Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Zebrafisk Keratocyte Eksplantater at studere Kollektiv Cell Migration og reepitelisering i kutant Sårheling

Published: February 25, 2015 doi: 10.3791/52489

Summary

Zebrafisk keratocytter migrere i celle plader fra eksplantater og give en in vitro model for studiet af mekanismerne i kollektiv celle migration i forbindelse med epitelial sårheling. Disse protokoller detalje en effektiv måde at etablere primære eksplantatkulturer til brug i kollektive celle migration assays.

Abstract

På grund af deres unikke bevægelige egenskaber, fisk keratocytter adskilles fra eksplantatkulturer længe har været anvendt til at undersøge mekanismerne for enkelt celle migration. Men når eksplantater er etableret, disse celler også flytte kollektivt, vedligeholdelse mange af de funktioner, der gør individet keratocytter en attraktiv model til at studere migration: hurtige satser af motilitet, omfattende actin-rige lameller med en vinkelret actin kabel og relativt konstant hastighed og retning af migration. I begyndelsen af ​​eksplantater, den hurtige omdannelse af celler migrerer individuelt med de migrerer kollektivt tillader studiet af den rolle, celle-celle sammenvoksninger at bestemme tilstanden af ​​migration, og understreger de molekylære forbindelser mellem de to former for migration. Celler i senere eksplantater mister deres evne til at migrere hurtigt og kollektivt som en epitelial til mesenkymale overgang forekommer, og gener, der er forbundet med sårheling og inflammation udtrykkes forskelligt. Således kan keratocyte eksplantater tjene som en in vitro model for reepitelisering, der opstår under kutan sårheling og kan repræsentere et unikt system til at studere mekanismer for kollektive cellemigrering i forbindelse med en defineret program af genekspression ændringer. En række af mutante og transgene zebrafisk linjer er tilgængelige, som giver eksplantater oprettes fra fisk med forskellige genetiske baggrunde. Dette tillader rolle af forskellige proteiner i disse processer til entydigt rettet. Protokollerne beskrevet her beskriver en nem og effektiv fremgangsmåde til etablering af disse eksplantatkulturer til anvendelse i en række assays relateret til kollektiv cellemigrering.

Introduction

Undersøgelser af cellemotilitet har traditionelt fokuseret på individuelt migrerende celler. Keratocytter dyrket fra fisk og padder eksplantater har vist sig at være et effektivt modelsystem til at studere mekanismerne i cellemotilitet hjælp af både eksperimenterende og matematisk modellering 1-6. Eksperimentelt arbejde individuelt migrerende celler er hjulpet af den hurtige, glatte glidende bevægelse af cellerne, og samtidig opretholde en ensartet form, hastighed og retning. Men in vivo celler ofte flytte kollektivt samtidig opretholde celle-celle-kryds, især under embryogenese, sårheling og metastase. Således kollektiv celle migration er et voksende og stadig mere fremtrædende forskningsområde inden for celle migration. Den kollektive migration af disse celler er for nylig blevet beskrevet 7 og det har mange unikke egenskaber, som gør det et kraftfuldt system til at studere kollektivt cellemigration i sårheling model.

ove_content "> Når skalaer er plukket fra en bedøvet voksen zebrafisk, forbliver nogle epitelvæv fastgjort til undersiden af ​​skalaen. Når der tilføjes cellekulturmedium, disse epitelceller eller keratocytter, migrere hurtigt som en kollektiv enhed fra skalaen. Den eksplantation kultur kan ses som en epitelial sårheling model, hvor cellerne migrerer væk fra eksplantatet, som de ville tværs midlertidig matrix af en sårbunden at genetablere et intakt epitel. Nylige data tyder på, at denne ex vivo kultur efterligner mange funktioner i in vivo sårheling hos voksne zebrafisk. sårlukning satser 8 oversætte til en migration hastighed svarende til den observeret i ex vivo-systemet 7. Endvidere i en in vivo sårheling model, behandling med warfarin antyder, at hæmostase har nogen effekt på pris for helbredelse, mens behandling med hydrocortison at mindske immunrespons ikke forsinker reepitelisering 8

