Summary
Kératocytes poisson zèbre migrent en feuilles de cellules à partir d'explants et fournissent un modèle in vitro pour l'étude des mécanismes de la migration cellulaire collective dans le contexte de la guérison de la plaie épithéliale. Ces protocoles détail un moyen efficace de mettre en place des cultures d'explants primaires pour une utilisation dans des essais collectifs de migration cellulaire.
Abstract
En raison de leurs propriétés uniques mobiles, kératocytes de poissons dissociées des cultures d'explants ont longtemps été utilisés pour étudier les mécanismes de la migration d'une cellule unique. Toutefois, lorsque explants sont établis, ces cellules se déplacent également collectivement, le maintien de nombreuses fonctionnalités qui rendent individuelle kératocytes un modèle attrayant pour étudier la migration: les taux rapides de la motilité, vaste lamelles d'actine riche avec un câble d'actine perpendiculaire, et la vitesse relativement constante et direction de la migration. Au début des explants, l'interconversion rapide des cellules qui migrent individuellement avec ceux qui émigrent collectivement permet l'étude du rôle des adhérences cellule-cellule pour déterminer le mode de la migration, et souligne les liens moléculaires entre les deux modes de migration. Les cellules dans les explants ultérieures perdent leur capacité à migrer rapidement et collectivement en tant que transition épithélio-mésenchymateuse se produit et les gènes associés à la guérison de la plaie et l'inflammation sont exprimés différentiellement. Ainsi, kératocytes explants peuvent servir comme un modèle in vitro pour la réépithélialisation qui se produit lors de la cicatrisation des plaies cutanées et peuvent représenter un système unique d'étudier les mécanismes de la migration cellulaire collective dans le cadre d'un programme défini de changements dans l'expression génique. Une variété de lignes de poisson zèbre mutantes et transgéniques sont disponibles, ce qui permet explants à établir à partir de poissons avec différents fonds génétiques. Ceci permet le rôle des protéines différentes à l'intérieur de ces processus à traiter de manière unique. Les protocoles décrits ici décrivent une méthode simple et efficace pour l'établissement de ces cultures d'explants pour une utilisation dans une variété d'essais liés à la migration cellulaire collective.
Introduction
Les études de motilité cellulaire sont traditionnellement concentrées sur cellules en migration individuellement. Kératinocytes cultivées à partir de poissons et d'amphibiens explants se sont révélés être un système modèle puissant pour étudier les mécanismes de la motilité cellulaire utilisant la modélisation expérimentale et mathématique approches 1-6. Les travaux expérimentaux sur les cellules migrent individuellement est aidée par le mouvement de glisse rapide, lisse des cellules, tout en maintenant un uniforme forme, la vitesse, et la direction. Cependant, in vivo, les cellules se déplacent collectivement fréquemment, tout en maintenant les jonctions cellule-cellule, en particulier au cours de l'embryogenèse, la cicatrisation des plaies, et les métastases. Ainsi, la migration cellulaire collective est une zone de croissance et de plus en plus important de la recherche dans le domaine de la migration cellulaire. La migration collective de ces cellules a été récemment décrit 7 et il a de nombreuses caractéristiques uniques qui en font un système puissant pour étudier la migration cellulaire collective dans un modèle de cicatrisation.
