Summary
Zebrabärbling Keratozyten migrieren in Zellschichten aus Explantaten und stellen eine in vitro-Modell für die Untersuchung der Mechanismen der kollektiven Zellmigration im Rahmen der epithelialen Wundheilung. Diese Protokolle Detail ein effektiver Weg zur primären Explantatkulturen für den Einsatz in kollektive Zellmigrationsassays herzustellen.
Abstract
Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften motile dissoziierte Fisch Keratozyten aus Explantatkulturen werden seit langem verwendet, um die Mechanismen der einzelnen Zellwanderung zu untersuchen. Allerdings, wenn Explantate ansässig sind, diese Zellen zusammen bewegen sich auch, die Aufrechterhaltung viele der Funktionen, die einzelnen Keratozyten ein attraktives Modell, um die Migration zu studieren machen: schnelle Raten von Beweglichkeit, umfangreiche Aktin-reichen Lamellen mit einer senkrecht Aktin Kabel und relativ konstanter Drehzahl und Migrationsrichtung. In frühen Explantate, die rasche Umwandlung von Zellen einzeln Migration mit denen die Migration kollektiv ermöglicht die Untersuchung der Rolle der Zell-Zell-Adhäsionen bei der Bestimmung des Modus der Migration, und betont die molekularen Bindungen zwischen den beiden Betriebsarten der Migration. Zellen in späteren Explantate verlieren ihre Fähigkeit, rasch und gemeinsam wandern, wenn eine epitheliale mesenchymalen Übergang auftritt und Genen mit der Wundheilung und Entzündung verbunden sind, differentiell exprimierten. Somit kann Keratozyten Explantate als in vitro-Modell für die Reepithelialisierung die kutanen Wundheilung auftritt, und kann ein einzigartiges System zur Mechanismen kollektiver Zellmigration im Rahmen eines definierten Programms von Veränderungen der Genexpression zu studieren repräsentieren dienen. Eine Vielzahl von Mutanten und transgene Zebrafischlinien zur Verfügung, die Explantate von Fisch mit verschiedenen genetischen Hintergründen festgelegt werden kann. Dies ermöglicht es die Rolle von verschiedenen Proteinen innerhalb dieser Prozesse eindeutig adressiert werden. Die hier aufgeführten Protokolle beschreiben eine einfache und effektive Methode zur Festlegung dieser Explantatkulturen für den Einsatz in einer Vielzahl von Assays auf Kollektiv Zelle Migration.
Introduction
Studium der Zellbewegung traditionell auf individuell wandernden Zellen konzentriert. Keratozyten von Fischen und Amphibien Explantate kultiviert haben sich als ein leistungsfähiges Modellsystem, um die Mechanismen der Zellbeweglichkeit Studie mit experimentellen und mathematischen Modellierung nähert 1-6 sein. Experimentelle Arbeiten auf individuell wandernden Zellen wird durch die schnelle, leichtgängige Bewegung der Zellen unterstützt, und gleichzeitig eine gleichmäßige Form, Geschwindigkeit und Richtung. In vivo werden Zellen kollektiv bewegen häufig während Zell-Zell-Junctions, insbesondere während der Embryogenese, Wundheilung und Metastase. So ist kollektive Zellmigration eine wachsende und immer wichtigere Forschungsgebiet im Bereich der Zellmigration. Die kollektive Migration dieser Zellen wurde vor kurzem beschrieben 7 und es hat viele einzigartige Eigenschaften, die es ein leistungsfähiges System zur kollektiven Zellmigration in einer Wundheilung Modell untersuchen zu machen.
