质，有或没有DAPI，根据实验需要，放入盘中，并让坐在在室温10分钟。
注意：我们使用市售的，基于甘油的安装介质用DAPI，但也可以使用其它的安装介质。允许10分钟用于安装介质坐在盘便于容易除去玻璃盖玻片从培养皿的底部。 - 孵化后，轻轻挤压在菜面松动并取出盖玻片。加安装媒体的附加压降到载玻片并放置盖玻片，将细胞下来，到滑动。
注意：考虑密封盖玻片使用明确指甲油滑动如果滑动需要保持时间超过1 - 2天。 - 观察在荧光显微镜下的幻灯片。
注：我们的大多数的图像被下使用油浸一个40X或63X物镜拍摄，但具体的物镜使用将取决于实验方案。
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Representative Results
如示于图1中 ，角膜的片可以观察到从规模下建立的外植体培养的小时内迁移出去。有时，单独移植角膜已经从集中迁移片剖开可以观察到。另外，作为外植体是从已被预先弹拨鱼成立，有丰富的嗜中性粒细胞通过片材迁移。在较长的文化时期，角膜板碎片为细胞进行EMT 14。
片前进的初始速率是极其迅速，但这个速率很快变慢作为细胞扩散（面积和核间距离，该距离增加〜1.8测量和〜3.1倍，分别）在第一个48小时培养物（ 图2A-C）。的快速增加不与细胞增殖相关联;为24小时，与荧光胸苷类似物乙炔基脱氧尿苷标记后（EDU），〜细胞的10％表现出细胞分裂的证据，速度比见于转化的细胞系，但与涉及reepithelization人体器官培养物30中的细胞更一致的低得多。在稍后的时间，片材的片段（与本系统14中观察到的EMT相关联的现象），这使得所述前缘的前进难以测量。
24小时后，覆盖片的区域中，可以作为一个快速屏幕化合物以改变集体细胞迁移15,31的能力。当处理被添加在植体建立的时间，剂量反应在片面积可以看到。一些哺乳动物的细胞因子（ 例如 ，TGF-1 15），趋化因子（如CXCL12）和小分子抑制剂最初特征在哺乳动物系统（ 例如 ，MMP-2，-9，-13和抑制剂31）已经被成功地使用。然而，如在24小时片区域不是正态分布（
在许多情况下，治疗上集体迁移（S）的作用在较短的时间内被观察到。在这些情况下，视频显微镜可用于测定所述共同迁移片的治疗响应。当可溶性含RGD肽被加入到培养基中（ 图4中的第三面板）扰乱dhesion形成，所述薄片在所述片材的前缘迅速收缩和薄片分离和缩回的随后的前缘。作为整个片缩回，在不到2分钟，片材，以治疗的应答可以是迅速的。
为了评估片内或领导者和跟随者细胞内的蛋白质的定位，整个片可以固定和染色， 如图5。护理必须在固定处理可以取为细胞片很容易破坏。在我们手中，许多多克隆抗体对哺乳动物蛋白质的功能性结构域（特别是细胞质蛋白）已经发现交叉中的斑马鱼外植体反应。
图1.细胞片的集体迁徙。建立植培养后，角膜移植从规模作为一个集体单位的下方。 （A）中示出的细胞已迁移的距离尺度后仅2小时的培养，用的相对量（BE）取每小时此后（3 - 6小时，分别地）。所有图像拍摄放大100倍。整个序列示于视频1;一帧被带到每30秒超过6小时的时间。 请点击此处查看该图的放大版本。
图集体迁移2.特征。提前前缘的初始速率，在几个点测量，是迅速但是第24小时，在培养物（A）的过程中速度变慢。使用C核间距和单元面积的测量ultures固定在4和24小时，并用DAPI染色和鬼笔环肽作为参考指示在同一时间内，两核间的距离（从每个核的中心测量）和单元面积的增加（测量为区域包围的皮质肌动蛋白细胞骨架，（B）和（C）的分别）。每个图表示一式三份三次独立实验的平均值（±SEM）。这个数字已经被修改Rapanan 等 7 请点击此处查看该图的放大版本。
图集体迁移3.测定使用细胞片区域，当建立了培养过程中添加到培养基中，PEPTIDE Z-PLG-NHOH（广谱MMP）和小分子SB-3CT（MMP2和9特定）抑制剂24小时的文化（A）后，降低电池板面积。作为未处理的细胞片层的面积指数分布（B）中 ，数据应被绘制为中位数与如文中所述和在蓝色（参考上限或URL和下基准限制或LRL指示所确定的中值的标准误差;（ C））。中位数和URL和LRL之间的差确定图上的误差棒的尺寸（阴影浅绿色）。这个数字已被修改，麦当劳等 31 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.免疫荧光测定。细胞用的抗体MMP14a（红色）的催化结构域和counterstained与荧光标记的（488）鬼笔环肽（绿色）和/或DAPI（蓝色）。 （A）和（B）中表示一典型的4小时片摆脱规模而同时（C）和（D）示出一个典型的24小时片的一部分。所有图像都采取400倍的放大倍率。需要注意的是MMP14a染色强度是新兴的细胞片的前缘（出现在（B）和（D））和突出的伪足较高被看作中的佼佼者细胞（A）和（C））。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