ove_content "> Lorsque échelles sont cueillies à partir d'un poisson zèbre adulte anesthésié, certains tissu épithélial reste attaché à la face inférieure de l'échelle. Lorsque milieu de culture cellulaire est ajouté, ces cellules épithéliales, ou kératinocytes, migrent rapidement une unité collective de l'échelle. La culture d'expiant peut être considérée comme un modèle de cicatrisation de l'épithélium de la plaie, dans lequel les cellules migrent loin de l'explant comme ils le feraient à travers la matrice provisoire d'un lit de la plaie pour rétablir un epithelium intact. Des données récentes suggèrent que cette ex vivo imite de culture de nombreuses caractéristiques de in vivo la cicatrisation chez le poisson zèbre adulte. Les taux de fermeture de plaies 8 traduisent par une vitesse de migration similaire à celle observée dans l'ex vivo système 7. En outre, dans une plaie modèle in vivo de guérison, le traitement par warfarine suggère que l'hémostase n'a aucun effet sur le taux de guérison, tandis que le traitement par hydrocortisone pour diminuer la réponse immunitaire ne tardez pas réépithélialisation 8Le protocole présenté ici décrit comment établir cultures kératocyte d'explants de poisson zèbre qui assurent la cohérence et la reproductibilité pour une utilisation dans de nombreux dosages biologiques. Ces cultures d'explants sont particulièrement convaincante modèle in vitro pour la migration cellulaire collective pour plusieurs raisons. Tout d'abord, les kératinocytes de poisson zèbre sont des cellules primaires utilisées dans les heures d'établir cultures d'explants. Par conséquent, ces cellules ne ont pas subi les changements morphologiques et génétiques expression associée à passage de cellules primaires 9-13. D'autre part, ce système constitue un modèle pour l'étude de réépithélialisation en réponse à blessant 14 et, dans le cadre de la réponse à une blessure, un épithéliale mésenchymateuses à transition (EMT) processus est lancé comme en témoignent les changements dans l'expression des gènes et des réarrangements du cytosquelette 14,15. Ainsi, les modifications de fond de l'expression génique et la motilité qui se produisent dans les cellules non traitées ont été caractérisés et fournir un contexte pour interpréter les changements avec le traitement. En outre, le kératocytes du poisson et le kératinocyte humain sont fonctionnellement équivalents; les deux sont des cellules épithéliales primaires de leurs espèces respectives et jouent un rôle clé dans la cicatrisation epitheliale. Troisièmement, le poisson zèbre adulte sont plus en plus reconnue comme un système modèle pour une variété de maladies humaines 16-18 y compris le mélanome et d'autres cancers 19-21, plaies cutanées guérison 8,14 et la régénération des tissus 22-24.
Les avantages techniques de ce système de modèle sont tout aussi convaincants. Un nombre croissant de lignées mutantes et transgéniques sont disponibles auprès but non lucratif, des installations centralisées. Plus précisément, le projet Mutation poisson zèbre (ZMP) Au Wellcome Trust Sanger Institute vise à créer un allèle de KO dans chaque codant pour la protéine gène dans le génome du poisson zèbre. Actuellement, ils ont muté 11.892 gènes, environ 45% du génome, avec 24 088 alleles caractérisés. En outre, ZMP accepte les propositions et générera gratuitement knock-out. Des méthodes récentes de knockdown de gènes dans des larves et des adultes poisson zèbre 25-28 offrent une flexibilité pour étudier la fonction des gènes importants pour le développement pour lesquels des approches transgéniques sont problématiques ou impraticable.
En raison de leurs taux extrêmement rapides de la motilité de ~ 145 um / h peu après l'établissement de cultures 29, les essais peuvent être achevées rapidement (généralement en 24 heures ou moins). Comme les expériences peuvent être achevées rapidement et les cultures poussent bien à la température ambiante, plusieurs des obstacles techniques associés à des mammifères essais de migration cellulaire impliquant la microscopie vidéo sont évités. En outre, à l'ère de resserrement des budgets de recherche, zebrafish sont facilement et économiquement maintenue.
La structure et le comportement de l'explant est complexe. Comme les poissons ne saignent pas lorsque l'échelle est supprimé, il est peu probable que beaucoup plus que les couches superficielles de l'épiderme sont retirés avec l'échelle. Kératocytes semblent être le type cellulaire prédominant dans l'expiant lorsque les échelles sont d'abord retirés du poisson comme la grande majorité des cellules apparaissent pour colorer avec un anticorps anti-E-cadhérine 14. En outre, il ne existe aucune preuve de fibroblastes dans la culture initiale en juger par l'absence de coloration par immunofluorescence de la vimentine 14. Cependant, avec suppression répétée à grande échelle, il semble y avoir de nombreux neutrophiles dans l'expiant (voir vidéo 1). Nous avons déterminé que ces cellules neutrophiles à partir d'observations morphologiques de leur taille, la motilité rapidement, et leur migration hors de la feuille de cellules quand ils sont exposés au LPS (données non présentées). En outre, ces cellules se colorent brillamment l'esprith un anticorps au facteur cytosolique des neutrophiles ainsi que d'une variété d'anticorps IgG secondaires, ce qui indique qu'ils ont FcR abondants sur leur surface (données non présentées). Plusieurs couches de cellules sont présentes dans l'expiant. La microscopie confocale révèle la présence d'une seule couche à proximité du bord d'attaque de plus de deux couches de kératinocytes à proximité de l'échelle avec les neutrophiles visibles ci-dessus, en dessous et entre les feuilles de kératocytes cellulaire.
Aux points de temps précoces, les cellules sur le bord de la multi-couche explant polariser, initiant la migration collective des kératinocytes de l'explant à des taux initiaux de ~ 145 um / h. La zone couverte par l'explant augmente rapidement, ce qui conduit à la propagation cellulaire, la tension à l'intérieur de la feuille, et une diminution du taux de l'avance du bord d'attaque. Interconversions rapides entre les cellules de leader et suiveur sont observés à la pointe lors de la formation et de la fermeture de trous formés spontanément au sein de la feuille 7. Comme leEMT processus initié avec l'expiant continue, les fragments de feuilles et les kératinocytes perdent leur spécialisé, la motilité rapide. L'expression des gènes et des changements morphologiques compatibles avec EMT, la cicatrisation des plaies, et les réponses inflammatoires se produisent dans les 7 jours de culture avec des explants étant considérées comme viables pendant environ 10 jours 14.
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Protocol
Ce protocole est conforme aux principes de bien-être des animaux AVMA pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université du Midwest.
1. Préparation d'anesthésie, équipement, et médias
- Déchlorer environ 1,5 L d'eau du robinet en utilisant soit un agent commercial de déchloration (disponible dans les magasins pour animaux de compagnie) ou en laissant reposer l'eau pendant 24 heures. Obtenez trois béchers 1 L et remplir chacune avec 500 ml d'eau déchlorés. Label One pour la tenue de poissons avant toute procédure et l'autre pour la récupération. Pour la troisième bêcher, ajouter 100 pg / ml de méthanesulfonate de tricaïne; cela devient le bécher dans laquelle les poissons seront anesthésiés.
- Remplir un plateau peu profond avec de la glace, chauffer le milieu de culture (RPMI 1640, 10% de FBS (sérum fœtal bovin), 50 ug / ml de gentamycine, 100 ug / ml de kanamycine, HEPES 25 mM) à la température ambiante, et recueillir les pincettes de bijoutier propre. Pinces propres par immerchanter les conseils dans 70% d'éthanol et passer à travers un bec Bunsen, permettant à l'éthanol pour brûler.
- Décider si la procédure sera effectuée sans grossissement, avec un, table éclairée loupe commercial avec 2 - grossissement 10X, ou binoculaire (entièrement dépendante de préférence personnelle).
2. Établir cultures d'explants
- Attrapez le nombre désiré de poissons et le placer dans un bécher de maintien. Transférer un seul poisson dans le bécher d'anesthésie; il est préférable pour anesthésier les poissons individuellement.
- Surveiller les effets de l'anesthésie en observant la piscine et les branchies mouvement du poisson. Comme l'anesthésie progresse, le mouvement des branchies ralentit et le poisson nagera erratique et souvent la tête en bas; envisager de poissons anesthésiés dès qu'un mouvement maillant cesse. Ne laissez pas le poisson pendant de longues périodes dans le bain de l'anesthésie car cela peut entraîner la mort des poissons.
- Retirer le poisson du bécher d'anesthésie et de transfertà la glace, plaçant le poisson horizontalement avec la queue en face de la tenue des pincettes main. Si l'expérience avec la technique et si plusieurs poissons doivent être utilisés pour faire des explants, envisager de placer le poisson prochaine dans le bécher d'anesthésie à ce moment.
- Pour enlever les écailles, pincettes de position parallèle au poisson avec pointe à bord de l'échelle. Appuyer sur le côté plat de la pince légèrement sur le côté du poisson pour amener l'échelle d'élever à partir du corps du poisson. Saisissez échelle avec des pincettes, arrache, et le lieu (sans inversion) en boîte de culture de tissu. Répétez la procédure, la suppression d'un maximum de 12 échelles d'un adulte de grande taille (six de chaque côté), en évitant la région des branchies, la ligne latérale, et les nageoires.