ove_content "> Beim Schuppen werden aus einem betäubten erwachsenen Zebrafisch gezupft bleibt etwas Epithelgewebe an der Unterseite des Umfangs angebracht ist. Wenn die Zellkulturmedium zugegeben wird, diese Epithelzellen oder Keratozyten, schnell wandern als Sammeleinheit von der Skala. Das Explantatkultur kann als epitheliale Wundheilung Modell, in dem die Zellen wandern vom Explantat wie sie es in der vorläufigen Matrix eines Wundbett um ein intaktes Epithel wiederherzustellen angesehen werden. Neuere Daten legen nahe, dass dieser ex vivo-Kultur imitiert viele Merkmale in vivo Wundheilung bei erwachsenen Zebrafisch. Wundverschlussraten 8 zu einer Wanderungsgeschwindigkeit ähnlich zu der in den ex-vivo-System 7 beobachtet übersetzen. Zusätzlich wird in einem in vivo-Wundheilungsmodell Behandlung mit Warfarin legt nahe, dass die Hämostase hat keine Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Heilung, ist während der Behandlung mit Hydrocortison zur Immunantwort verringern nicht Reepithelialisierung 8 verzögernDie hier vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Zebrafisch Keratozyten Explantatkulturen, die Konsistenz und Reproduzierbarkeit für den Einsatz in vielen biologischen Tests gewährleistet werden kann. Diese Explantatkulturen sind aus mehreren Gründen besonders überzeugende in-vitro-Modell für gemeinsame Zellmigration. Erstens sind die Zebrafisch-Keratozyten Primärzellen innerhalb weniger Stunden nach Gründung Explantatkulturen verwendet. Deshalb wurden diese Zellen nicht die morphologischen Veränderungen der Genexpression und mit dem Durchgang von primären Zellen assoziiert 9-13 unterzogen. Zweitens, stellt dieses System ein Modell für die Untersuchung der Reepithelialisierung in Antwort auf Verwundung 14 und, als Teil der Antwort auf Verwundung eines epithelialen mesenchymale transition Prozess (EMT) initiiert wird, wie Veränderungen in der Genexpression und der Umordnung des Cytoskeletts 14,15 belegt. Somit ändert sich der Hintergrund in der Genexpression und der Beweglichkeit, die in unbehandelten Zellen auftreten wurden charakterisiert und einen Rahmen, um Änderungen bei der Behandlung zu interpretieren. Darüber hinaus die Fische Keratozyten und die menschliche Keratinozyten sind funktionell gleichwertig; beide sind die primären Epithelzellen der jeweiligen Arten und spielen eine Schlüsselrolle in epithelialen Wundheilung. Drittens erwachsenen Zebrafisch werden zunehmend Anerkennung als ein Modellsystem für eine Vielzahl von Krankheiten beim Menschen 16-18 einschließlich Melanomen und anderen Krebs 19-21, kutane Wundheilung 8,14 und Geweberegeneration 22-24.
Technische Vorteile dieses Modellsystems sind gleichermaßen überzeugend. Eine wachsende Zahl von Mutanten und transgenen Linien sind von Non-Profit, zentrale Einrichtungen. Insbesondere wird das Zebrafisch-Mutation Project (ZMP) Am Wellcome Trust Sanger Institute zielt darauf ab, einen KO-Allel in jedem Protein kodierenden Gens im Zebrafisch-Genom zu schaffen. Derzeit haben sie 11.892 Gene, etwa 45% des Genoms mutiert, mit 24.088-Allele aufweist. Darüber hinaus übernimmt ZMP Vorschläge und Knock-outs kostenlos zu generieren. Neue Methoden der Gen-Knockdown in Larven und erwachsenen Zebrafisch 25-28 bieten Flexibilität, um die Funktion von entwicklungspolitisch wichtige Gene für die transgene Ansätze problematisch oder unmöglich zu studieren.
Durch ihre extrem schnelle Raten von Motilität von ~ 145 um / h kurz nach Gründung der Kulturen 29 können Assays schnell (in der Regel in 24 Stunden oder weniger) durchgeführt werden. Wie Versuche kann schnell abgeschlossen werden und Kulturen wachsen gut bei RT mehrere der technischen Hürden mit Säugerzellmigration Assays, die Videomikroskopie vermieden verbunden. Außerdem im Zeitalter der Anzugsforschungsbudgets, zebrafish sind einfach und kostengünstig gepflegt.
Die Struktur und das Verhalten der Explantation ist komplex. Da die Fische nicht ausbluten, wenn die Waage entfernt wird, ist es unwahrscheinlich, dass viel mehr als die oberflächlichen Schichten der Epidermis mit der Waage entfernt. Keratozyten scheinen die vorherrschende Zelltyp in dem Explantat, wenn Skalen werden zunächst aus dem Fisch entfernt, da die große Mehrheit der Zellen scheinen mit einem Anti-E-Cadherin-Antikörper 14 zu färben. Darüber hinaus gibt es keine Hinweise auf Fibroblasten in der Vorkultur wie durch die Abwesenheit von Vimentin Färbung beurteilt durch Immunofluoreszenz 14. Aber mit wiederholter Steinentfernung scheint es zahlreiche Neutrophile in der Explantation (siehe Video 1). Wir haben diese Zellen wie Neutrophile, basierend auf morphologischen Beobachtungen ihrer Größe schnell Motilität und ihre Migration aus der Zelle ausgewiesenen, wenn sie LPS ausgesetzt (Ergebnisse nicht gezeigt). Zusätzlich werden diese Zellen zu färben hell Witzh ein Antikörper gegen Neutrophilen cytosolischen Faktor sowie mit einer Vielzahl von sekundären IgG-Antikörper, was darauf hinweist, dass sie reichlich FcRs auf ihrer Oberfläche haben (Daten nicht gezeigt). Mehrere Zellschichten sind in der Explantation vorhanden. Konfokale Mikroskopie zeigt die Anwesenheit einer einzigen Schicht in der Nähe der Vorderkante, um mehr als zwei Schichten von Keratozyten nahe der Skala mit Neutrophilen sichtbar oberhalb, unterhalb und zwischen den Zellen Keratozyten Blättern.
