Summary
keratocytes דג הזברה להעביר בגיליונות תא מexplants ולספק מודל במבחנה לחקר המנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של ריפוי פצע אפיתל. פרטים אלה פרוטוקולי דרך יעילה להקמת תרבויות explant עיקריות לשימוש במבחני נדידת תאים קולקטיביים.
Abstract
בשל המאפיינים הייחודיים שלהם ניע, keratocytes הדגים ניתק מתרבויות explant כבר מזמן משמשות כדי לחקור את המנגנונים של נדידת תאים בודדת. עם זאת, כאשר explants הוקם, תאים אלה גם לנוע באופן קולקטיבי, שמירה רב של התכונות ההופכות את פרט keratocytes מודל אטרקטיבי ללמוד הגירה: שיעורים מהירים של תנועתיות, lamellae אקטין עשיר נרחב עם כבל אקטין בניצב, ומהירות קבועה יחסית ו כיוון ההגירה. בexplants המוקדם, הדדי המהירה של תאים נודדים באופן אישי עם אלה נודדים באופן קולקטיבי מאפשר הלימוד של התפקיד של הידבקויות תאי תאים בקביעת המצב של הגירה, ומדגיש את הקישורים המולקולריים בין שני המצבים של הגירה. תאים בexplants מאוחר יותר לאבד את היכולת שלהם לנוע במהירות ובאופן קולקטיבי כאפיתל מעבר mesenchymal מתרחש וגנים הקשורים לריפוי פצעים ודלקת באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי. לפיכך, explants keratocyte יכול לשמש כמודל במבחנה לreepithelialization המתרחש במהלך ריפוי פצע עורי ויכול לייצג את מערכת ייחודית ללמוד מנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של תכנית מוגדרת של שינויי ביטוי גנים. מגוון רחב של קווי דג הזברה מוטציה ומהונדסים זמין, המאפשר explants שיוקם מדגים עם רקע גנטי שונה. זה מאפשר את התפקיד של חלבונים שונים בתוך תהליכים אלה יש לטפל באופן ייחודי. הפרוטוקולים המפורטים כאן מתארים שיטה קלה ויעילה להקמת תרבויות explant אלה לשימוש במגוון רחב של מבחני הקשורים לנדידת תאים קולקטיבית.
Introduction
מחקרים של תנועתיות תא התמקדו בעיקר בתאים בנפרד נודדים. Keratocytes תרבית מדגים ודו-חי explants הוכיח להיות מערכת מודל רבת עוצמה כדי לחקור את המנגנונים של תנועתיות תא באמצעות מודלים מתמטיים והן ניסיוניים גישות 1-6. עבודה ניסויית בתאים בנפרד נודדים נעזר בתנועה המהירה, חלקת הגלישה של התאים, תוך שמירה על צורה, מהירות, וכיוון אחיד. עם זאת, in vivo, תאים לעתים קרובות לעבור באופן קולקטיבי, תוך שמירה על צמתים תא-תא, במיוחד בעובר, ריפוי פצעים, וגרורות. לפיכך, נדידת תאים קולקטיבית הוא אזור גידול והבולט יותר ויותר של מחקר בתחום של נדידת תאים. לאחרונה ההגירה הקולקטיבית של תאים אלה תוארה 7 ויש לו תכונות ייחודיות רבות ההופכות אותו למערכת רבת עוצמה כדי לחקור נדידת תאים קולקטיבית במודל ריפוי פצע.