Protokollen præsenteres her beskriver, hvordan man etablerer zebrafisk keratocyte eksplantatkulturer der sikrer ensartethed og reproducerbarhed til brug i mange biologiske assays. Disse eksplantatkulturer er en særlig overbevisende in vitro model for kollektiv cellemigration af flere grunde. Først zebrafisk keratocytter er primære celler, der anvendes inden for timer efter oprettelse eksplantatkulturer. Derfor har disse celler ikke har undergået de morfologiske og genekspression ændringer i forbindelse med passage af primærelementer 9-13. For det andet udgør denne ordning en model for studiet af reepitelisering som reaktion på såret 14 og som en del af svaret på såret, en epitelial til mesenkymale transition (EMT) proces initieres som vist ved ændringer i genekspression og cytoskeletale omlejringer 14,15. Således har baggrunden ændringer i genekspression og motilitet, som forekommer i ubehandlede celler er blevet karakteriseret, og giver en forbindelse til at fortolke ændringer med behandling. Endvidere fisk keratocyte og den humane keratinocyt er funktionelt ækvivalente; begge er de primære epitelceller fra deres respektive arter og spiller en central rolle i epitel sårheling. Tredje voksen zebrafisk vinder anerkendelse som et modelsystem til en række humane sygdomme 16-18 herunder melanom og andre cancere 19-21, kutan sårheling 8,14 og vævsregenerering 22-24.

Tekniske fordele ved dette modelsystem er lige overbevisende. Et stigende antal mutante og transgene linjer er tilgængelige fra non-profit, centraliserede anlæg. Specifikt zebrafisk Mutation Project (ZMP) På Wellcome Trust Sanger Institute har til formål at skabe en knockout allel i hvert proteinkodende gen i zebrafisk genom. I øjeblikket har de muterede 11.892 gener, ca. 45% af genomet, med 24.088 alleler karakteriseret. Desuden ZMP accepterer forslag, og vil generere gratis knock-outs. Nylige metoder i gen knockdown i larver og voksne zebrafisk 25-28 giver fleksibilitet til at studere funktionen af udviklingsmæssigt vigtige gener for hvilke transgene metoder er problematiske eller upraktisk.

På grund af deres ekstremt hurtige satser for motilitet ~ 145 um / time kort efter etablering af kulturer 29, kan analyser afsluttes hurtigt (normalt i 24 timer eller mindre). Som forsøg kan gennemføres hurtigt og kulturer vokser godt ved stuetemperatur, flere af de tekniske forhindringer, der er forbundet med mammale celle migration assays involverer video mikroskopi undgås. Desuden i en alder af stramme forskningsbudgetter, zebrafish er nemt og billigt vedligeholdt.

Strukturen og adfærd eksplantatet er kompleks. Da fisken ikke bløder, når skalaen er fjernet, er det usandsynligt, at meget mere end de overfladiske epidermale lag fjernes med skalaen. Keratocytter synes at være den dominerende celletype i eksplantatet når skalaer indledningsvis fjernes fra fisk som størstedelen af cellerne synes at pletten med et anti-E-cadherin antistof 14. Endvidere er der ingen tegn på fibroblaster i den oprindelige kultur, bedømt ved fraværet af vimentin farvning ved immunofluorescens 14. Men med fjernelse gentagen skala, synes der at være mange neutrofiler i eksplantatet (se Video 1). Vi har identificeret disse celler som neutrofiler baseret på morfologiske observationer af deres størrelse, hurtigt motilitet, og deres vandring ud af cellen arket, når de udsættes for LPS (data ikke vist). Derudover disse celler farves lyst with et antistof mod neutrofil cytosol faktor såvel som med en række sekundære IgG-antistoffer, hvilket indikerer, at de har rigelige FcR'er på deres overflade (data ikke vist). Flere cellelag er til stede i eksplantatet. Konfokal mikroskopi afslører tilstedeværelsen af ​​et enkelt lag nær forkanten til mere end to lag keratocytter nær skala med neutrofiler synlige over, under og mellem celle keratocyte ark.