对于角膜移植培养的成功的最关键的步骤是使刻度附着到培养皿约2 - 除了培养基的前3分钟。大约鳞的75％将附着和生长片材（将需要建立每个实验培养物的数量，以进行相应的调整）。角膜片不形成围绕每个尺度从鱼取出，并放置在培养有几个原因。首先，外植体的DAPI染色揭示了一些鳞有少数细胞附着，因此，预计这些尺度不会有角膜的表。其次，外植体要坚持组织培养皿的能力是板材迁移的必要先决条件。天秤是否坚持建立一个关键决定因素，一个成功的植文化是把规模上的增长面和增加媒体之间的时间。没有足够的时间没有媒体要坚持将导致尺度莲花灯媒体克（有时可见组织附后），而时间过长会导致附着尺度与无增长（可能是由于晒出与细胞残余在售的边缘可见植体）。刻度放置在培养皿，并加入生长培养基之间的时间可能需要通过实验确定，由于因素，如温度和湿度的实验室房间内，可影响细胞如何快速可以附着在培养皿不会干燥。
虽然商购的，斑马鱼特异性抗体的数量在不断增加，各种可用的试剂可以是限制性的。一个同源免疫原和靶蛋白之间85％的通常认为有必要对交叉反应性。然而，由于功能性结构域如活性中心，蛋白质 - 蛋白质相互作用位点，和修改的位点比蛋白质的其它区域更保守，针对这些区域的抗肽多克隆抗体可以经常是使用，即使整体同源性是低的。例如，尽管斑马鱼MMP14a具有其人力直系同源的整体68％的同一性（预期值= 0），身份增大到79的级分- 96％的催化和蛋白结合位点而切割位点被类似高度保守31。数据表明，抗体针对人MMP14a的催化活性位点交叉反应与斑马鱼角膜培养物。在斑马鱼片染色可定位于拉伸细胞在前缘31中的建议是与其他数据表明MMP14可作为机械式传感器32保持一致。
这是不可能的，从鱼游泳水族馆未消毒的水中创建一个完全无菌的外植体。由于我们大部分的实验，在24小时内完成，我们遇到细菌或真菌外植体的污染没有问题。然而，当较长潜伏期的需要，保持无菌Ø˚F植可能成为一个问题。当规划涉及培养3天或更多天的实验中，数个预防措施以增加的可能性，该培养物保持未污染。首先，为了减少细菌负荷，鱼被允许在新鲜3变化游约1小时，脱氯自来水加或不加100微克/毫升卡那霉素。其次，媒体交换，每天保持抗生素适当水平，并减少任何存在的细菌的数量。对于特别长的孵化（> 5天）洗三次与1X PBS与每个媒体交换进行。然而，这引入了必须在实验设计中考虑时，外植体培养物与外源性化合物处理，因为这将需要更换与媒体的变量。此外，细胞因子和生长因子的外植体分泌将与每个媒体交换除去。然而，由于细胞数量低，介质的体积大在一个典型的角膜外植体，这种效果可能不显着。
如鱼鳞需要3周完全再生33，我们建议使鱼恢复为这一段时间前反复使用在实验的鱼。尽管重整上皮层发生更加迅速，我们假设在等待使用相同鱼之间的时间长度最小化的机会已经报道在皮肤伤口愈合的鱼34的全身炎症反应的影响。
外植体早已被用于研究上皮细胞的行为。从广泛的各种鱼类物种和两栖动物植有在个人和集体细胞迁移水平3-6,35-37类似的能动属性。这些细胞具有比哺乳动物植码子能动属性，但整体结构和组织似乎有相似8,30,38的高度14。
我们已经发现，这协议允许我们研究使用原代细胞外植体是模拟伤口的愈合14的早期阶段，斑马鱼角膜的集体迁移。使用新建立的原代培养物进行实验避免了与原代细胞的连续传代或使用转化的细胞系的相关的问题。植可用于研究的EMT的作用，在皮肤伤口愈合时培养物均建立为EMT被启动。我们的研究表明，这些初级外植体更精确地模仿伤员皮层体内内角膜的自然行为和迁移。这个协议提供了用于建立原代培养物用于在迁移测定用途以及用于检查实验康迪特的无休止阵列改变基因和/或蛋白质表达的基础离子。手续快速，简便，价格低廉，重现性好，适合在任何研究机构。
总之，本植技术提供了一种快速测定法，其中正在经历EMT的伤口愈合模型的上下文集体细胞迁移。数种细胞类型的多层带在定向刻度的存在提供复杂本体外培养系统。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由卫生科学中西部大学基金研究促进格兰特授予英皇酒店与研究中西部大学办公室和赞助节目校内格兰特授予KJL支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
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