"> כאשר מאזניים קטפו מדג זברה מבוגרת בהרדמה, כמה רקמות אפיתל נשארה מחוברת לחלק התחתון של הסולם. כאשר מדיום תרבית תאים הוא הוסיף, תאי האפיתל אלה, או keratocytes ove_content, להעביר במהירות כיחידה קולקטיבית מהסולם. ניתן לצפות בתרבות explant כמודל ריפוי פצע אפיתל, שבו התאים לנדוד הרחק מexplant כפי שהם היו על פני המטריצה הזמנית של פצע המיטה כדי לבסס מחדש את האפיתל ללא פגע. נתונים אחרונים מצביעים על כך שvivo לשעבר זה מחקה תרבות תכונות רבות של in vivo ריפוי הפצע בדג זברה מבוגרת. שיעורי סגירת פצעים 8 לתרגם למהירות הגירה דומה לזה שנצפה במערכת vivo לשעבר 7. בנוסף, בפצע in vivo ריפוי מודל, הטיפול בקומדין מצביע על כך שיש עצירה דימום אין כל השפעה על שיעור של ריפוי, בעוד שהטיפול בהידרוקורטיזון כדי להקטין את התגובה חיסונית לא לעכב reepithelialization 8הפרוטוקול המובא כאן מתאר כיצד להקים תרבויות explant keratocyte דג הזברה שלהבטיח עקביות ושחזור לשימוש במבחנים רבים ביולוגיים. תרבויות explant אלה הן משכנעים במיוחד במודל חוץ גופית לנדידת תאים קולקטיבית מכמה סיבות. ראשית, keratocytes דג הזברה הם תאים ראשוניים בשימוש בתוך שעות של הקמת תרבויות explant. לכן, תאים אלה לא עברו שינויים מורפולוגיים וביטוי גנים הקשורים למעבר של תאים ראשוניים 9-13. שנית, מערכת זו מהווה מודל לחקר reepithelialization בתגובה לפציעתם 14 ו, כחלק מהתגובה לפציעה, אפיתל לtr mesenchymalansition תהליך (EMT) הוא יזם כפי שמעיד שינויים בביטוי הגנים וארגון מחדש cytoskeletal 14,15. לפיכך, השינויים בביטוי הגנים הרקע ותנועתיות המתרחשים בתאים שלא טופלו כבר מאופיינים ולספק הקשר לפרש שינויים בטיפול. יתר על כן, keratocyte הדגים וkeratinocyte האנושית הן תפקודיות שווי ערך; שניהם תאי האפיתל העיקריים של מיניהם ולשחק תפקיד מפתח בריפוי פצע אפיתל. דג הזברה שלישית, מבוגר זוכה להכרה כמערכת מודל עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם 16-18 כוללים מלנומה וסוגי סרטן אחרים 19-21, פצע cutaneous ריפוי 8,14 ורקמות התחדשות 22-24.
יתרונות טכניים של מערכת מודל זה הם פחות משכנעים. מספר הולך וגדל של קווים מוטנטים ומהונדסים זמינים ללא כוונת רווח, מתקנים מרכזיים. באופן ספציפי, דג הזברה מוטצית הפרויקט (ZMP) בWellcome Trust סנגר המכון שואף ליצור אלל נוקאאוט בכל חלבון קידוד גנטי בגנום דג הזברה. נכון לעכשיו, יש להם מוטציה 11,892 גנים, כ -45% מהגנום, עם 24088 אללים מאופיינים. בנוסף, ZMP מקבל הצעות ויפיק לדפוק outs ללא תשלום. השיטות האחרונות במציאת גן בדג זברה זחל והמבוגר 25-28 לספק גמישות ללמוד את הפונקציה של גנים חשובים מבחינה התפתחותית שלגישות מהונדסים הן בעייתיות או לא מעשיות.
בשלהם שיעורים מאוד מהירים של תנועתיות ~ 145 מיקרומטר / hr זמן קצר לאחר הקמתה של תרבויות 29, ניתן להשלים במהירות מבחני (בדרך כלל 24 שעות באו פחות). כפי שניתן הושלמו ניסויים במהירות ובתרבויות לגדול גם ב RT, כמה מהמכשולים הטכניים הקשורים למבחני נדידת תאי יונקים מעורבים מיקרוסקופיה וידאו נמנעים. בנוסף, בגיל של הידוק תקציבי מחקר, zebrafish נשמרים בקלות ובזול.
המבנה וההתנהגות של explant הוא מורכב. כדגים לא לדמם כאשר קנה המידה מוסר, אין זה סביר כי הרבה יותר משכבות אפידרמיס השטחיות יוסרו עם הסולם. Keratocytes נראה סוג התא הדומיננטי בexplant כאשר קשקשים לראשונה הוסרו מהדגים כמו הרוב המכריע של תאים מופיעים להכתים עם נוגדן אנטי E-cadherin 14. יתר על כן, אין ראיות של fibroblasts בתרבות הראשונית כמו להישפט על ידי העדר כתמי vimentin על ידי immunofluorescence 14. עם זאת, עם הסרת קנה מידה חוזרת ונשנית, נראה שיש מספר רב של נויטרופילים בexplant (ראה וידאו 1). אנו זיהינו תאים אלה כנויטרופילים המבוססים על תצפיות מורפולוגיים לגודל שלהם, במהירות תנועתיות, והגירתם אל מחוץ לגיליון התא בעת החשיפה לLPS (מידע לא מוצג). בנוסף, תאים אלה כתם בהיר שנינותh נוגדנים לגורם cytosolic נויטרופילים, כמו גם עם מגוון רחב של נוגדני IgG משניים, אשר מציין כי יש להם בשפע FcRs על פני השטח שלהם (מידע לא מוצגים). שכבות תאים מרובות נמצאות בתוך explant. מיקרוסקופיה Confocal חושפת את הנוכחות של שכבה אחת ליד הקצה המוביל ליותר משתי שכבות של keratocytes ליד קנה המידה עם נויטרופילים נראים מעל, מתחת, ובין סדיני keratocyte התא.