Ved tidlige tidspunkter, celler på kanten af ​​flere lag explant polarisere, indlede kollektive migration af keratocytter fra eksplantatet ved indledende satser ~ 145 um / time. Det område, som eksplantatet stiger hurtigt, hvilket fører til celle spredning, spænding i pladen, og en nedsat hastighed af forud for forkanten. Hurtige interomdannelser mellem leder og follower celler observeres på forkant under dannelsen og lukning af spontant dannede huller i arket 7. SomEMT indledt med eksplantatet fortsætter arket fragmenter og de keratocytter mister deres specialiserede, hurtige motilitet. Genekspression og morfologiske ændringer i overensstemmelse med EMT, sårheling, og inflammatoriske reaktioner forekommer inden for 7 dages dyrkning med eksplantater overvejes rentabelt for ca. 10 dage 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol er i overensstemmelse med AVMA dyrevelfærdsprincipper for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Midwestern University.

1. Fremstilling af anæstesi, Udstyr, og medier

  1. Dechlorinate ca. 1,5 L postevand ved hjælp af enten et kommercielt dechlorinating agent (findes på dyrehandlere) eller ved at lade vand stå i 24 timer. Opnå tre 1 L bægerglas og fylde hver med 500 ml dechlorerede vand. Mærk en til at holde fisk, før nogen procedure og én til nyttiggørelse. Til den tredje bægerglas, der tilsættes 100 ug / ml tricaine methansulfonat; det bliver bægeret, hvor fisken skal bedøves.
  2. Fyld en lavvandet bakke med is, varme dyrkningsmedium (RPMI 1640, 10% FBS (føtalt bovint serum), 50 ug / ml gentamycin, 100 ug / ml kanamycin, 25 mM HEPES) til RT og samle ren guldsmedens pincet. Rene pincet med Immersynge de gode råd i 70% ethanol og passere gennem en bunsenbrænder, så ethanolen at brænde ud.
  3. Beslut hvis proceduren udføres uden forstørrelse, med en kommerciel, table-top tændte forstørrelsesglas med 2 - 10X forstørrelse, eller dissektionsmikroskop (helt afhængig af personlig præference).

2. Etablere eksplantatkulturer

  1. Fang det ønskede antal fisk og sted på en bedrift bæger. Overfør en enkelt fisk til anæstesi bæger; er det bedst at bedøve fiskene individuelt.
  2. Overvåge virkningerne af anæstesi ved at observere svømning og Gill bevægelse af fisken. Som anæstesi skrider frem, bremser gælle bevægelser og fiskene vil svømme uregelmæssigt og ofte på hovedet; overveje fisk bedøvede så snart gælle bevægelse ophører. Lad ikke fisken i længere perioder i anæstesi badet da dette kan resultere i død af fisken.
  3. Fjern fisk fra anæstesi bægerglas og overførseltil is, placere fisken vandret med halen overfor hånd, der holder en pincet. Hvis oplevet med den teknik, og hvis flere fisk, skal bruges til at lave eksplantater overveje at placere den næste fisk i anæstesi bægerglas på dette tidspunkt.
  4. For at fjerne skæl, position pincet parallelt med fisk med spids ved kanten af ​​skalaen. Tryk flade side af pincet lidt ind i siden af ​​fisken til at forårsage skalaen at løfte fra kroppen af ​​fisken. Tag fat skala med en pincet, så riv og sted (uden inversion) i vævskulturskål. Gentag proceduren, fjernelse af maksimalt 12 skalaer fra en stor voksen (6 fra hver side), undgå gælle region, sidelinjen, og finner.
  5. Læg fisken i opsvinget bægerglas og overvåge for at sikre den genindvinder fra virkningerne af anæstesi. På dette tidspunkt, kan fisk blive ført tilbage til en enkelt tank. Lad fisken til at komme sig i mindst 21 dage for at tillade fuldstændig skala regenerering.
  6. Afhængigt afeksperimentelle design, placere op til 20 skalaer pr plast 35 mm vævskultur-behandlet fad eller 4 - 6 skalaer pr glasbund fad. Tillad skalaer at holde sig til fadet før forsigtigt tilføje medier for ikke at løsrive skalaer fra fadet.
    BEMÆRK: Med erfaring, kan flere fisk behandles, inden der tilsættes medier til den første skål.
  7. Tilsæt 1,2 ml komplette medier (se 1.2) i hver 35 mm skål.
  8. Fortrinsvis inkuberes eksplantatkulturer ved 28 ° C i 5% CO 2 for den ønskede periode med eller uden yderligere behandling. Alternativt inkuberes kulturer på en opvarmet mikroskopbordet eller inden for en levende cellekulturkammer til video mikroskopi.