Zu frühen Zeitpunkten, Zellen auf dem Rand des mehrschichtigen Explantat polarisieren, Initiieren kollektiven Migration Keratozyten aus dem Explantat mit anfänglichen Geschwindigkeiten von ~ 145 & mgr; m / h beträgt. Das von dem Explantat abgedeckt schnell zunimmt, was zu Zellausbreitung, Spannung in dem Blatt, und eine verringerte Vorschubgeschwindigkeit von der Vorderkante. Rapid Umwandlungen zwischen führenden und folgenden Zellen werden an der Vorderkante während der Bildung und der Schließung von spontan gebildeten Löcher in der Folie 7 beobachtet. Wie dieEMT-Prozess mit dem Explantat initiiert weiterhin die Blattfragmente und die Keratozyten verlieren ihre spezielle, schnelle Beweglichkeit. Genexpression und morphologischen Veränderungen, die mit EMT, Wundheilung, und Entzündungsreaktionen auftreten, innerhalb von 7 Tagen Kultur mit Explantaten erwogen fähig ca. 10 Tage 14.
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Protocol
Dieses Protokoll entspricht den AVMA Tierschutzgrundsätze für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an Midwestern University zugelassen.
1. Vorbereitung der Anästhesie, Ausstattung, & Medien
- Entchloren ca. 1,5 l Leitungswasser entweder mit einem kommerziellen Entchlorungsmittel (erhältlich in Zoohandlungen) oder durch stehendes Wasser für 24 Stunden. Wenn Sie drei 1 l Becher und füllen jeweils mit 500 ml entchlortes Wasser. Beschriften Sie eine für das Halten von Fisch vor jedem Verfahren und eine für die Wiederherstellung. Zum dritten Becherglas 100 ug / ml Tricaine Methansulfonat; dies wird das Becherglas, in dem Fische betäubt werden.
- Füllen Sie eine flache Schale mit Eis, warm das Kulturmedium (RPMI 1640, 10% FBS (fötales Rinderserum), 50 ug / ml Gentamycin, 100 ug / ml Kanamycin, 25 mM HEPES) auf RT und sammeln Pinzette sauber Juwelier. Saubere Pinzette durch immersingen die Tipps in 70% Ethanol und durch einen Bunsenbrenner, so dass das Ethanol zu verbrennen.
- Entscheiden Sie, ob das Verfahren wird ohne Vergrößerung mit 2 durchgeführt werden, mit einem handelsüblichen, auf dem Tisch beleuchtete Lupe - 10-facher Vergrößerung oder Binokular (völlig abhängig von persönlicher Vorliebe).
2. Stellen Sie Explantatkulturen
- Fangen Sie die gewünschte Anzahl von Fischen und in einen Haltebecher. Übertragen einer einzigen Fisch auf die Anästhesie-Becher; ist es am besten, um Fische einzeln zu betäuben.
- Überwachen Sie die Auswirkungen der Narkose durch Beobachtung der Schwimmen und Kiemen Bewegung des Fisches. Als Narkosefortschreiten verlangsamt Kiemen Bewegung und die Fische werden unregelmäßig und häufig auf den Kopf zu schwimmen; betrachten Fische betäubt, sobald Kiemen Bewegung aufhört. Haben die Fische verlassen nicht für längere Zeit in der Anästhesie Bad, da dies zu den Tod der Fische führen.
- Fisch aus der Narkose Becher und Transfer entfernenEis, indem die Fische horizontal mit dem Schwanz vor der Hand, die Pinzette. Wenn mit der Technik und wenn erfahrene mehrere Fische verwendet werden, um Explantate zu machen, in Betracht ziehen, den nächsten Fisch im Narkose Becher zu diesem Zeitpunkt.
- Um Schuppen zu entfernen, Position Pinzette parallel zum Fisch mit Spitze am Rand der Skala. Drücken Flachseite der Pinzette leicht in die Seite des Fisches zu bewirken, dass die Skala auf dem Körper des Fisches zu erhöhen. Fassen Skala mit einer Pinzette zupfen und Ort (ohne Inversion) in Gewebekulturschale. Wiederholen Sie das Verfahren, das Entfernen maximal 12 Waagen aus einer großen Erwachsenen (6 von jeder Seite), die Vermeidung der Kiemenregion, die Seitenlinie, und Flossen.