בנקודות זמן מוקדמות, תאים בקצה לקטב explant הרב שכבתי, ייזום הגירה קולקטיבית של keratocytes מexplant בשיעורים ראשוניים של ~ 145 מיקרומטר / hr. האזור המכוסה על ידי explant מגדיל במהירות, מה שמוביל לתא התפשטות, מתח בתוך גיליון, ושיעור ירידה במראש של הקצה קדמי. interconversions המהיר בין תאי מנהיג וחסיד הם נצפו בקצה המוביל במהלך ההיווצרות וסגירת חורים שנוצרו באופן ספונטני בתוך גיליון 7. כתהליך EMT יזם עם explant ממשיך, הברים וכו 'וkeratocytes לאבד תנועתיות מיוחדת, המהירה. ביטוי גנים ושינויים מורפולוגיים בקנה אחד עם EMT, ריפוי פצעים, ותגובות דלקתיות להתרחש תוך 7 ימים של תרבות עם explants נשקלים קיימא עבור כ 10 ימים 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה תואם את עקרונות הרווחה AVMA בעלי החיים לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה ואושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטה במערב התיכון.
1. הכנת ההרדמה, הציוד, ומדיה
- Dechlorinate כ -1.5 ליטר של מים ברז או באמצעות סוכן מסחרי dechlorinating (זמין בחנויות לחיות מחמד) או על ידי ומאפשר עמדת מים למשך 24 שעות. להשיג שלוש 1 כוסות L ולמלא כל אחד עם 500 מיליליטר מים dechlorinated. תווית אחת להחזקת דגים לפני כל הליך ואחד להתאוששות. לכוס השלישית, להוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר של methanesulfonate tricaine; זה הופך את הכוס שבדגים יהיו בהרדמה.
- מלא מגש רדוד עם קרח, לחמם את מדיום התרבות (1640 RPMI, 10% FBS (בסרום שור עוברי), 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, 100 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 25 מ"מ HEPES) לRT, ולאסוף פינצטה של צורף נקי. פינצטה נקייה על ידי immerלשיר הטיפים באתנול 70% ועוברים דרך מבער בונזן, המאפשר אתנול לשרוף.
- להחליט אם ההליך יבוצע ללא הגדלה, עם זכוכית מגדלת מסחרית, טבלה עליונה מואר עם 2 - 10X הגדלה, או לנתח מיקרוסקופ (תלוי לחלוטין בהעדפה אישית).
2. הקמת תרבויות explant
- לתפוס את המספר הרצוי של דגים ומקום בכוס אחזקה. העבר את דג בודד לכוס ההרדמה; עדיף להרדים דגים בנפרד.
- לעקוב אחר ההשפעות של הרדמה על ידי התבוננות תנועת שחייה וזימים של הדג. כהרדמה מתקדמת, תנועת זימים מאטה והדגים ישחו בצורה לא יציב ולעתים קרובות במהופך; לשקול דגים הרדימו בהקדם תנועת זימים מפסיקה. אל תשאירו את הדגים לתקופות ארוכות יותר באמבטיה ההרדמה כמו זה עלול לגרום למותם של הדגים.
- הסר דגים מכוס ההרדמה וההעברהלקרח, הצבת הדגים אופקי עם הזנב מול מחזיקה פינצטה ביד. אם חווה עם הטכניקה ואם דגים מרובים לשמש כדי להפוך את explants, לשקול הצבת הדגים הבאים בכוס ההרדמה בשלב זה.
- כדי להסיר קשקשים, פינצטה עמדה במקביל לדג עם קצה בקצה קנה המידה. לדכא צד שטוח של פינצטה מעט לצדו של הדג כדי לגרום לקנה המידה לרומם מהגוף של הדג. אחוז בקנה מידה עם פינצטה, למרוט, ומקום (ללא היפוך) בצלחת תרבית רקמה. חזור על התהליך, הסרת מקסימום של 12 קשקשים ממבוגרים גדולים (6 מכל צד), הימנעות אזור הזימים, קו הרוחב, וסנפירים.
- מניחים את הדגים לתוך כוס ההתאוששות ולפקח כדי להבטיח שהיא מתאוששת מההשפעות של הרדמה. בשלב זה, ניתן להעביר בחזרה לדגי טנק בודד. לאפשר לדגים להתאושש במשך לפחות 21 ימים כדי לאפשר להתחדשות בקנה מידה מלאה.