3. Lysfelt og Video Microscopy

  1. Position skåle indeholdende celle plader på mikroskop scenen og i første omgang fokusere ved hjælp af 4X objektiv.
    BEMÆRK: Højere forstørrelse kan anvendes, afhængigt af forsøget. Mærkning placeringen afhver celle ark og / eller orientering af skålen på scenen vil gøre det lettere at tage billeder over tid med arkene i omtrent samme retning.
  2. Fjern retter fra inkubatoren og fotografere på forskellige tidspunkter, i henhold til hver forsøgsprotokol og sted tilbage i inkubatoren hvis kun stillbilleder er brug over eksperimentelle tidsramme.
  3. Under udførelsen af ​​video mikroskopi, være opmærksom på følgende:
    1. Placer skala / nye celle ark i synsfeltet, således at migrere cellelaget forbliver i synsfeltet for varigheden af ​​videoen.
      BEMÆRK: Dette kan tage lidt erfaring i at observere, hvordan celler migrerer fra under skalaen. For korte videoer, det er mindre bekymrende end for længere videoer.
    2. For kortere tidsrammer, inkuberes ved stuetemperatur. Ved længere tidshorisonter (18+ HR), så brug en opvarmet scene eller en inkubation kammer for at opretholde temperaturen, pH balance, og for at minimere fordampning af kulturen medium.

4. Fiksering for immunfluorescensmikroskopi

  1. Forberede og præ-varme alle løsninger til 28 ° C. For at se keratocytter under fluorescens, vokser eksplantatkulturer som beskrevet ovenfor under anvendelse glasbund 35 mm vævskulturskåle. Alternativt kan du bruge glas kammer dias.
  2. Tilføj 0,8 ml 4% paraformaldehyd i 1,1 x PBS til hver skål. Fjern ikke kulturmedier først. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min og derefter aspireres at fjerne opløsningen.
  3. Tilføj 0,8 ml 4% paraformaldehyd i 1,1 x PBS til hver skål. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min og derefter aspireres at fjerne opløsningen.
  4. Medmindre brug af eksterne ligander eller eksterne epitoper permeabilisere celler ved tilsætning af 0,5 ml 0,2% Triton X-100 i 1X PBS. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min og derefter aspireres at fjerne opløsningen.
  5. Tilsæt 0,5 ml 1% BSA i 1X PBS og inkuberes i 1 time (ved stuetemperatur) eller O / N (ved 4 ° C).
    BEMÆRK: Afhængigt af eksperimentelle betingelser, PHAlloidin kan tilsættes på dette trin.
  6. Efter inkubation suges fjerne opløsningen og fortsætte med antistoffarvning. Alternativt opbevares dyrkningsskålene ved tilsætning af mindst 1 - 2 ml 1% BSA i 1X PBS i 3 - 4 uger ved 4 ° C.