- Den Fisch in die stabile Becher und zu überwachen, um sicherzustellen, dass sie von den Auswirkungen der Narkose erholt. Zu diesem Zeitpunkt können die Fische zurück zu einem einzelnen Tank überführt werden. Lassen Sie den Fisch, der für mindestens 21 Tage zu erholen, um eine vollständige Skala Regeneration zu ermöglichen.
- Abhängig von derexperimentelles Design, legen Sie bis zu 20 Waagen pro Kunststoff 35 mm Gewebekultur-behandelte Schale oder 4-6 Skalen pro Glasbodenschale. Lassen Skalen auf dem Teller vor sanft Hinzufügen von Medien, um nicht Schuppen aus der Schale lösen haften.
HINWEIS: Mit zunehmender Erfahrung kann mehrere Fisch verarbeitet werden, bevor Medien dem ersten Schale zugegeben. - Fügen Sie 1,2 ml Vollmedium (siehe 1.2) in jede 35-mm-Schale.
- Explantatkulturen vorzugsweise inkubieren bei 28 ° C in 5% CO 2 für den gewünschten Zeitraum mit oder ohne zusätzliche Behandlung. Alternativ inkubieren Kulturen auf einem geheizten Mikroskoptisch oder in einem Live-Zellkulturkammer für Videomikroskopie.
3. Hellfeld und Videomikroskopie
- Position Schalen mit Zellschichten auf den Mikroskoptisch und zunächst mit dem Fokus 4X Objektiv.
HINWEIS: Höhere Vergrßerungen können verwendet werden, je nach dem Experiment. Kennzeichnung die Positionjede Zellschicht und / oder Orientierung der Schale auf der Bühne erleichtert die Aufnahme von Bildern über die Zeit, wobei die Blätter in etwa gleicher Ausrichtung. - Gerichte aus dem Inkubator und fotografieren zu verschiedenen Zeitpunkten zu entfernen, nach jeder Versuchsprotokoll und legen Sie wieder in den Inkubator, wenn nur Standbilder werden über die Versuchszeitrahmen benötigt.
- Bei der Durchführung von Videomikroskopie, achten Sie auf die folgenden:
- Positionieren der Skala / Schwellenzellschicht im Sichtfeld, so dass die Migration von Zellschicht in dem Sichtfeld für die Dauer des Video bleibt.
Hinweis: Dies kann einige Erfahrung in der Beobachtung, wie Zellen wandern unter dem Maßstab zu nehmen. Für kurze Videos, ist dies weniger ein Problem als für längere Videos. - Bei kürzeren Zeitrahmen, Inkubation bei RT. Bei längeren Zeitrahmen (18 + h), mit einem beheizten Stufe oder eine Inkubationskammer auf Temperatur zu halten, pH-Gleichgewicht, und das Verdampfen des Kultur m minimierenedium.
- Positionieren der Skala / Schwellenzellschicht im Sichtfeld, so dass die Migration von Zellschicht in dem Sichtfeld für die Dauer des Video bleibt.
4. Fixierung für Immunfluoreszenz-Mikroskopie
- Vorbereiten und pre-warmen alle Lösungen auf 28 ° C. Um Keratozyten unter Fluoreszenz anzuzeigen, Explantatkulturen wachsen wie oben mit Glasboden-35-mm-Gewebekulturschalen beschrieben. Alternativ können Sie auch Glaskammer gleitet.
- Hinzufügen von 0,8 ml 4% Paraformaldehyd in 1,1 x PBS zu jeder Schale. Den Kulturmedien herausgezogen haben. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen.
- Hinzufügen von 0,8 ml 4% Paraformaldehyd in 1,1 x PBS zu jeder Schale. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen.
- Sofern nicht mit externen Liganden oder externen Epitope permeabilisieren Zellen durch Zugabe von 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in PBS 1X. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min ansaugen dann zu der Lösung zu entfernen.
- 0,5 ml von 1% BSA in 1 × PBS und Inkubation für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C).
HINWEIS: Je nach Versuchsbedingungen phalloidin kann in diesem Schritt zugegeben werden. - Nach der Inkubation zum Ansaugen der Lösung zu entfernen und fahren Sie mit Antikörperfärbung. Alternativ speichern die Kulturschalen durch Zugabe von mindestens 1 bis 2 ml 1% BSA in 1 × PBS für 3-4 Wochen bei 4 ° C.