- בהתאם לעיצוב ניסיוני, למקם עד 20 סולמות לכל צלחת שטופלה תרבות פלסטיק 35 מ"מ רקמה או 4-6 קשקשים לכל צלחת זכוכית תחתונה. לאפשר קשקשים לדבוק בצלחת לפני הוספה בעדינות תקשורת כדי לא לנתק את הקשקשים מהצלחת.
הערה: עם ניסיון, יכולים להיות מעובד דגים מרובים לפני התקשורת מתווספת למנה הראשונה. - להוסיף 1.2 מיליליטר של מדיה מלאה (ראה 1.2 לעיל) לכל מנה 35 מ"מ.
- רצוי דגירה תרבויות explant על 28 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 לתקופה הרצויה של זמן, עם או בלי טיפול נוסף. לחלופין, דגירה תרבויות על במה מיקרוסקופ מחוממת או בתוך חדר תרבות תא חי למיקרוסקופיה וידאו.
3. Brightfield ומיקרוסקופי וידאו
- מנות עמדה המכילות גיליונות תא לבמה מיקרוסקופ ותחילה להתמקד באמצעות העדשה האובייקטיבית 4X.
ניתן להשתמש בהגדלות גדולות יותר, תלוי בניסוי: הערה. סימון המיקום שלכל גיליון תא ו / או נטייה של המנה על הבמה יקל לקחת תמונות לאורך זמן עם הגיליונות בערך באותו הכיוון. - הסר מנות מהחממה ולצלם בנקודות זמן שונות, על פי כל פרוטוקול ניסוי ואת המקום בחזרה לתוך החממה ולו רק תמונות סטילס נדרשות על מסגרת זמן הניסוי.
- בעת ביצוע מיקרוסקופיה וידאו, לשים לב לדברים הבאים:
- מקם את קנה המידה / גיליון התא מתפתח בתוך שדה הראייה כך שגיליון התא הנודד נשאר בשדה הראייה למשך הווידאו.
הערה: זה עשוי לקחת קצת ניסיון בהתבוננות כיצד תאים להעביר מתחת לקנה המידה. לקטעי וידאו קצרים, זה פחות דאגה מאשר לקטעי וידאו ארוכים יותר. - למסגרות זמן קצרות יותר, דגירה על RT. למסגרות זמן ארוכות יותר (18 + שעות), להשתמש בבמה מחוממת או תא דגירה כדי לשמור על טמפרטורה, איזון pH, וכדי למזער את האידוי של התרבות מ 'edium.
- מקם את קנה המידה / גיליון התא מתפתח בתוך שדה הראייה כך שגיליון התא הנודד נשאר בשדה הראייה למשך הווידאו.
4. קיבוע לImmunofluorescence מיקרוסקופית
- הכן מראש חמים כל הפתרונות לC ° 28. על מנת לצפות בkeratocytes תחת הקרינה, לגדול תרבויות explant כפי שתואר לעיל באמצעות כלים תרבית רקמת 35 מ"מ זכוכית תחתונה. לחלופין, להשתמש בשקופיות קאמריות זכוכית.
- להוסיף 0.8 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב1.1x PBS לכל מנה. אל תסיר את התקשורת והתרבות ראשונה. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון.
- להוסיף 0.8 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב1.1x PBS לכל מנה. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון.
- אלא אם כן משתמש בligands החיצוני או epitopes החיצונית, תאי Permeabilize על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של 0.2% Triton X-100 ב 1X PBS. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון.
- הוסף 0.5 מיליליטר BSA של 1% ב1x PBS ו דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C).
הערה: בהתאם לתנאי ניסוי, PHAlloidin ניתן להוסיף בשלב זה. - לאחר דגירה, לשאוב כדי להסיר את הפתרון ולהמשיך במכתים נוגדן. לחלופין, לאחסן את הכלים התרבות על ידי הוספה לפחות 1-2 מיליליטר של BSA 1% ב1x PBS ל3-4 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס.
פרוטוקול 5. Immunofluorescence
- הכן פתרונות נוגדן ראשוניים ומשניים לפי המלצות היצרן.
הערה: אם המלצות יצרן אינן זמינות, דילול טוב התחלה של נוגדנים ראשוניים (בBSA 1% ב 1x PBS) היא 1: 500 לpolyclonal ו1: 1,000 לנוגדנים חד-שבטיים; דילול התחלה טוב לנוגדנים משני הוא 1: 1,000. התאם דילולים של המניה המקורית שהתקבלה מהיצרן גבוה יותר אלה אם האות חלש, נמוך יותר אם האות חזק ורקע הוא בעיה. - לשאוב BSA 1% בפתרון 1x PBS. הוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת נוגדן ראשונית דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C). הסר את פתרון הנוגדן הראשוני, מקום לתוך נקי ושכותרתו 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge, ולהקפיא ב -20 ° C.
הערה: זה מאפשר לשימוש החוזר של הנוגדן הראשוני, במידת צורך. - לשטוף את הצלחת 3 - 5 פעמים עם PBS 1x, הסרת ושלכת PBS לאחר כל שטיפה.
- הוסף 0.5 מיליליטר של פתרון נוגדנים משני. אם תרצה, להוסיף phalloidin fluorescently שכותרת (להלן הריכוז המומלץ של כל יצרן) בשלב זה. דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C).
הערה: שימוש בfluorescently שכותרתו phalloidin מאפשרת הדמיה של סיביים אקטין; מצאנו כי phalloidin 488 שכותרתו עובד הכי טוב בkeratocytes דג הזברה שלנו, אבל יכולה לשמש fluorophores אחרת. - הסר וזורקים את פתרון נוגדנים משני.
- לשטוף את הצלחת 3 - 5 פעמים עם PBS 1x, הסרת ושלכת PBS לאחר כל שטיפה.
הערה: המנה יכולה להיות מאוחסנת, מכוסה מהאור, ב 4 ° C אם אין אפשרות להתחרותw באופן מיידי; ודא 1x PBS מתווסף לתוך הצלחת לפני האחסון על מנת להבטיח את התאים לא יתייבשו אבל חם לRT (20 - 30 דקות), ולאחר מכן להסיר PBS רק לפני שתמשיך לשלב הבא. - כאשר מוכן להתבונן, להוסיף 2-3 טיפות של הרכבה בינונית, עם או בלי DAPI, בהתאם לצרכים הניסיוניים, לתוך הצלחת ולתת לשבת במשך 10 דקות ב RT.
הערה: אנו משתמשים במדיום זמין מסחרי, המבוסס על גליצרול הרכבה עם DAPI, אך ניתן להשתמש בי תקשורת הרכבה אחרת. המאפשר 10 דקות להרכבה בינונית לשבת בצלחת מאפשר הסרה קלה של coverslip הזכוכית מתחתית הצלחת. - לאחר דגירה, ללחוץ בעדינות על צידי הצלחת כדי לשחרר ולהסיר את coverslip. להוסיף טיפה נוספת של תקשורת הרכבה על גבי זכוכית ולמקם את coverslip, תאים למטה, לשקופית.
הערה: שקול איטום coverslip לשקופית באמצעות ציפורניים ברורות אם השקופית צריכה להיות כל הזמן ליותר מ1-2 ימים. - שים לב לשקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערה: רוב התמונות שלנו נלקחו באמצעות עדשה אובייקטיבית 40X או 63X תחת טבילת שמן, אבל העדשה האובייקטיבית הספציפית המשמשת יהיו תלויה בפרוטוקול הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שמודגם באיור 1, גיליונות של keratocytes ניתן לצפות נודדים החוצה מתחת לקנה המידה בתוך שעות של הקמת תרבות explant. מדי פעם, יכול להיות שנצפה keratocyte בנפרד נודדת שהתנתק מהגיליון הנודד באופן קולקטיבי. בנוסף, כexplant הוקם מדגים שנתלשו בעבר, יש בשפע נויטרופילים הנודדים דרך גיליון. בתקופות ארוכות יותר תרבות, הברים וכו 'keratocyte כתאים עוברים EMT 14.
שיעוריו הראשוניים של קידום גיליון הוא מהירים מאוד אך שיעור זה מאט במהירות כמו תאים להתפשט (נמדד לפי אזור ומרחק internuclear המגדילים ~ 1.8 ~ 3.1 ולקפל בהתאמה) במהלך 48 שעות הראשונות של התרבות (איור 2 א-ג). הגידול המהיר אינו קשור לשגשוג תאים; לאחר התיוג למשך 24 שעות עם deoxyuridine ethynyl האנלוגי thymidine הניאון (Edu), ~ 10% של תאים להראות ראיות של חלוקת תא, שיעור נמוך בהרבה מראה בשורות תאים הפכו אך עקבי יותר עם התאים המעורבים בreepithelization בתרבויות organotypic אנושיות 30. בתקופות מאוחרות יותר, שברי וכו '(תופעה הקשורים לEMT נצפה במערכת זו 14) שהופך את התקדמות הקצה המוביל קשה למדידה.
האזור המכוסה על ידי גיליונות לאחר 24 שעות, יכול לשמש כמסך מהיר ליכולת של תרכובות לשנות תא קולקטיבי הגירה 15,31. כאשר טיפול נוסף בזמן explants הוקם, מנה-תגובה בשטח גיליון ניתן לראות. כמה ציטוקינים יונקים (למשל, TGF-1 15), כמוקינים (כגון CXCL12) ומעכבי מולקולה קטנים המתאפיינים במקור במערכות יונקים (למשל, MMP-2, -9, ו-13 מעכבים 31) כבר מועסקים בהצלחה. עם זאת, באזורי גיליון 24 שעות באינם מתפלגים נורמלי (
במקרים רבים, השפעות של טיפול (ים) על הגירה קולקטיבית הם נצפו בתקופות זמן קצרות יותר. במקרים אלה, מיקרוסקופיה וידאו יכולה לשמש לassay תגובה של גיליון הנודד באופן קולקטיבי לטיפול. כאשר פפטיד המכיל RGD המסיס מתווסף לתרבות בינונית (שלישי פנל באיור 4) לשבשהיווצרות dhesion, lamellae בחוד החנית של גיליון במהירות להתכווץ, ולאחר מכן את הקצה המוביל של מתנתק גיליון וחזר בי. היות וכל גיליון חוזר בפחות מ -2 דקות, תגובה של גיליון לטיפול יכולה להיות מהירה.
כדי להעריך לוקליזציה של חלבונים בתוך הסדין או בתוך תאי מנהיג וחסיד, את כל גיליון יכול להיות קבוע ומוכתם, כפי שמוצג באיור 5. יש להקפיד במהלך תהליך הקיבוע כגיליונות תא הם שיבשו בקלות. בידיים שלנו, רבים נוגדני polyclonal לתחומים הפונקציונליים של חלבונים יונקים (במיוחד של חלבוני cytosolic) כבר נמצאו לחצות להגיב בexplants דג הזברה שלנו.
איור 1. הגירה קולקטיבית של גיליונות תא. לאחר הקמתה בתרבות explant, keratocytes להגרמ- מתחת לקנה המידה כיחידה קיבוצית. () ממחיש את הכמות היחסית של תאים שהגרו מהסולם רק לאחר שעה 2 בתרבות, ב( BE) נלקח כל שעה לאחר מכן (3 - 6 שעות, בהתאמה). כל התמונות צולמו בהגדלה 100X. כל הרצף מוצג בוידאו 1; מסגרת אחת נלקחה כל 30 שניות על פני תקופת הזמן 6 שעות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מאפיינים של הגירה קולקטיבית. שיעור ראשוני של מראש של הקצה המוביל, הנמדד במספר נקודות, הוא מהיר אבל מאט בשעה הראשונה 24 בתרבות (א). מדידה של מרחק internuclear ואזור תא באמצעות גultures קבוע ב 4 ו -24 שעות ומוכתמות עם DAPI וphalloidin כהתייחסות עולה כי באותה תקופה, שני מרחק internuclear (נמדד מהמרכז של כל גרעין) ועליות אזור התא (נמדד כאזור מוקף אקטין קליפת המוח שלד תא, (ב) ו- (ג) בהתאמה). כל גרף מייצג את הממוצע (± SEM) של שלושה ניסויים בלתי תלויים בשלושה עותקים. נתון זה שונה מאל Rapanan et. 7 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Assay של הגירה קולקטיבית באמצעות פינת גיליון תא. כאשר נוספו מדיום התרבות במהלך הקמת התרבות, peptZ-PLG-NHOH IDE (קשת רחבה MMP) והמולקולה קטנה SB-3CT (MMP2 & 9 ספציפיים) מעכבים לצמצם את אזור גיליון תא לאחר 24 שעות בתרבות (א). מכיוון שהאזור של גיליונות תא שלא טופלו מופץ באופן אקספוננציאלי (B), יש להתוות נתונים כחציונים עם שגיאה סטנדרטית של החציון נקבע כמתואר בטקסט ומצוין בכחול (גבול עליון או התייחסות כתובת אתר וגבול תחתון או התייחסות LRL; ( ג)). ההבדל בין החציון ואת כתובת האתר וLRL לקבוע את הגודל של הברים השגיאה בגרף (המוצל בירוק בהיר). נתון זה שונה מאל מקדונלד et. 31 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תוספת של מסיס RGD פפטיד מובילה לביטול תביעת גיליון. במהלך טיפול מקדים ולאחר תוספת של פפטיד rge המכיל, גיליון התא ממשיך להתקדם. 15 שניות לאחר תוספת של פפטיד המכיל RGD, יש ירידה בlamellae בקצה המוביל (הוספה). לאחר 30 שניות נוספות, וכו 'מתחיל לחזור, הכחשה שממשיכה במהלך משך וידאו (סה"כ אורך וידאו ~ 5 דקות, תראה את וידאו 2). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. Immunofluorescence Assay. תאים הוכתמו נוגדן לתחום הקטליטית של MMP14a (אדום) וcounterstained עם phalloidin fluorescently שכותרתו (488) (ירוקים) ו / או DAPI(כחול). (א) ו- (ב) מייצגים גיליון 4 שעות אופייניות המתעוררים מההיקף הזמן (C) ו- (ד) להראות חלק מגיליון 24 שעות טיפוסיות. כל התמונות צולמו בהגדלה 400X. שים לב כי עוצמת מכתים MMP14a גבוהה בחוד החנית של גיליונות התא מתעוררים (ראה ב( B) ו- (ד)) וlamellipodia הבולט נראים בתאי המנהיג () ו- (ג)). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב הקריטי ביותר להצלחה של תרבות explant keratocyte מאפשר קנה המידה לדבוק בתרבות הצלחת כ 2-3 דקות לפני תוספת של מדיום התרבות. כ -75% מקשקשים ידבק ולגדול גיליונות (מספר התרבויות שנקבעו לגבי כל ניסוי צריך להיות מותאם בהתאם). גיליונות Keratocyte לא יוצרים סביב כל קנה מידה הוסרה מהדגים והניחו בתרבות מכמה סיבות. ראשית, מכתים DAPI של explants מגלה כי כמה קשקשים יש כמה תאים מחוברים ובכך צפוי שהקשקשים אלה לא יהיו לי גיליונות של keratocytes. שנית, היכולת של explants לדבוק בצלחת תרבית הרקמה היא תנאי הכרחי להגירת גיליון. הקובע עיקרי של האם קשקשים לדבוק ותרבות explant מוצלחת הוקמה הוא הזמן שבין הצבת קנה המידה על פני השטח הצמיחה והתוספת של תקשורת. זמן מספיק כדי לדבוק ללא תקשורת יוביל לקשקשים צפיםg בתקשורת (לפעמים עם רקמה גלויה מצורף) תוך תקופה ארוכה מדי תגרום לקשקשים חסיד ללא צמיחה (ככל הנראה בשל התייבשות של explant עם שרידי תא גלויים בקצה המכירה). הזמן בין מיקום בקנה מידה בצלחת והתוספת של מדיום גידול ייתכן שיהיה הצורך לקבוע באופן ניסיוני, כגורמים כגון טמפרטורה ולחות בתוך חדר המעבדה עשוי להשפיע כמה מהר תאים יכול לדבוק בצלחת בלי התייבשות.
למרות שמספר נוגדנים זמינים מסחרי, דג הזברה ספציפיים גובר, המגוון של חומרים כימיים זמינים יכול להיות מגביל. הומולוגיה של 85% בין immunogen וחלבון המטרה היא הכרחית בדרך כלל לתגובה צולבת. עם זאת, כמו תחומים פונקציונליים כגון אתרים פעילים, אתרי אינטראקציה בין חלבונים, ואתרים של שינוי הם יותר משומרים יותר מאזורים אחרים של החלבון, נוגדני polyclonal אנטי-peptide מופנים לאזורים אלה יכולים לעתים קרובות להיותמשמש גם אם ההומולוגיה כוללת היא נמוכה. לדוגמא, אם כי MMP14a דג הזברה יש זהות 68% כוללות עם ortholog האנושי שלה (מצפה ערך = 0), את החלק היחסי של עליות זהות עד 79 - 96% באתרי קטליטי וחלבון קושרים בעוד אתרים לחתוך באופן דומה נשמרים 31 מאוד. הנתונים מצביעים על כך שנוגדן מכוון לאתר catalytically הפעיל של MMP14a האנושי חוצה מגיב עם דג הזברה keratocytes תרבויות. ההצעה שמכתימה בגיליונות דג הזברה יכול למקם את התאים נמתחו בחוד החנית 31 עולה בקנה אחד עם נתונים אחרים מצביעים על כך שMMP14 עשויה לשמש כחיישן מכאני 32.
לא ניתן ליצור explant סטרילי לגמרי מברכות דגים במי אקווריום לא סטרילי. כפי שרוב הניסויים שלנו הושלמו תוך 24 שעות, אנו חווים אין בעיות עם זיהום חיידקים או פטרייתי של explants. עם זאת, כאשר תקופות דגירה ארוכות יותר הן רצויה, o עקרות שמירהexplants f עלול להיות בעיה. בעת תכנון ניסוי מעורב 3 או יותר ימי דגירה, כמה אמצעי זהירות ננקטים כדי להגדיל את הסיכוי שהתרבויות יישארו מזוהמת. ראשית, כדי להפחית את עומס החיידקים, הדגים מותר לשחות במשך כשעה 1 ב 3 שינויים של טרי, dechlorinated מים ברז עם או בלי התוספת של 100 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin. שנית, התקשורת החליפה על בסיס יומי כדי לשמור על רמות נאותות של אנטיביוטיקה ולצמצם את מספר כל חיידקים הנוכחיים. לincubations הארוך במיוחד (> 5 ימים) שלושה שוטף עם 1x PBS מבוצע עם כל חילופי תקשורת. עם זאת, זה הכניס משתנה שיש לקחת בחשבון בתכנון הניסוי, כאשר מטופל תרבות explant עם מתחם אקסוגניים כמו זה צריך להיות מוחלף עם התקשורת. בנוסף, ציטוקינים וגורמי גדילה מופרשים על ידי explant יוסרו עם כל חילופי תקשורת. עם זאת, ככל שמספר התאים הוא נמוך ונפח התקשורתהוא גדול בexplant keratocyte טיפוסי, השפעה זו לא יכולה להיות משמעותית.
כקשקשי דגים דורשים 3 שבועות להתחדש 33 במלואו, אנו ממליצים לאפשר לדגים להתאושש במשך תקופה זו של שימוש חוזר ונשנה לפני הזמן של הדגים בניסויים. למרות הרפורמה בשכבת האפיתל מתרחשת במהירות רבה יותר, אנו מניחים שמחכים אורך זה זמן שבין השימוש באותו הדג ממזער את הסיכוי לתופעות דלקתיות מערכתיות שדווחו בריפוי פצע עורית בדגים 34.
Explants כבר מזמן משמש ללמוד את ההתנהגות של תאי אפיתל. יש לי Explants מרחב-מגוון מיני דגים ודו-חי מאפייני ניעתי דומים ברמות נדידת תאים האישיות וקולקטיביות 3-6,35-37. התאים הללו יש תכונות ניע שונות במובהק מexplants יונקים אבל המבנה והארגון הכוללים נראים לי מידה רבה של דמיון 8,30,38 14.
מצאנו כי פרוטוקול זה מאפשר לנו ללמוד את ההגירה הקולקטיבית של keratocytes דג הזברה באמצעות explants תא ראשוני שמודל השלבים המוקדמים של ריפוי פצע 14. ניסויי ביצוע באמצעות תרבויות עיקריות שהוקמו ימנע בעיות הקשורות למעבר סדרתי של תאים ראשוניים או שימוש בשורות תאים הפכו. Explants ניתן להשתמש כדי ללמוד את התפקיד של EMT בריפוי פצע עורית כEMT לפעולה כאשר תרבויות מבוססות. המחקרים שלנו מראים כי explants הראשוני אלה בצורה מדויקת יותר לחקות את ההתנהגות והגירה הטבעית של keratocytes בתוך שכבת האפיתל נפצעה in vivo. פרוטוקול זה מספק את הבסיס להקמת תרבויות עיקריות לשימוש במבחני הגירה וכן לבחינת שינויים בגן ו / או ביטוי חלבון במערך אינסופי של קונדיט הניסיונייונים. הנהלים הם מהירים, קלים, זולים, לשחזור, ומתאימים לשימוש בכל מוסד מחקר.
לסיכום, טכניקת explant זה מספקת assay מהיר לנדידת תאים קולקטיבית בהקשר של מודל ריפוי פצע שעובר EMT. הנוכחות של כמה סוגי תאים בשכבות מרובות עם קנה מידה מכוונת מספקת מורכבות לvivo לשעבר מערכת זו התרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמערב התיכונה אוניברסיטת קולג 'למדעי בריאות מחקר הנחיית גרנט זכה לEEH ומשרד אוניברסיטת המערב התיכון של מחקר ותוכניות ממומנים ביצוע העצמי גרנט זכה לKJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
References
- Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
- Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
- Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
- Kolega, J. The Movement of Cell Clusters. J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).
- Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
- Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
- Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
- Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
- Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
- Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
- Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
- McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
- Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
- Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).
- Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
- Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
- Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
- Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
- McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
- Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
- Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
- Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
- Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
- Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).