5. Immunofluorescens Protocol

  1. Forbered primære og sekundære antistofopløsninger henhold til producentens anbefalinger.
    BEMÆRK: Hvis fabrikantens anvisninger ikke er tilgængelige, et godt udgangspunkt fortynding af primære antistoffer (i 1% BSA i 1x PBS) er 1: 500 for polyklonale og 1: 1.000 for monoklonale antistoffer; et godt udgangspunkt fortynding for sekundære antistoffer er 1: 1000. Juster disse fortyndinger af den oprindelige bestand opnået fra producenten højere, hvis signalet er svagt, lavere, hvis signalet er stærkt og baggrunden er et problem.
  2. Aspirer 1% BSA i 1X PBS-opløsning. Tilsæt 0,5 ml primært antistof-opløsning og inkuberes i 1 time (ved stuetemperatur) eller O / N (ved 4 ° C). Fjern det primære antistof opløsning, anbringes i en ren og mærket 1,5 ml mikrocentrifugerør, og nedfryses til -20 ° C.
    BEMÆRK: Dette giver mulighed for genbrug af det primære antistof, hvis det er nødvendigt.
  3. Vask skålen 3-5 gange med 1x PBS, fjerne og kassere PBS efter hver vask.
  4. Tilsæt 0,5 ml sekundært antistof opløsning. Hvis det ønskes, tilsættes fluorescens-mærket phalloidin (efter enhver producentens anbefalede koncentration) i dette trin. Der inkuberes i 1 time (ved stuetemperatur) eller O / N (ved 4 ° C).
    BEMÆRK: Anvendelse af fluorescens-mærket phalloidin muliggør visualisering af actinfilamenter; har vi fundet, at 488-mærket phalloidin fungerer bedst i vores zebrafisk keratocytter, men andre fluoroforer kan anvendes.
  5. Fjern og det sekundære antistof løsning kassere.
  6. Vask skålen 3-5 gange med 1x PBS, fjerne og kassere PBS efter hver vask.
    BEMÆRK: Skålen kan opbevares, dækket mod lys, ved 4 ° C, hvis ikke kan view straks; sørg 1x PBS tilsættes i skålen før opbevaring for at sikre cellerne ikke tørre ud, men varm til RT (20 - 30 min), og fjern derefter PBS lige før du går videre til næste trin.
  7. Når klar til at observere, tilsættes 2 - 3 dråber af en monterings medium, med eller uden DAPI, afhængigt af de eksperimentelle behov i skålen og lad det sidde i 10 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Vi anvender et kommercielt tilgængeligt, glycerol-baserede montering medium med DAPI, men andre monteringsdele medier kan bruges. Tillade 10 min til montering medium at sidde i skålen letter fjernelse af dækglas fra bunden af ​​skålen.
  8. Efter inkubation forsigtigt klemme på siderne af skålen for at løsne og fjerne dækglasset. Tilføj en ekstra dråbe montering medier på en glasplade og placere dækglasset, celler nedad på diaset.
    BEMÆRK: Overvej forsegling dækglasset til dias ved hjælp af klare fingernegl polish, hvis slæden skal holdes i længere tid end 1 - 2 dage.
  9. Overhold dias under et fluorescens mikroskop.
    BEMÆRK: De fleste af vores billeder blev taget med et 40X eller 63X objektiv i immersionsolie, men det specifikke mål objektivet, vil afhænge af forsøgsprotokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som illustreret i figur 1, kan ark keratocytter observeres migrere ud fra under skala i timer oprettelse eksplantatet kultur. Indimellem kan en individuelt migrerende keratocyte der har brudt væk fra kollektivt migrere ark overholdes. Desuden, som eksplantatet blev etableret fra en fisk, der tidligere var blevet plukket, der er rigelige neutrofiler, der migrerer gennem arket. På længere kultur perioder de keratocyte ark fragmenter som celler undergår EMT 14.

Den indledende sats ark avancement er ekstremt hurtigt, men dette tal hurtigt bremser som celler spredes (målt efter område og internuclear afstand, som øger ~ 1,8 og ~ 3,1 gange henholdsvis) i det første 48 timer af kultur (figur 2A-C). Den hurtige stigning er ikke forbundet med celleproliferation; Efter mærkning i 24 timer med fluorescerende thymidin analog ethynyl deoxyuridin (Edu), ~ 10% af cellerne viser tegn på celledeling, en langt mindre end set i transformerede cellelinjer, men mere i overensstemmelse med de involverede i reepithelization i humane organotypiske kulturer 30 celler. På senere tidspunkter, til arket fragmenter (et fænomen knyttet til EMT observeret i dette system 14), som gør det forskud på forkant vanskeligt måle.