5. Immunfluoreszenz-Protokoll
- Bereiten primären und sekundären Antikörper-Lösungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
HINWEIS: Wenn die Empfehlungen des Herstellers verfügbar sind, ein guter Ausgangsverdünnung von primären Antikörpern (in 1% BSA in 1 × PBS) 1: 500 für polyklonale und 1: 1000 für monoklonale Antikörper; ein guter Ausgangsverdünnung für Sekundärantikörper 1: 1.000. Passen Sie diese Verdünnungen der ursprünglichen Bestand des Herstellers vorliegt höher, wenn das Signal schwach ist, geringer, wenn das Signal stark und Hintergrund ist ein Problem. - Saugen Sie das 1% BSA in 1x PBS-Lösung. 0,5 ml der primären Antikörperlösung, Inkubation für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C). Entfernen Sie den primären Antikörperlösung, legen Sie in eine saubere und etikettiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C.
ANMERKUNG: Dies ermöglicht die Wiederverwendung des primären Antikörpers, wenn nötig. - Mit 1x PBS 5-mal, das Entfernen und Verwerfen des PBS nach jeder Wäsche - Waschen Sie die Teller 3.
- 0,5 ml der sekundären Antikörper-Lösung. Wenn gewünscht, fügen fluoreszenzmarkierten Phalloidin (nach beliebiger Hersteller empfohlenen Konzentration) bei diesem Schritt. Inkubieren für 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder O / N (bei 4 ° C).
HINWEIS: Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Phalloidin erlaubt die Visualisierung von Aktin-Filamenten; Wir haben gefunden, daß 488-markiertem Phalloidin funktioniert am besten in unserer Zebrabärbling Keratozyten, aber auch andere Fluorophore verwendet werden. - Entfernen und entsorgen Sie die sekundäre Antikörperlösung.
- Mit 1x PBS 5-mal, das Entfernen und Verwerfen des PBS nach jeder Wäsche - Waschen Sie die Teller 3.
HINWEIS: Das Gericht kann gespeichert werden, von Licht bedeckt, bei 4 ° C, wenn nicht view sofort; stellen Sie sicher, 1x PBS wird vor dem Speichern, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen, aber warm auf RT in die Schale gegeben (20 - 30 min), und nehmen Sie die PBS kurz vor Sie mit dem nächsten Schritt. - Wenn Sie bereit sind, zu beobachten, fügen Sie 2-3 Tropfen einer Einschlussmittel, mit oder ohne DAPI, abhängig von den experimentellen Anforderungen, in die Schüssel und lassen Sie sich für 10 min bei RT.
HINWEIS: Wir verwenden ein handelsübliches, Glycerinbasis Eindeckmedium mit DAPI, aber auch andere Befestigungsmittel können angewendet werden. Zulassen 10 min für das Fixiermittel in der Schale sitzen, erleichtert die Entfernung des Deckglases aus dem Boden der Schale. - Nach der Inkubation drücken Sie leicht auf die Seiten der Schale zu lösen und entfernen Sie das Deckglas. Fügen Sie einen zusätzlichen Tropfen Eindeckmittel auf einen Objektträger und legen Sie das Deckglas, Zellen nach unten, auf die Folie.
HINWEIS: Betrachten Abdichtung der Deckglas auf den Objektträger mit klarem Nagellack, wenn der Schieber muss länger als 1 gehalten werden - 2 Tagen. - Beachten Sie die Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop.
HINWEIS: Die meisten unserer Bilder wurden mit einem 40X oder 63X Objektiv unter Ölimmersion genommen, aber die spezifischen verwendeten Objektivlinse wird auf dem Versuchsprotokoll ab.
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Representative Results
Wie in Figur 1 dargestellt ist, können Blätter von Keratozyten Migration aus unter der Skala innerhalb von Stunden nach Errichtung der Explantatkultur beachten. Gelegentlich kann ein individuell Migration Keratozyten, die aus dem gemeinsam Migration Blatt weggebrochen wurde, einzuhalten ist. Zusätzlich, da das Explantat von einem Fisch, der zuvor gezupft worden hergestellt ist, gibt es reichlich Neutrophilen migrieren durch die Folie. Bei längeren Kulturzeiträume, die Keratozyten Blatt Fragmente als Zellen durchlaufen EMT 14.
Die Anfangsgeschwindigkeit der Bogenförderung ist extrem schnell, aber dieser Satz schnell verlangsamt als Zellen verteilt (gemessen durch Bereich und die Kernabstand zu erhöhen ~ 1,8 und ~ 3,1 bzw. fach) während der ersten 48 Stunden der Kultur (2A-C). Die rasche Zunahme ist nicht mit der Zellproliferation assoziiert sind; nach Markierung für 24 Stunden mit dem fluoreszierenden Thymidin analoge Ethinyl Desoxyuridin (EDU), ~ 10% der Zellen Beweise der Zellteilung zeigen, eine Rate deutlich niedriger als in transformierten Zelllinien gesehen, aber mehr im Einklang mit den Zellen in Reepithelisierung in menschlichen organotypischen Kulturen 30 beteiligt. Zu späteren Zeitpunkten, die Blattfragmente (ein Phänomen, bei dem in diesem System 14 beobachtet EMT assoziiert), die das Vorrücken der Vorderkante schwierig macht, zu messen.