- Placer le poisson dans le bécher de récupération et de surveiller pour se assurer qu'il se remet des effets de l'anesthésie. A cette époque, les poissons peuvent être transférés à un réservoir individuel. Laisser le poisson pour récupérer pendant au moins 21 jours pour permettre une régénération complète de l'échelle.
- En fonction de laconception expérimentale, placer jusqu'à 20 échelles par boîte de culture de tissu traité 35 mm en plastique ou 4-6 échelles par verre plat en bas. Échelles permettent d'adhérer à l'antenne avant d'ajouter doucement les médias afin de ne pas détacher échelles de le plat.
NOTE: Avec l'expérience, plusieurs poissons peuvent être traitées avant que le média est ajouté au premier plat. - Ajouter 1,2 ml de milieu complet (voir 1.2 ci-dessus) dans chaque boîte de 35 mm.
- De préférence incuber les cultures d'explants à 28 ° C dans 5% de CO2 pendant la période de temps désirée avec ou sans traitement supplémentaire. En variante, incuber les cultures sur une platine de microscope ou chauffé dans une chambre de culture de cellules vivantes pour la microscopie vidéo.
3. Brightfield et vidéo microscopie
- plats de position contenant feuilles de cellules sur la platine du microscope et initialement mise au point avec l'objectif 4X.
NOTE: Supérieur grossissements peuvent être utilisées, en fonction de l'expérience. Marquer l'emplacementchaque feuille et / ou l'orientation de l'antenne sur la scène cellule faciliteront la prise d'images au cours du temps avec les feuilles à peu près la même orientation. - Retirez les plats de l'incubateur et la photographie à divers points de temps, en fonction de chaque protocole expérimental et remettez-le dans l'incubateur si seulement les images fixes sont nécessaires sur la période expérimentale.
- En effectuant la microscopie vidéo, faites attention à ce qui suit:
- Positionner la feuille de cellules échelle / émergeant à l'intérieur du champ de vision de telle sorte que la feuille de cellules migration reste dans le champ de vue pour la durée de la vidéo.
NOTE: Cela peut prendre une certaine expérience en observant la façon dont les cellules migrent sous l'échelle. Pour de courtes vidéos, ce est moins préoccupante que pour des vidéos plus longues. - Pour des délais plus courts, incuber à RT. Pour des délais plus longs (18+ RH), utiliser un stade chauffé ou une chambre d'incubation pour maintenir la température, l'équilibre du pH, et de minimiser l'évaporation de la culture moyen.
- Positionner la feuille de cellules échelle / émergeant à l'intérieur du champ de vision de telle sorte que la feuille de cellules migration reste dans le champ de vue pour la durée de la vidéo.
4. Fixation pour immunofluorescence Microscopie
- Préparer et pré-chaudes toutes les solutions à 28 ° C. Pour voir kératocytes sous fluorescence, développer les cultures d'explants comme décrit ci-dessus en utilisant 35 mm boîtes de culture de tissus à fond de verre. Vous pouvez également utiliser les diapositives de la chambre de verre.
- Ajouter 0,8 ml de 4% de paraformaldehyde dans PBS 1,1x à chaque plat. Ne pas retirer d'abord le milieu de culture. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis aspirer pour éliminer la solution.
- Ajouter 0,8 ml de 4% de paraformaldehyde dans PBS 1,1x à chaque plat. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis aspirer pour éliminer la solution.
- A moins d'utiliser des ligands externes ou extérieures, des epitopes des cellules perméabiliser par addition de 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1X. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis aspirer pour éliminer la solution.
- Ajouter 0,5 ml de BSA à 1% dans du PBS 1x et incuber pendant 1 heure (à température ambiante) ou O / N (à 4 ° C).
REMARQUE: Selon les conditions expérimentales, phalloidin peut être ajouté à cette étape. - Après incubation, aspirer la solution pour supprimer et procéder à la coloration des anticorps. Alternativement, stocker les boîtes de culture en ajoutant au moins 1-2 ml de 1% de BSA dans PBS 1x pour 3-4 semaines à 4 ° C.
5. Protocole d'immunofluorescence
- Préparation des solutions d'anticorps primaires et secondaires selon les recommandations du fabricant.
REMARQUE: si les recommandations du fabricant ne sont pas disponibles, une bonne dilution de départ d'anticorps primaires (à 1% de BSA dans du PBS 1x) est de 1: 500 pour polyclonaux et 1: 1000 pour les anticorps monoclonaux; une bonne dilution de départ pour des anticorps secondaires est de 1: 1000. Régler ces dilutions du stock d'origine obtenu du fabricant plus élevé si le signal est faible, plus faible si le signal est fort et le fond est un problème. - Aspirer la BSA à 1% dans une solution PBS 1x. Ajouter 0,5 ml de solution d'anticorps primaire et incuber pendant 1 heure (à température ambiante) ou O / N (à 4 ° C). Retirer la solution d'anticorps primaire, placer dans un récipient propre et étiqueté tube de 1,5 ml microcentrifugeuse, et congeler à -20 ° C.
REMARQUE: Ceci permet la réutilisation de l'anticorps primaire, si nécessaire. - Laver la capsule 3-5 fois avec du PBS 1x, l'élimination et le rejet du PBS après chaque lavage.
- Ajouter 0,5 ml de solution d'anticorps secondaire. Si désiré, ajouter phalloïdine marquée par fluorescence (suite à la concentration recommandée de ne importe quel fabricant) pendant cette étape. Incuber pendant 1 heure (à température ambiante) ou O / N (à 4 ° C).
NOTE: L'utilisation de phalloïdine marquée par fluorescence permet la visualisation des filaments d'actine; nous avons constaté que 488 phalloïdine marquée fonctionne le mieux dans nos kératocytes poisson zèbre, mais d'autres fluorophores peut être utilisé. - Retirez et jetez la solution d'anticorps secondaire.
- Laver la capsule 3-5 fois avec du PBS 1x, l'élimination et le rejet du PBS après chaque lavage.
NOTE: Le plat peut être stocké, couverte de la lumière, à 4 ° C se il est incapable de rivaliserw immédiatement; assurez-vous que 1x PBS est ajouté dans le plat avant de le ranger pour assurer les cellules ne se dessèchent pas, mais réchauffer à température ambiante (20 à 30 min), puis retirer la PBS juste avant de passer à l'étape suivante. - Lorsque vous êtes prêt à observer, ajouter 2 à 3 gouttes d'un milieu de montage, avec ou sans DAPI, selon les besoins expérimentaux, dans le plat et laisser reposer pendant 10 min à température ambiante.
NOTE: Nous utilisons, un milieu de montage à base de glycérol disponible dans le commerce avec DAPI, mais d'autres milieux de montage peut être utilisé. Permettre 10 min pour le milieu de montage de se asseoir dans le plat facilite le retrait facile de la lamelle de verre du fond du plat. - Après incubation, presser doucement sur les côtés du plat pour desserrer et retirer la lamelle. Ajouter une baisse supplémentaire de milieu de montage sur une lame de verre et placer la lamelle, cellules vers le bas, sur la lame.
REMARQUE: Pensez à sceller la lamelle à la diapositive à l'aide du vernis à ongle clair si la lame doit être maintenu pendant plus de 1-2 jours. - Observer la lame sous un microscope à fluorescence.
REMARQUE: La plupart de nos images ont été prises avec un objectif 40X ou 63X objectif sous huile, mais l'objectif spécifique utilisé dépendra du protocole expérimental.
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Representative Results
Comme illustré sur la figure 1, des feuilles de kératinocytes peuvent être observées migration de dessous de l'échelle dans les heures suivant l'établissement de la culture de l'explant. Occasionnellement, une kératocyte migration individuelle qui se est détaché de la feuille migration collectivement peut être observée. En outre, dans l'expiant a été établie à partir d'un poisson qui a été préalablement pincées, il existe abondantes neutrophiles migrent à travers la feuille. Pendant les périodes de culture plus longues, les fragments de feuilles de kératocyte que les cellules subissent EMT 14.
La vitesse initiale de la feuille d'avancement est extrêmement rapide, mais ce taux ralentit rapidement cellules réparties (mesurée par zone et la distance internucléaire qui augmentent ~ 1,8 et ~ 3,1 fois respectivement) pendant les 48 premières heures de la culture (figure 2A-C). L'augmentation rapide ne est pas associée à une prolifération cellulaire; après marquage pendant 24 heures avec le désoxyuridine fluorescente thymidine éthynyle analogique (EdU), ~ 10% des cellules présentent des signes de la division cellulaire, un taux nettement inférieur à celui vu dans des lignées cellulaires transformées, mais plus compatible avec les cellules impliquées dans réépithélialisation dans les cultures organotypiques humains 30. À certains moments plus tard, les fragments de feuilles (un phénomène associé à l'EMT observée dans ce système 14) qui permet l'avance du bord d'attaque difficile à mesurer.
La zone couverte par des feuilles après 24 h, peut être utilisé comme un écran rapide pour la capacité des composés de modifier la migration cellulaire collective 15,31. Lorsque le traitement est ajouté au moment explants sont établis, une relation dose-réponse dans la zone de la feuille peut être vu. Certaines cytokines de mammifères (par exemple, TGF-1 15), les chimiokines (telles que CXCL12) et les inhibiteurs de petites molécules caractérisées à l'origine dans des systèmes de mammifères (par exemple, la MMP-2, -9 et -13, 31) des inhibiteurs ont été employés avec succès. Cependant, comme les zones de feuille à 24 h ne sont pas normalement distribuées (
Dans de nombreux cas, les effets du traitement (s) sur la migration collective sont observés dans des périodes plus courtes. Dans ces cas, la microscopie vidéo peut être utilisé pour doser réponse de la feuille migration collectivement au traitement. Lorsque soluble contenant un peptide RGD est ajouté au milieu de culture (troisième panneau de la figure 4) pour perturber unformation de dhesion, les lamelles à la pointe de la feuille rétrécir rapidement et par la suite le bord d'attaque des détache de la feuille et se rétracte. Comme la totalité de la feuille se rétracte en moins de 2 min, la feuille de réponse au traitement peut être rapide.
Pour évaluer la localisation des protéines dans la feuille ou dans les cellules de tête et suiveur, la totalité de la feuille peut être fixé et coloré, comme représenté à la figure 5. Il faut prendre soin pendant le processus de fixation que les feuilles de cellules sont facilement perturbés. Dans nos mains, de nombreux anticorps polyclonaux aux domaines fonctionnels de protéines de mammifères (en particulier des protéines cytosoliques) ont été trouvés à traverser réagir dans nos explants de poisson zèbre.
Figure 1. de migration collective des feuilles de cellules. Après mise en place dans la culture des explants, kératinocytes migrentde dessous de l'échelle comme une unité collective. (A) illustre la quantité relative de cellules qui ont migré loin de l'échelle après seulement 2 h de culture, avec (BE) pris toutes les heures par la suite (3-6 h, respectivement). Toutes les images ont été prises au grossissement 100X. La séquence entière est montré dans la vidéo 1; une image a été prise toutes les 30 secondes au cours de la période de 6 h. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Caractéristiques de la migration collective. Initiale du taux d'avancement de l'avant-garde, mesurée en plusieurs points, est rapide, mais ralentit pendant les 24 premières heures dans la culture (A). Mesure de la distance internucléaire et la zone de cellule en utilisant cULTURES fixés à 4 et 24 heures et colorées avec du DAPI et phalloïdine comme référence indiquent que durant la même période de temps, à la fois la distance internucléaire (mesurée à partir du centre de chaque noyau) et la zone de la cellule augmente (mesurée en surface délimitée par les actine corticale cytosquelette, (B) et (C), respectivement). Chaque graphique représente la moyenne (± SEM) de trois expériences indépendantes, en triple exemplaire. Ce chiffre a été modifié depuis Rapanan et al. 7 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Test de la migration cellulaire collective utilisant Fiche Espace. Lorsque ajouté au milieu de culture lors de l'établissement de la culture, Peptide Z-PLG-NHOH (large spectre MMP) et petite molécule SB-3CT (MMP2 et 9) les inhibiteurs spécifiques diminuer cellule zone de feuille après 24 heures dans la culture (A). Comme le domaine des feuilles de cellules non traitées est exponentiellement distribué (B), les données doivent être tracées sous forme de médianes avec erreur-type de la médiane déterminée comme décrit dans le texte et indiquées en bleu (limite supérieure de référence ou l'URL et la limite de référence inférieur ou GDG; ( C)). La différence entre la médiane et l'URL et LRL déterminer la taille des barres d'erreur sur le graphique (ombrée en vert clair). Ce chiffre a été modifié depuis McDonald et al. 31 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Ajout de Soluble RGD peptide mène à la fiche de rachat. Au cours du prétraitement et après l'addition d'un peptide RGE contenant, la feuille de cellules continue de progresser. 15 secondes après l'addition d'un peptide contenant RGD, il ya une diminution dans les lamelles au niveau du bord d'attaque (inserts). Après un montant supplémentaire de 30 secondes, la feuille commence à se rétracter, une rétraction qui continue pendant la durée de la vidéo (durée de la vidéo totale ~ 5 min, voir vidéo 2). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. immunofluorescence. Les cellules ont été colorées avec un anticorps dirigé contre le domaine catalytique de MMP14a (rouge) et contre-colorées avec (488) phalloïdine marquée par fluorescence (vert) et / ou DAPI(Bleu). (A) et (B) représentent un type feuille 4 h émergeant de l'échelle tout en (C) et (D) montrent une partie d'une feuille de 24 heures typique. Toutes les images ont été prises à un grossissement de 400X. Notez que l'intensité de MMP14a coloration est plus élevé à la pointe des feuilles de cellules émergents (vu dans (B) et (D)) et lamellipodes éminent sont vu dans les cellules leader (A) et (C)). Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'étape la plus critique pour le succès de la culture d'expiant kératocyte permet à l'échelle d'adhérer à la boîte de culture pendant environ 2-3 min avant l'addition du milieu de culture. Environ 75% des échelles va adhérer et de grandir feuilles (le nombre de cultures établies pour chaque expérience devra être ajustée en conséquence). les feuilles de kératocytes ne forment pas autour de chaque échelle présente dans le poisson et mis en culture pour plusieurs raisons. Tout d'abord, la coloration DAPI des explants révèle que certaines échelles ont quelques cellules attachées et donc il est prévu que ces échelles ne auront pas feuilles de kératinocytes. Deuxièmement, la capacité des explants d'adhérer à la boîte de culture de tissu est une condition essentielle pour la migration de la feuille. Un facteur déterminant de savoir si échelles adhèrent et un Explant succès est établi est le temps entre plaçant l'échelle sur la surface de la croissance et l'ajout de médias. Manque de temps à adhérer sans média mènera à échelles Floating dans des milieux (parfois avec le tissu attaché visible) tout en une période trop longue entraîne échelles adhérentes avec aucune croissance (probablement due à la dessiccation de l'explant avec des restes cellulaires visibles au niveau du bord de la vente). Le temps entre le placement de l'échelle dans le plat et l'ajout de milieu de croissance peut avoir besoin d'être déterminée expérimentalement, que les facteurs tels que la température et l'humidité dans la salle de laboratoire peut influencer la façon dont les cellules peuvent adhérer rapidement à l'antenne sans dessécher.
Bien que le nombre d'anticorps spécifiques disponibles dans le commerce, de poisson zèbre est en augmentation, la variété des réactifs disponibles peut être un facteur limitant. Une homologie de 85% entre immunogène et la protéine cible est généralement jugé nécessaire pour la réactivité croisée. Toutefois, en tant que domaines fonctionnels tels que des sites actifs, les sites d'interaction protéine-protéine, et les sites de modification sont plus conservées que les autres régions de la protéine, les anticorps polyclonaux anti-peptide dirigés contre ces régions peuvent être fréquemmentutilisée même si homologie globale est faible. Par exemple, bien que MMP14a poisson zèbre a une identité globale de 68% avec son orthologue humain (attendre valeur = 0), la fraction de l'identité augmente à 79-96% dans les sites catalytiques et la protéine de liaison tandis que les sites de coupe sont de même hautement conservées 31. Les données suggèrent que l'anticorps dirigé vers le site catalytiquement actif de MMP14a humain réagit de manière croisée avec le poisson zèbre kératocytes cultures. La suggestion que la coloration dans les feuilles de poisson zèbre peut localiser les cellules étirées à la pointe 31 est compatible avec d'autres données suggérant que MMP14 peut servir de capteur mécanique 32.
Il ne est pas possible de créer un explant entièrement stérile d'un poisson qui nage dans l'eau des aquariums non stérile. Comme la plupart de nos expériences sont terminées dans les 24 heures, nous éprouvons pas de problèmes avec la contamination bactérienne ou fongique des explants. Cependant, lorsque les périodes d'incubation plus longues sont souhaitées, maintenir la stérilité oexplants F peut devenir un problème. Lors de la planification d'une expérience impliquant trois ou plusieurs jours d'incubation, plusieurs précautions sont prises pour augmenter la probabilité que les cultures restent non contaminée. Tout d'abord, pour réduire la charge bactérienne, le poisson est autorisé à nager pendant environ une heure dans trois changements de frais, l'eau du robinet déchlorée avec ou sans l'addition de 100 pg / ml de kanamycine. Deuxièmement, les médias sont échangées sur une base quotidienne pour maintenir des niveaux adéquats d'antibiotiques et de réduire le nombre de bactéries présentes. Pour particulièrement longues incubations (> 5 jours) trois lavages avec PBS 1x sont effectués avec chaque échange de médias. Cependant, cela introduit une variable qui doit être pris en compte dans la conception expérimentale lorsque la culture des explants est traité avec un composé exogène que cela devra être remplacé par les médias. En outre, les cytokines et les facteurs de croissance sécrétés par l'explant seront enlevés à chaque échange de médias. Cependant, comme le nombre de cellules est faible et le volume de milieuest grande dans un expiant kératocyte typique, cet effet peut ne pas être importante.
Comme écailles de poisson nécessitent trois semaines pour régénérer entièrement 33, nous recommandons de prévoir le poisson à récupérer pour cette période de temps avant l'utilisation répétée des poissons dans des expériences. Bien que la réforme de la couche épithéliale se produit beaucoup plus rapidement, nous présumons que l'attente de cette longueur de temps entre l'utilisation du même poisson réduit le risque pour les effets inflammatoires systémiques qui ont été signalés dans la guérison des plaies cutanées chez les poissons 34.
Les explants ont longtemps été utilisés pour étudier le comportement des cellules épithéliales. Explants d'une large variété d'espèces d'amphibiens et de poissons ont des propriétés mobiles similaires aux niveaux individuels et collectifs migration cellulaire 3-6,35-37. Ces cellules ont nettement différentes propriétés mobiles que explants de mammifères mais la structure et l'organisation générale semblent avoir un degré élevé de similitude 8,30,38 14.
Nous avons trouvé que ce protocole nous permet d'étudier la migration des kératinocytes collective de poisson zèbre en utilisant des explants de cellules primaires qui modélisent les premiers stades de la cicatrisation 14. Réalisation d'expériences utilisant des cultures primaires nouvellement créées évite les problèmes associés à des passages en série de cellules primaires ou l'utilisation de lignées cellulaires transformées. Les explants peuvent être utilisés pour étudier le rôle des EMT dans la cicatrisation des plaies cutanées comme EMT est initiée lorsque les cultures sont établis. Nos études suggèrent que ces explants primaires imitent plus précisément le comportement naturel et la migration des kératinocytes dans la couche épithéliale blessés in vivo. Ce protocole fournit la base pour l'établissement des cultures primaires pour une utilisation dans des essais de migration ainsi que pour examiner les changements dans le gène et / ou l'expression de la protéine dans une série apparemment sans fin de condit expérimentaleions. Les procédures sont rapides, faciles, peu coûteux, reproductible et utilisable dans toute institution de recherche.
En résumé, cette technique d'explant fournit un test rapide pour la migration cellulaire collective dans le contexte d'un modèle de cicatrisation de la plaie qui est en cours EMT. La présence de plusieurs types de cellules en plusieurs couches avec une échelle d'orientation fournit complexité de ce système ex vivo de culture.
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Disclosures
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds provenant du Midwest University College of Health Sciences Facilitation de la recherche Grant attribué à EEH et du Midwest Bureau Université de recherche et des programmes intra-muros Sponsored subvention accordée à KJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
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