Det område, som arkene efter 24 timer, kan anvendes som en hurtig screening for evnen af forbindelser til at ændre kollektive cellemigrering 15,31. Når behandlingen tilsættes på tidspunktet eksplantater er etableret, kan en dosis-respons i arkområde ses. Nogle cytokiner pattedyr (fx TGF-1 15), chemokiner (f.eks CXCL12) og småmolekylære inhibitorer oprindeligt karakteriseret i pattedyr (f.eks, MMP-2, -9 og -13-hæmmere 31) er blevet anvendt med held. Men som ark områder på 24 timer ikke er normalfordelte ( figur 3C).

I mange tilfælde er virkningerne af behandlingen (r) på kollektiv migration observeret i kortere perioder. I disse tilfælde kan video mikroskopi anvendes til at analysere respons kollektivt migrere ark til behandling. Når opløseligt RGD peptid tilsættes til dyrkningsmediet (tredje panel i figur 4) for at forstyrre endhesion dannelse, lamellerne på forkant af pladen hurtigt skrumpe og efterfølgende forkanten af ​​pladen løsner og trækker. Som hele pladen trækker på mindre end 2 min, kan reaktion af arket til behandlingen være hurtig.

For at vurdere lokalisering af proteiner i arket eller inden leder og follower celler, kan hele arket fikseres og farves, som vist i figur 5. Der skal udvises forsigtighed under fiksering proces som celleark let forstyrres. I vores hænder, har mange polyklonale antistoffer mod de funktionelle domæner af pattedyrsproteiner (især cytosoliske proteiner) vist sig at krydsreagere i vores zebrafisk eksplantater.

Figur 1
Figur 1. Kollektiv migration af celle ark. Efter etablering i eksplantation kultur, keratocytter migrereud fra undersiden af ​​skalaen som en kollektiv enhed. (A) viser den relative mængde af celler, der har migreret væk fra skalaen efter kun 2 timer i kultur, med (BE) taget hver time derefter (3 - 6 timer, henholdsvis). Alle billeder blev taget ved 100X forstørrelse. Hele sekvensen er vist i Video 1; en ramme blev taget hver 30 sek over 6 hr periode. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Karakteristik af kollektive Migration. Initial på forhånd af forkanten, målt på flere punkter, er hurtig men sinker i de første 24 timer i kultur (A). Måling af internuclear distance og celle område ved hjælp af cultures fastsat til 4 og 24 timer og farvet med DAPI og phalloidin som reference viser, at i samme periode, både internuclear afstand (målt fra midten af ​​hver kerne), og celleområdet stiger (målt som afgrænses af den kortikale actin cytoskelettet, (B) og (C) henholdsvis). Hver graf repræsenterer middelværdien (± SEM) af tre uafhængige forsøg i triplikat. Dette tal er blevet ændret fra Rapanan et al. 7. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Assay af kollektive Migration hjælp Cell arkområde. Når sat til dyrkningsmediet under etablering af kulturen, Peptide Z-PLG-NHOH (bredspektret MMP) og lille molekyle SB-3CT (MMP2 & 9 specifikke hæmmere) falde celle arkområde efter 24 timer i kultur (A). Da området af ubehandlede cellelag eksponentielt fordelt (B), bør dataene afbildes som medianer med standard fejl af medianen bestemmes som beskrevet i teksten og angives i blå (øvre henvisning grænse eller URL og nedre henvisning begrænse eller LRL; ( C)). Forskellen mellem medianen og webadressen og LRL bestemme størrelsen af ​​fejlen barer på grafen (skraveret i lys grøn). Dette tal er blevet ændret fra McDonald et al. 31 Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Tilsætning af opløseligt RGD peptid fører til Sheet tilbagetrækning. Under forbehandling og efter tilsætning af en RGE-holdigt peptid, fortsætter cellelaget gå videre. 15 sek efter tilsætning af et RGD-holdigt peptid, der er et fald i lamellerne på forkanten (inserts). Efter yderligere 30 sek, arket begynder at trække, en tilbagetrækning, som fortsætter under varigheden af video (total video længde ~ 5 min, se Video 2). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Immunofluorescens Assay. Cellerne blev farvet med et antistof til det katalytiske domæne af MMP14a (rød) og modfarvet med fluorescens-mærket (488) phalloidin (grøn) og / eller DAPI(Blå). (A) og (B) repræsenterer et typisk 4 timer ark kommer ud fra skalaen, mens (C) og (D) viser en del af en typisk 24 timers ark. Alle billeder blev taget ved 400X forstørrelse. Bemærk, at intensiteten af MMP14a farvningen er højere på forkant af de nye celle plader (set i (B) og (D)) og fremtrædende lamellipodia ses i Leader-celler (A) og (C)). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det mest kritiske skridt for succes keratocyte eksplantation kultur tillader skalaen til at holde sig til kultur skål for ca. 2 - 3 min før tilsætning af dyrkningsmediet. Ca. 75% af skalaer vil klæbe og vokse ark (antallet af kulturer, der er etableret for hvert forsøg skal justeres i overensstemmelse hermed). Keratocyte ark ikke danner omkring hver skala fjernes fra fisken og anbragt i kultur i flere grunde. Først DAPI farvning af eksplantater viser, at visse skalaer har få celler fæstnet, og dermed forventes det, at disse skalaer ikke vil have ark keratocytter. For det andet, evne eksplantater til at klæbe til vævskulturskål er en væsentlig forudsætning for ark migration. En afgørende faktor for, om skalaer klæbe og en vellykket explant kultur er etableret er tiden mellem at placere vægten på overfladen vækst og tilføjelsen af ​​medierne. Utilstrækkelig tid til at holde sig uden medier vil føre til skalaer floating i medier (undertiden med synlig væv vedhæftet), mens en for lang periode vil resultere i vedhængende skalaer uden vækst (formentlig på grund af udtørring af eksplantatet med celle rester synlige på kanten af ​​salget). Tiden mellem skala placering i skålen og tilsætning af vækstmediet kan være nødvendigt at blive bestemt eksperimentelt, som faktorer, såsom temperatur og fugtighed i laboratoriet rum kan påvirke, hvor hurtigt celler kan klæbe til skålen uden at udtørre.