Die von Blätter nach 24 Stunden abgedeckt, kann als schnelle Bildschirm für die Fähigkeit von Verbindungen, kollektive Zellmigration 15,31 verändern werden. Wenn die Behandlung zum Zeitpunkt Explantate fest zugegeben, kann eine Dosis-Antwort im Blattbereich gesehen werden. Einige Säugetier Zytokinen (zB TGF-1 15), Chemokine (wie CXCL12) und niedermolekularen Inhibitoren ursprünglich in Säugetiersystemen gekennzeichnet (zB MMP-2, -9 und -13-Hemmer 31) erfolgreich eingesetzt. Doch wie Blattbereiche bei 24 Stunden nicht normalverteilt sind (
In vielen Fällen werden die Effekte der Behandlung (en) am Sammel Migration in kürzeren Zeiträumen beobachtet. In diesen Fällen kann der Videomikroskopie verwendet werden, um Reaktion der kollektiv Migration Folie einer Assay werden. Als lösliche RGD enthaltende Peptid in das Kulturmedium (dritte Platte in 4) zugegeben, um eine störendhesion Bildung, die Lamellen an der Vorderkante des Blattes schrumpfen rasch und nachfolgend die Vorderkante der Folie ablöst, und zieht sich zurück. Da die gesamte Platte fährt in weniger als 2 min, kann die Antwort des Blattes auf die Behandlung schnell.
Um die Lokalisierung von Proteinen innerhalb des Blattes oder in führenden und folgenden Zellen zu beurteilen, kann das gesamte Blatt fixiert und gefärbt, wie in Figur 5 gezeigt ist. Es muss während des Fixierungsprozesses genommen, wie die Zellschichten werden leicht aufgebrochen werden. In unseren Händen, viele polyklonalen Antikörpern an die funktionellen Domänen von Säugetierproteinen (insbesondere der cytosolischen Proteine) haben sich kreuzen im Zebrafisch Explantate reagieren.
Abbildung 1. Kollektive Migration von Zellschichten. Nach Gründung im Explantatkultur, Keratozyten migrierenvon unterhalb der Skala als kollektive Einheit. (A) zeigt die relative Menge an Zellen, die sich vom Umfang nach 2 h in Kultur gewandert sind, mit (BE) entnommen wird stündlich danach (3-6 h, beziehungsweise). Alle Bilder wurden bei 100-facher Vergrößerung. Die gesamte Sequenz wird in Video 1 gezeigt ist; ein Rahmen wurde alle 30 Sekunden über die 6 Stunden Zeit genommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Merkmale der Kollektive Migration. Initial Vorschubgeschwindigkeit von der Vorderkante, gemessen an mehreren Stellen ist eine schnelle, aber verlangsamt sich während der ersten 24 Stunden in Kultur (A). Die Messung der Kernabstand und Zellenbereich mit cultures bei 4 fixiert und 24 Stunden und mit DAPI und Phalloidin als Referenz gefärbt zeigen, dass im gleichen Zeitraum sowohl die Kernabstand (von der Mitte eines jeden Kerns gemessen) und erhöht die Zellfläche (gemessen als Fläche durch den kortikalen Aktin eingeschlossen Zytoskelett, (B) und (C) jeweils). Jedes Diagramm gibt den Mittelwert (± SEM) von drei unabhängigen Experimenten in dreifacher Ausführung. Diese Zahl hat sich von Rapanan et al modifiziert. 7 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Bestimmung von Collective Migration mit Zellblatt Bereich. Wenn während der Einrichtung der Kultur zu dem Kulturmedium zugegeben, Peptide Z-PLG-NHOH (breites Spektrum MMP) und niedermolekulare SB-3CT (MMP2 und 9 spezifisch) Inhibitoren verringern Zellage Bereich nach 24 Stunden in Kultur (A). Da der Bereich der unbehandelten Zellschichten exponentiell verteilt (B), sollten die Daten als Mittelwerte mit Standardfehler der bestimmt, wie im Text beschrieben und in blau (obere Referenzgrenze oder die URL und unteren Referenzgrenze oder LRL angegeben Median aufzuzeichnen; ( C)). Der Unterschied zwischen dem Median und dem URL und LRL bestimmen die Größe der Fehlerbalken in der Grafik (in hellgrün schattiert). Diese Zahl hat sich von McDonald et al modifiziert. 31 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Zugabe von Lösliche RGD-Peptid führt zu Blattrückzugs. Bei der Vorbehandlung und nach Zugabe eines RGE enthaltenden Peptids, geht die Zellschicht, um fortzufahren. 15 sec nach Zugabe eines RGD enthaltenden Peptids, gibt es eine Abnahme in den Lamellen an der Vorderkante (Inserts). Nach weiteren 30 Sekunden beginnt das Blatt zurückziehen, einen Widerruf, die während der Dauer des Videos fortgesetzt (insgesamt Videolänge ca. 5 min, siehe Video 2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Immunofluoreszenzassay. Die Zellen wurden mit einem Antikörper gegen die katalytische Domäne von MMP14a (rot) gefärbt und mit fluoreszenzmarkierten (488) Phalloidin (grün) und / oder DAPI gegengefärbt(Blau). (A) und (B) sind eine typische 4 h Blatt, die sich aus der Skala, während (C) und (D) einen Teil eines typischen 24-Stunden-Blatt zeigen. Alle Bilder wurden bei 400-facher Vergrößerung. Beachten Sie, dass die Intensität der Färbung MMP14a höher an der Spitze der Schwellenzellschichten (in (B zu sehen ist) und (D)) und prominente Lamellipodien sind in den Leader-Zellen (A) und (C)) zu sehen. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Der entscheidende Schritt für den Erfolg der Keratozyten Explantatkultur wird kann die Waage in die Kulturschale für etwa 2 haften - 3 Minuten vor der Zugabe von dem Kulturmedium. Etwa 75% der Schuppen haften und wachsen Blätter (die Anzahl der Kulturen für jedes Experiment etabliert müssen entsprechend angepasst werden). Keratozyten Blätter sind nicht an jeder Waage aus dem Fisch herausgenommen und in der Kultur aus verschiedenen Gründen getätigt. Zuerst DAPI-Färbung von Explantaten auf, dass einige Skalen haben wenige Zellen gebunden und somit wird erwartet, dass diese Skalen wird keine Blätter Keratozyten. Zweitens ist die Fähigkeit der Explantate auf das Gewebekulturschale haften eine wesentliche Voraussetzung für die Blatt Migration. Ein wichtiger Faktor dafür, ob Waage halten und ein erfolgreiches Explantatkultur hergestellt ist die Zeit zwischen Platzieren Sie die Waage auf der Wachstumsoberfläche und der Zugabe von Medien. Zu wenig Zeit, um ohne Medien haftet Skalen führen floating in Medien (manchmal mit sichtbarem Gewebe befestigt), während eine zu lange Periode in Schuppung ohne Wachstum (vermutlich durch Austrocknung des Explantats mit Zellreste am Rand der Verkauf sichtbar) führen. Die Zeit zwischen den Skalen Platzierung in der Schale und die Zugabe von Wachstumsmedium muss möglicherweise experimentell als Faktoren wie Temperatur und Feuchtigkeit im Laborraum kann beeinflussen, wie schnell Zellen können an der Schale ohne auszutrocknen haften bestimmt werden.
Obwohl die Anzahl von im Handel erhältlichen, Zebrafisch-spezifischen Antikörpern erhöht, kann die Vielzahl der verfügbaren Reagenzien limitierend sein. Eine 85% Homologie zwischen Immunogen und Zielprotein ist in der Regel notwendig, Kreuzreaktivität erachtet. Als funktionelle Domänen wie Stellen, Protein-Protein-Wechselwirkungsstellen und Stellen der Modifikation sind jedoch stärker konserviert als andere Bereiche des Proteins, können anti-Peptid-polyklonalen Antikörper gegen diese Regionen gerichtet werden häufigverwendet, auch wenn Gesamthomologie ist gering. Obwohl beispielsweise Zebrafisch MMP14a eine insgesamt 68% Identität mit dem menschlichen Orthologs hat (erwarten Wert = 0), den Anteil der Identität steigt auf 79 bis 96% bei der katalytischen und Protein-Bindungsstellen, während Spaltstellen sind ähnlich hoch konserviert 31. Die Daten legen nahe, dass ein Antikörper zu dem katalytisch aktiven Zentrum des menschlichen MMP14a gerichtet Kreuzreaktion mit Zebrafisch Keratozyten Kulturen. Der Vorschlag, dass die Färbung in Zebrabärbling Blättern können zu den gestreckten Zellen an der Vorderkante 31 zu lokalisieren, ist in Übereinstimmung mit anderen Daten, die auf die MMP14 kann als ein mechanischer Sensor 32 dienen.
Es ist nicht möglich, eine völlig sterile Explantat von einem Fische schwimmen in Aquarien unsteril Wasser zu schaffen. Da die meisten unserer Experimente sind innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen ist, erleben wir keine Probleme mit Bakterien- oder Pilzbefall von Explantaten. Wenn jedoch mehr Inkubationszeiten gewünscht werden, die Sterilität of Explantate kann zu einem Problem werden. Bei der Planung eines Experiments mit 3 oder mehr Tagen Inkubation werden verschiedene Vorkehrungen getroffen, um die Wahrscheinlichkeit, dass die Kulturen bleiben unberührten erhöhen. Erstens, um die bakterielle Belastung zu reduzieren, wird der Fisch für etwa 1 Stunde in 3 Wechsel frischen schwimmen, dechloriert Leitungswasser mit oder ohne die Zugabe von 100 & mgr; g / ml Kanamycin. Zweitens wird das Medium täglich ausgetauscht, um ein angemessenes Maß an Antibiotikum zu erhalten und die Zahl der gegebenenfalls vorhandenen Bakterien. Bei besonders langen Inkubationszeiten (> 5 Tage) drei Wäschen mit 1x PBS mit jedem Medienaustausch durchgeführt. Dies führt jedoch eine Variable, die in dem experimentellen Design berücksichtigt werden müssen, wenn die Explantatkultur ist mit einer exogenen Verbindung behandelt, da dies benötigen, um mit den Medien ersetzt werden können. Darüber hinaus wird Zytokine und Wachstumsfaktoren, die vom Explantat sezerniert bei jedem Medienaustausch entfernt werden. Da jedoch die Anzahl von Zellen ist gering und das Volumen des Mediengroß ist in einem typischen Keratozyten Explantat kann dieser Effekt nicht wesentlich ist.
Als Fischschuppen benötigen 3 Wochen, um vollständig zu regenerieren 33, empfehlen wir, so dass die Fische in diesem Zeitraum der Zeit, bis die wiederholte Verwendung der Fische in Versuchen zu erholen. Obwohl die Reform der Epithelschicht tritt viel schneller gehen wir davon aus, dass diese Wartezeitdauer zwischen den mit der gleichen Fisch die Chance für eine systemische inflammatorische Effekte, die in kutanen Wundheilung Fisch 34 berichtet wurde, minimiert.
Explantate werden seit langem verwendet, um das Verhalten von Epithelzellen zu studieren. Explantaten aus einer breit Vielzahl von Fischarten und Amphibien haben ähnliche bewegliche Objekte an den individuellen und kollektiven Zellmigrationswerte 3-6,35-37. Diese Zellen haben deutlich unterschiedliche Eigenschaften als motile Säuger Explantate aber die gesamte Struktur und die Organisation erscheint, um einen hohen Grad der Ähnlichkeit 8,30,38 haben 14 werden.
Wir haben festgestellt, dass dieses Protokoll ermöglicht es uns, die kollektive Migration von Zebrafisch-Keratozyten mit primären Zell Explantate, die die frühen Phasen der Wundheilung 14 Modell studieren. Experimente unter Verwendung von neu geschaffenen Primärkulturen vermeidet Probleme mit der seriellen Passage von Primärzellen oder die Verwendung von transformierten Zellinien verbunden. Explantate verwendet werden, um die Rolle von EMT der kutanen Wundheilung studieren als EMT wird eingeleitet, wenn Kulturen etabliert werden wird. Unsere Studien deuten darauf hin, dass diese primäre Explantate genauer imitieren das natürliche Verhalten und die Migration von Keratozyten im verwundet Epithelschicht in vivo. Dieses Protokoll bildet die Grundlage für den Aufbau Primärkulturen für den Einsatz in Migrationsassays sowie für die Prüfung der Veränderungen in der Gen und / oder die Proteinexpression in einer scheinbar endlosen Reihe von experimentellen conditIonen. Die Verfahren sind schnell, einfach, kostengünstig, reproduzierbar und geeignet für den Einsatz in jedem Forschungseinrichtung.
Zusammenfassend stellt diese Explantat-Technik einen Schnelltest zur kollektiven Zellmigration im Kontext eines Wundheilungsmodell, die Gegenstand einer EMT. Die Anwesenheit von mehreren Zelltypen, die in mehreren Schichten mit einer Orientierungsmaßstab bietet Komplexität dieser ex vivo Kultursystem.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant EEH und Midwestern University Office of Research und Sponsored Programme Intramural Grant KJL verliehen unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
References
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