Selv om antallet af kommercielt tilgængelige, zebrafisk specifikke antistoffer er stigende, kan de forskellige tilgængelige reagenser være begrænsende. Typisk anses for nødvendigt En 85% homologi mellem immunogen og målprotein for krydsreaktivitet. Men som funktionelle domæner, såsom aktive steder, protein-protein-interaktion sites, og steder af modifikation er mere konserverede end andre områder af proteinet, kan anti-peptid polyklonale antistoffer rettet mod disse regioner ofte væreanvendes, selv om den samlede homologi er lav. For eksempel, selv om zebrafisk MMP14a har en samlet 68% identitet med sin menneskelige ortolog (forventer værdi = 0), den del af identitet stiger til 79-96% i katalytiske og proteinbindingssteder mens snitsteder samme måde er stærkt konserverede 31. Dataene tyder på, at et antistof rettet mod den katalytisk aktive sted af human MMP14a krydsreagerer med zebrafisk keratocytter kulturer. Forslaget om, at farvningen i zebrafisk ark kan lokalisere med den strakte celler på forkant 31 er i overensstemmelse med andre data, der antyder, at MMP14 kan tjene som en mekanisk sensor 32.

Det er ikke muligt at skabe en helt steril eksplantat fra en fisk, der svømmer i usterile akvarier vand. Da de fleste af vore eksperimenter er afsluttet inden 24 timer, oplever vi ingen problemer med bakteriel eller fungal kontaminering af eksplantater. Men når der ønskes længere inkubationsperioder, vedligeholdelse sterilitet of eksplantater kan blive et problem. Når man planlægger et forsøg med 3 eller flere dages inkubation, der tages flere forholdsregler for at øge sandsynligheden for, at kulturerne forbliver uforurenet. Først, for at reducere bakteriel belastning, er fisken lov til at svømme i ca. 1 time i 3 ændringer af frisk, dechloreret ledningsvand med eller uden tilsætning af 100 ug / ml kanamycin. For det andet er mediet blev udskiftet dagligt for at opretholde tilstrækkelige niveauer af antibiotika og reducere antallet af eventuelle bakterier til stede. For særligt lange inkuberinger (> 5 dage) tre gange vask med 1 x PBS udføres med hver medieudskiftning. Men dette introducerer en variabel, der skal betragtes i den eksperimentelle design, når eksplantatet kultur behandles med et exogent forbindelse som dette skal erstattes med medierne. Desuden vil cytokiner og vækstfaktorer udskilles af eksplantatet fjernes med hver medieudskiftning. Men som celletallet er lav, og mængden af ​​medierer stor i en typisk keratocyte eksplantat, kan denne effekt ikke være betydelige.

Som fiskeskæl brug for 3 uger til fuldt ud at regenerere 33, anbefaler vi at lade fisk at komme sig for denne periode, før gentagen brug af fisken i forsøg. Selvom reformere epitellaget forekommer meget hurtigere, vi formoder, at vente så lang tid mellem at bruge den samme fisk minimerer chancen for systemiske inflammatoriske virkninger, som er blevet rapporteret i kutan sårheling i fisk 34.

Eksplantater har længe været anvendt til at undersøge opførslen af ​​epitelceller. Eksplantater fra en bred vifte af fiskearter og padder har lignende bevægelige egenskaber ved de individuelle og kollektive celle migrationen 3-6,35-37. Disse celler har tydeligt forskellige bevægelige egenskaber end mammale eksplantater men den overordnede struktur og organisation synes at have en høj grad af lighed 8,30,38 14.

Vi har fundet, at denne protokol giver os mulighed for at studere den kollektive migration af zebrafisk keratocytter hjælp af primær celle eksplantater denne model de tidlige stadier af sårheling 14. Udførelse af forsøgene under anvendelse af nyoprettede primære kulturer undgår problemer forbundet med seriel passage af primære celler eller anvendelse af transformerede cellelinier. Eksplantater kan anvendes til at undersøge den rolle, EMT i kutan sårheling som EMT påbegyndes, når kulturer er etableret. Vores undersøgelser tyder på, at disse primære eksplantater mere nøjagtigt efterligner den naturlige adfærd og migration af keratocytter inden de sårede epithellaget in vivo. Denne protokol giver grundlaget for etablering primære kulturer til brug i migration analyser samt til at undersøge ændringer i gen og / eller protein ekspression i en tilsyneladende endeløs række af eksperimentel conditioner. Procedurerne er hurtig, nem og billig, reproducerbar og egnet til brug ved enhver forskningsinstitution.

Sammenfattende er dette eksplantat teknik giver en hurtig assay for kollektiv cellemigration i forbindelse med en sårheling model, som undergår EMT. Tilstedeværelsen af flere celletyper i flere lag med en orienterende skala giver kompleksitet til denne ex vivo kultur system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af midler fra Midwestern University College of Health Sciences Research Lettelse Grant tildeles EEH og Midwestern University Office of Research og sponsoreret udsendelse Intramural Grant tildeles KJL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) MatTek P35GC-1.5-14-C 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 VWR 21909-460 We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
  2. Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
  3. Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
  4. Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
  5. Kolega, J. The Movement of Cell Clusters. J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).
  6. Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
  7. Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
  8. Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
  9. Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
  10. Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
  11. Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
  12. Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
  13. Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
  14. McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
  15. Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
  16. Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
  17. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
  18. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
  19. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).
  20. Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).
  21. Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
  22. Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
  23. Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
  24. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  25. Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
  26. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
  27. Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
  28. Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
  29. Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
  30. Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
  31. McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
  32. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
  33. Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
  34. Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
  35. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
  36. Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
  37. Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
  38. Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).

Tags

Developmental Biology Collective celle migration reepithelization zebrafisk keratocyte epitelial til mesenkymale overgang celle-celle adhæsion kutan sårheling
Zebrafisk Keratocyte Eksplantater at studere Kollektiv Cell Migration og reepitelisering i kutant Sårheling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rapanan, J. L., Pascual, A. S.,More

Rapanan, J. L., Pascual, A. S., Uppalapati, C. K., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing. J. Vis. Exp. (96), e52489, doi:10.3791/52489 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter