Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Sebrafisk Keratocyte eksplantater å studere Collective Cell Migrasjon og reepithelialization i Kutan Wound Healing

Published: February 25, 2015 doi: 10.3791/52489
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 1
1Biomedical Sciences Program, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Midwestern University

Summary

Sebrafisk keratocytter migrere i celle ark fra eksplantater og gi en in vitro modell for studiet av mekanismene for kollektiv cellemigrasjon i sammenheng med epitel sårtilheling. Disse protokoller detalj en effektiv måte å etablere primære eksplantering kulturer for anvendelse i kollektive cellemigrerings analyser.

Abstract

På grunn av deres unike bevegelige egenskaper, fiske keratocytter skilt fra eksplantering kulturer har lenge vært brukt til å studere mekanismene for enkelt celle migrasjon. Men når eksplantater er etablert, disse cellene også flytte kollektivt, opprettholde mange av funksjonene som gjør enkelte keratocytter en attraktiv modell for å studere migrasjon: raske priser av bevegelighet, omfattende aktin-rik lameller med en vinkelrett aktin kabel, og relativt konstant hastighet og retning av migrasjon. I tidlige eksplantater, den raske interconversion av celler migrerer individuelt med de migrerer kollektivt gjør studiet av rollen som celle-celle adhesjon i å bestemme modus for migrasjon, og understreker de molekylære forbindelser mellom de to modusene ved migrasjon. Celler i senere explants mister sin evne til å migrere raskt og kollektivt som en epitelial til mesenchymale overgang oppstår og gener assosiert med sårtilheling og betennelse er forskjellig uttrykt. Således kan keratocyte eksplantater tjene som en in vitro modell for reepithelialization som oppstår under kutan sårheling og kan representere et unikt system for å studere mekanismene for kollektiv cellemigrering i sammenheng med et definert program av genekspresjon endringer. Et utvalg av mutante og transgene sebrafisk linjer er tilgjengelige, noe som gjør at eksplantater skal etableres fra fisk med forskjellig genetisk bakgrunn. Dette gjør det mulig rolle forskjellige proteiner i disse prosessene kan bli entydig adressert. De protokoller som er beskrevet her beskriver en enkel og effektiv metode for å etablere disse eksplantering kulturer for anvendelse i en rekke analyser knyttet til kollektiv cellemigrering.

Introduction

Studier av cellemotilitet har tradisjonelt fokusert på individuelt trekkende celler. Keratocytter dyrkede fra fisk og amfibier eksplantater har vist seg å være en kraftig modellsystem for å studere mekanismene til celle motilitet ved anvendelse av både eksperimentelt og matematisk modellering nærmer seg 1-6. Eksperimentelt arbeid med individuelt migrerende celler blir hjulpet av den raske, glatt glidebevegelse av cellene, og samtidig opprettholde en ensartet form, hastighet og retning. Imidlertid in vivo, celler ofte bevege seg sammen under opprettholdelse av celle-celle kryss, spesielt under embryogenese, sårheling, og metastase. Således er kollektivt cellemigrering en voksende og stadig mer fremtredende område for forskning innen cellemigrering. Den kollektive migrasjon av disse cellene har nylig blitt beskrevet 7 og det har mange unike funksjoner som gjør det til et kraftig system for å studere kollektiv celle migrasjon i en sårtilheling modell.

ove_content "> Når skalaer er plukket fra en bedøvet voksne sebrafisk, forblir en viss epitelvev er festet til undersiden av skalaen. Når cellekulturmedium ble tilsatt, disse epitelceller, eller keratocytter, migrerer hurtig som en samlet enhet fra skalaen. Den explant kultur kan bli sett på som en epitelial sårheling modellen, der cellene migrerer bort fra eksplantatet som de ville over provisoriske matriks av en sårflaten å reetablere et intakt epitel. Nyere data tyder på at denne ex vivo dyrkningsetterligner mange funksjoner i in vivo sårtilheling i voksen sebrafisk. lukking av sår priser åtte oversette til en migrasjon hastighet lik den som ble observert i ex vivo system 7. I tillegg, i en in vivo sårheling modell, behandling med warfarin tyder på at hemostase har ingen effekt på hastighet av healing, betyr samtidig behandling med hydrokortison for å redusere immunrespons ikke forsinke reepithelialization 8

Protokollen presenteres her beskriver hvordan å etablere sebrafisk keratocyte eksplantering kulturer som sikrer konsistens og reproduserbarhet for bruk i mange biologiske analyser. Disse eksplantering kulturer er en spesielt overbevisende in vitro modell for kollektiv cellemigrering av flere grunner. Først, sebrafisk keratocytter er primære celler brukes innen timer etablere eksplantering kulturer. Derfor har disse cellene ikke gjennomgått de morfologiske og genekspresjon endringer knyttet til passering av primære celler 9-13. Sekund, representerer dette systemet en modell for studiet av reepithelialization i respons til såret 14, og, som en del av responsen til såret, en epitelial til mesenchymale transition (EMT) er igangsatt prosess som gjenspeiles av endringer i genuttrykk og cytoskeletal rearrangements 14,15. Således har bakgrunns endringer i genekspresjon og motilitet som forekommer i ubehandlede celler blitt karakterisert, og tilveiebringe en forbindelse til å tolke endringer med behandling. Videre fisken keratocyte og den menneskelige keratinocyte er funksjonelt tilsvarende; begge er de primære epitelceller for sine respektive arter og spille en nøkkelrolle i epitel sårtilheling. Tredje, voksen sebrafisk er å få anerkjennelse som et modellsystem for en rekke menneskelige sykdommer 16-18 inkludert melanom og andre kreftformer 19-21, kutan sårheling 8,14 og vev gjenfødelse 22-24.

Tekniske fordelene ved dette modellsystemet er like overbevisende. Et økende antall mutante og transgene linjer er tilgjengelige fra non-profit, sentraliserte anlegg. Spesifikt, Sebrafisk Mutation Project (ZMP) Ved Wellcome Trust Sanger Institute har som mål å skape en knockout allel i hver proteinkodende gen i sebrafisk genom. For tiden har de muterte gener 11892, omtrent 45% av genomet, med 24088-alleler karakterisert. I tillegg aksepterer ZMP forslag og vil generere knock-outs gratis. Nye metoder i genet knockdown i larve og voksen sebrafisk 25-28 gir fleksibilitet til å studere funksjonen til utviklingshemmede viktige gener som transgene tilnærminger er problematisk eller upraktisk.

På grunn av sine ekstremt raske utbredelsen av bevegelighet av ~ 145 mikrometer / t kort tid etter etablering av kulturer 29, kan analyser være ferdig raskt (vanligvis i 24 timer eller mindre). Som forsøk kan gjennomføres hurtig og kulturer vokser godt ved RT, flere av de tekniske hindringer i forbindelse med pattedyrcelle migrering analyser som involverer videomikros unngås. I tillegg, i en alder av stramme forskningsbudsjetter, zebrafish er enkelt og billig vedlikeholdes.

Strukturen og virkemåten av eksplantatet er kompleks. Ettersom fisken ikke blør når skalaen er fjernet, er det usannsynlig at mer enn den overfladiske epidermale lag fjernes med skalaen. Keratocytter synes å være den dominerende celletype i eksplantatet når skalaer blir først fjernet fra fisken som de aller fleste av cellene synes å farge med et anti-E-cadherin antistoff 14. Videre er det ingen bevis for fibroblaster i den opprinnelige kulturen som bedømmes av fravær av vimentin farging av immunfluorescens 14. Men med gjentatt skala fjerning, synes det å være mange nøytrofile i eksplantatet (se video 1). Vi har identifisert disse cellene som neutrofiler basert på morfologiske observasjoner av deres størrelse, hurtig motilitet, og deres migrering ut av cellen arket når de utsettes for LPS (data ikke vist). I tillegg er disse cellene flekken brightly viddh et antistoff til nøytrofile cytosoliske faktor, samt med en rekke sekundære IgG-antistoffer, noe som indikerer at de har rikelig FCR på sin overflate (data ikke vist). Flere cellelag er til stede i eksplantatet. Konfokal mikroskopi avslører tilstedeværelse av et enkelt lag i nærheten av den fremre kanten til mer enn to lag av keratocytter nærheten av skalaen med nøytrofiler synlige over, under og mellom de celle keratocyte ark.

Ved tidlige tidspunkter, celler på kanten av det flerlags explant polarisere, initiere kollektiv migrering av keratocytter fra eksplantatet ved innledende forekomst av ~ 145 um / time. Området som dekkes av eksplantatet øker raskt, noe som fører til celle spredning, spenningen i arket, og en redusert hastighet på forhånd av den fremre kant. Rapid omdannelser mellom leder- og følgecellene er observert ved den ledende kant under dannelsen og lukking av spontant dannede hull i arket 7. EttersomEMT prosessen startet med eksplantatet fortsetter, plate fragmenter og keratocytter mister sin spesialiserte, rask motilitet. Genekspresjon og morfologiske endringer i samsvar med EMT, sårheling, og inflammatoriske responser skje innen 7 dager etter kultur med eksplantater vurderes levedyktig i ca 10 dager 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen er i samsvar med AVMA Dyrevelferd Prinsipper for omsorg og bruk av forsøksdyr, og har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Midwestern University.

1. Utarbeidelse av anestesi, Utstyr, & Media

  1. Deklorere ca 1,5 liter vann fra springen ved hjelp av enten en kommersiell dechlorinating middel (tilgjengelig på dyrebutikker) eller ved å la vann stå i 24 timer. Få tre en L kanner og fylle hver med 500 ml deklorerte vann. Merke en for å holde fisk før prosedyren og ett for utvinning. Til den tredje beger, tilsett 100 mikrogram / ml Tricaine methanesulfonate; Dette blir begeret hvor fisken skal bedøves.
  2. Fylle et grunt brett med is, oppvarmes kulturmediet (RPMI 1640, 10% FBS (føtalt bovint serum), 50 ug / ml gentamycin, 100 ug / ml kanamycin, 25 mM HEPES) til RT, og samles rent gullsmed pinsett. Rene pinsett etter immersynge tipsene i 70% etanol og passerer gjennom en Bunsen-brenner, slik at etanol å brenne av.
  3. Bestem om prosedyren vil bli utført uten forstørrelse, med en kommersiell, table-top opplyst forstørrelsesglass med 2 - 10X forstørrelse, eller dissekere mikroskop (helt avhengig av personlig preferanse).

2. Etablere Eksplantering kulturer

  1. Fange ønsket antall fisk og sted i et holdingselskap beger. Overføre en enkelt fisk til anestesi beger; Det er best å bedøve fisk enkeltvis.
  2. Overvåke effekten av anestesi ved å observere bading og gjelle bevegelse av fisken. Som anestesi utvikler seg, bremser gjellebevegelse og fisken svømmer uberegnelig og ofte opp ned; vurdere fisken bedøves så snart gill bevegelse opphører. Ikke la fisken for lengre perioder i anestesi bath, da dette kan føre til døden av fisken.
  3. Fjerne fisk fra anestesi beger og overføringtil is, plassere fisken horisontalt med halen mot hånden som holder pinsett. Hvis erfart med teknikken, og hvis flere fisk skal brukes til å lage eksplantater vurdere å plassere den neste fisk i anestesi begerglass på dette tidspunktet.
  4. Å fjerne skjell, posisjons pinsett parallelt med fisk med tips på kanten av skalaen. Trå flate siden av pinsetten litt inn i siden av fisken for å bevirke at skalaen for å heve fra fiskekroppen. Ta tak skala med pinsett, da riv og sted (uten inversjon) i vevskulturskål. Gjenta prosedyren, fjerne maksimalt 12 skalaer fra en stor voksen (6 fra hver side), unngå gjelle regionen, sidelinjen, og svømmeføtter.
  5. Legg fisken på oppsamlingsbeger og overvåke for å sikre den gjenoppretter fra virkningene av anestesi. På dette tidspunktet, kan fisken bli overført tilbake til en enkeltperson tank. La fisken komme i minst 21 dager for å tillate komplett skala regenerering.
  6. Avhengigeksperimentell design, plassere opptil 20 skalaer per plast 35 mm vev kultur behandlet tallerken eller 4 - 6 skalaer per glassbunn parabolen. Tillate skalaer å følge fatet før du legger papir forsiktig for ikke å løsne skalaer fra fatet.
    MERK: Med erfaring, kan flere fisk bli behandlet før media er lagt til den første retten.
  7. Legg 1,2 ml komplett media (se 1.2) inn i hver 35 mm parabolen.
  8. Fortrinnsvis inkuberes eksplantering kulturer ved 28 ° C i 5% CO2 i det ønskede tidsrom, med eller uten ytterligere behandling. Alternativt inkuber kulturer på en oppvarmet mikroskop scenen eller i et levende cellekultur kammer for videomikroskopi.

3. Lysfelt og Video Mikros

  1. Posisjons retter som inneholder celle ark på mikroskop scenen og i utgangspunktet fokus med 4X objektiv.
    MERK: Høyere forstørrelse kan anvendes, avhengig av forsøket. Markerer plasseringen avhver celle ark og / eller orientering av fatet på scenen vil lette å ta bilder over tid med ark i omtrent samme retning.
  2. Fjern retter fra inkubatoren og fotografiet ved forskjellige tidspunkter, i henhold til hver forsøksprotokoll og plassere tilbake i inkubatoren hvis bare stillbilder er nødvendig i løpet av den eksperimentelle tidsramme.
  3. Mens du utfører videomikroskopi, ta hensyn til følgende:
    1. Plasser skala / voksende cellefolie innenfor synsfeltet, slik at migrering av cellearket forblir i synsfeltet for varigheten av videoen.
      MERK: Det kan ta litt erfaring i å observere hvordan cellene migrerer fra under skalaen. For korte videoer, er dette mindre av en bekymring enn for lengre videoer.
    2. For kortere tidsrammer, inkuber ved RT. For lengre tidsrammer (18+ t), bruker en oppvarmet scene eller en inkubasjon kammer for å opprettholde temperatur, pH balanse, og for å minimere fordampning av kulturen medium.

4. Fiksering for Immunfluorescens Mikros

  1. Forberede og pre-varme alle løsningene til 28 ° C. For å se keratocytter henhold fluorescens, vokse eksplantering kulturer som beskrevet ovenfor ved hjelp av glassbunn 35 mm vevskulturskåler. Alternativt kan du bruke glass kammer lysbilder.
  2. Legg 0,8 ml av 4% paraformaldehyde i 1,1x PBS til hver rett. Ikke fjern kultur media først. Inkuber ved RT i 5 min og deretter suge for å fjerne oppløsningen.
  3. Legg 0,8 ml av 4% paraformaldehyde i 1,1x PBS til hver rett. Inkuber ved RT i 5 min og deretter suge for å fjerne oppløsningen.
  4. Med mindre bruk av eksterne ligander eller eksterne epitoper, permeabilisere cellene ved tilsetning av 0,5 ml 0,2% Triton X-100 i 1 x PBS. Inkuber ved RT i 5 min og deretter suge for å fjerne oppløsningen.
  5. Tilsett 0,5 ml av 1% BSA i 1 x PBS og inkuberes i 1 time (ved RT) eller O / N (ved 4 ° C).
    MERK: Avhengig av eksperimentelle forhold, phalloidin kan legges på dette trinnet.
  6. Etter inkubering aspireres å fjerne oppløsningen og fortsette med antistoff-farging. Alternativt kan lagre kulturskåler ved å tilsette i det minste 1 - 2 ml av 1% BSA i 1 x PBS i 3-4 uker ved 4 ° C.

5. Immunfluorescens Protocol

  1. Forberede primære og sekundære antistoff løsninger i henhold til produsentens anbefalinger.
    MERK: Hvis produsentens anbefalinger ikke er tilgjengelig, er en god start fortynning av primære antistoffer (i 1% BSA i 1x PBS) 1: 500 for polyklonale og 1: 1000 for monoklonale antistoffer; en god start fortynning for sekundære antistoffer er 1: 1000. Justere disse fortynninger av det opprinnelige lager innhentet fra produsenten høyere hvis signalet er svakt, lavere hvis signalet er sterk og bakgrunnen er et problem.
  2. Aspirer 1% BSA i 1 x PBS-oppløsning. Tilsett 0,5 ml av primært antistoff-løsning og inkuberes i 1 time (ved RT) eller O / N (ved 4 ° C). Fjern det primære antistoff-oppløsning, plasseres i en ren og merket 1,5 ml mikrosentrifuge-rør, og fryses ved -20 ° C.
    MERK: Dette muliggjør gjenbruk av det primære antistoff, om nødvendig.
  3. Vask fatet 3-5 ganger med 1x PBS, fjerne og kaste PBS etter hver vask.
  4. Tilsett 0,5 ml av sekundært antistoff oppløsning. Hvis ønskelig, legge fluoresceinmerkede phalloidin (etter enhver produsentens anbefalte konsentrasjon) i dette trinnet. Inkuber i 1 time (ved RT) eller O / N (ved 4 ° C).
    MERK: Bruk av fluoresceinmerkede phalloidin tillater visualisering av aktin filamenter; Vi har funnet at 488-merkede phalloidin fungerer best i våre sebrafisk keratocytter, men andre fluoroforene kan benyttes.
  5. Fjern og kast sekundært antistoff løsning.
  6. Vask fatet 3-5 ganger med 1x PBS, fjerne og kaste PBS etter hver vask.
    MERK: Retten kan lagres, dekket mot lys, ved 4 ° C hvis ikke kan view umiddelbart; sørg 1x PBS legges i formen før lagring for å sikre at cellene ikke tørke ut, men varm til RT (20 - 30 min), deretter fjerne PBS like før du går videre til neste trinn.
  7. Når det er klart for å observere, tilsett 2-3 dråper av en monteringsmedium, med eller uten DAPI, avhengig av de eksperimentelle behov, i formen, og la det stå i 10 minutter ved RT.
    MERK: Vi bruker et kommersielt tilgjengelig, glyserol-baserte montering medium med DAPI, men andre monterings medier kan brukes. Slik at 10 min for montering medium til å sitte i fatet forenkler enkel fjerning av glass dekkglass fra bunnen av fatet.
  8. Etter inkubasjon forsiktig klem på sidene av parabolen å løsne og fjerne dekkglass. Legg til en ekstra dråpe monterings media på et glass lysbilde og plassere dekkglass, celler ned, inn på lysbildet.
    MERK: Vurdere tetting dekkglass til raset ved hjelp klar neglelakk hvis raset må holdes i mer enn 1 - 2 dager.
  9. Observere skyve under en fluorescens mikroskop.
    MERK: De fleste av våre bilder ble tatt ved hjelp av et 40X eller 63X objektiv henhold olje i vann, men den spesifikke objektivlinse benyttes vil avhenge av den eksperimentelle protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som illustrert i figur 1, kan observeres migrerer ut fra under omfanget i løpet av timer for å etablere et utenforliggende kultur ark av keratocytter. Noen ganger kan en individuelt migrere keratocyte som har brutt ut av den kollektivt migrere ark holdes. I tillegg, som eksplantatet ble etablert fra en fisk som tidligere var blitt revet av, er det rikelig nøytrofiler som migrerer gjennom arket. På lengre kultur perioder, de keratocyte ark fragmenter som celler gjennomgå EMT 14.

Den første rate på arket avansement er ekstremt rask, men denne prisen bremser raskt som celler spredt (målt etter område og inter avstand som øker ~ 1,8 og ~ 3,1 ganger henholdsvis) i løpet av første 48 timer av kultur (Figur 2A-C). Den raske økningen er ikke forbundet med celleproliferasjon; etter merking for 24 timer med fluorescerende tymidinanalog etynyl deoksyuridin (Edu), ~ 10% av cellene vise bevis for celledeling, en hastighet langt lavere enn vi har sett i transformerte cellelinjer, men mer i samsvar med de cellene som er involvert i reepithelization i menneskelige organotypiske kulturer 30. I senere tider, til arket fragmenter (et fenomen som er knyttet til EMT observert i dette systemet 14) som gjør det forut for den fremre kant er vanskelig å måle.

Området som dekkes av plater etter 24 timer, kan anvendes som en rask skjerm for evnen av forbindelser til å endre kollektiv cellemigrering 15,31. Når behandlingen tilsettes ved tidspunktet eksplantater er etablert, kan en dose-respons i plateområdet sees. Noen mammalske cytokiner (for eksempel TGF-en 15), kjemokiner (f.eks CXCL12) og lavmolekylære inhibitorer opprinnelig karakterisert pattedyrsystemer (f.eks, MMP-2, -9, -13 og 31 inhibitorer) har vært anvendt med hell. Men som plateområder på 24 timer ikke er normalfordelt ( Figur 3C).

I mange tilfeller er effekten av behandlingen (e) på kollektiv migrasjon observert i kortere tidsperioder. I disse tilfeller kan videomikroskopi brukes for å analysere responsen til kollektivt å migrere ark til behandling. Når oppløselig RGD inneholdende peptidet blir tilsatt til kulturmediet (tredje panelet i figur 4) for å avbryte endhesion formasjon, lamellene i forkant av arket raskt krympe og senere den ledende kanten av arket løsner og trekker seg tilbake. Ettersom hele arket trekkes på mindre enn 2 min, kan responsen av arket til behandlingen være rask.

For å vurdere lokalisering av proteiner i arket eller i leder- og følgecellene, kan hele arket bli fiksert og farget, slik som vist i figur 5. Det må utvises forsiktighet under fikseringsprosessen som celleplater er lett forstyrres. I våre hender, har mange polyklonale antistoffer mot de funksjonelle domener av pattedyr proteiner (spesielt av cytosoliske proteiner) er funnet å kryssreagerer i våre sebrafisk eksplantater.

Figur 1
Figur 1. Collective migrasjon av celle ark. Etter etableringen i explant kultur, keratocytter migrereut fra undersiden av skalaen som en kollektiv enhet. (A) illustrerer den relative mengde av celler som har migrert fra vekten etter bare 2 timer i kultur, med (BE) tatt hver time deretter (3 - 6 timer, henholdsvis). Alle bildene ble tatt ved 100X forstørrelse. Hele sekvensen er vist i video 1; ett bilde ble tatt hver 30 sek over seks timers periode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Kjennetegn på Collective Migration. Initial rate på forhånd forkant, målt på flere punkter, er rask, men bremser ned i løpet av de første 24 timer i kultur (A). Måling av inter avstand og celle området ved hjelp av cultures fiksert ved 4 og 24 timer, og farvet med DAPI og phalloidin som referanse indikerer at i løpet av samme tidsperiode, både inter avstand (målt fra midten av hver kjerne) og øker celleområde (målt som areal omsluttet av det kortikale aktin cytoskjelettet, (B) og (C) henholdsvis). Hver graf representerer gjennomsnittet (± SEM) fra tre uavhengige eksperimenter i triplikat. Dette tallet har blitt forandret fra Rapanan et al. 7 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Analyse av Collective Migration bruker Cell Sheet området. Da lagt til kulturmediet under etablering av kulturen, Peptide Z-PLG-NHOH (bredt spektrum MMP) og lite molekyl SB-3CT (MMP2 og 9) spesifikke inhibitorer redusere cellefolie området etter 24 timer i kultur (A). Som arealet av ubehandlede celle ark er eksponentielt fordelt (B), bør data plottes som medianverdier med standardfeil for median bestemt som beskrevet i teksten og angitt i blått (øvre referansegrense eller URL og nedre referansegrense eller LRL; ( C)). Forskjellen mellom median og nettadressen og LRL bestemme størrelsen på feilfelt på grafen (skyggelagt i lys grønn). Dette tallet har blitt forandret fra McDonald et al. 31 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Tilsetning av løselige RGD peptid fører til Blad Retraction. Ved forbehandling og etter tilsetning av en RGE-inneholdende peptid, fortsetter cellefolien for å avansere. 15 sekunder etter tilsetning av et RGD-inneholdende peptid, er det en reduksjon i lamellene ved forkanten (inserts). Etter ytterligere 30 sek begynner arket for å trekke seg tilbake, et dementi som fortsetter under varigheten av videoen (total video lengde ~ 5 min, se video 2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Immunofluorescens-analyse. Celler ble farget med et antistoff til det katalytiske domenet til MMP14a (rød) og motfarget med fluorescens-merket (488) phalloidin (grønn) og / eller DAPI(Blå). (A) og (B) representerer en typisk 4 timers arket som kommer ut fra skalaen, mens (C) og (D) viser en del av en typisk 24 timer arket. Alle bildene ble tatt ved 400X forstørrelse. Legg merke til at intensiteten av MMP14a farging er høyere i forkant av de nye celle ark (sett i (B) og (D)) og fremtredende lamellipodia er sett i leder celler (A) og (C)). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest kritiske trinnet for suksess for keratocyte explant kulturen er slik at skalaen til å følge dyrkningsskålen for ca 2 - 3 minutter før tilsetting av kulturmediet. Omtrent 75% av skalaer vil feste seg og vokse planter (antall kulturer etablert for hvert eksperiment vil måtte justeres tilsvarende). Keratocyte ark ikke dannes rundt hver skala fjernet fra fisken og plassert i kultur av flere grunner. Først DAPI farging av eksplantater viser at noen vekter har få cellene festet, og dermed er det forventet at disse skalaer ikke vil ha ark av keratocytter. Sekund, evne eksplantater å følge vevskulturskål er en viktig forutsetning for ark migrasjon. En viktig faktor for hvorvidt skalaer holde og en vellykket explant kultur er etablert er tiden mellom å plassere vekten på veksten overflaten og tillegg av media. Utilstrekkelig tid til å følge uten media vil føre til skalaer som flyterg i media (noen ganger med synlig vev festet), mens i for lang tid vil resultere i adherente skalaer med ingen vekst (antagelig på grunn av uttørking av eksplantatet med celle rester er synlige på kanten av salget). Tiden mellom skala plassering i fatet og tillegg av vekstmedium kanskje må bestemmes eksperimentelt, som faktorer som temperatur og fuktighet i laboratoriet rom kan påvirke hvor fort cellene kan feste seg til parabolen uten å tørke ut.

Selv om antall kommersielt tilgjengelige, sebrafisk spesifikke antistoffer øker, kan de forskjellige tilgjengelige reagenser være begrensende. En 85% homologi mellom immunogenet og målprotein er typisk for kryssreaksjon anses nødvendig. Imidlertid, som funksjonelle domener som aktive seter, protein-protein interaksjon områder, og områder av modifikasjon er mer konservert enn andre regioner av proteinet, kan anti-peptid-polyklonale antistoffer rettet mot disse regionene ofte blibrukes selv om generelle homologi er lav. For eksempel, selv om sebrafisk MMP14a har en samlet 68% identitet med human ortolog (forvente verdi = 0), brøkdel av identitets øker til 79-96% i katalytiske og proteinbindingsseter, mens snittsider er likeledes sterkt konservert 31. Dataene tyder på at et antistoff rettet mot det katalytisk aktive sete av humant MMP14a kryssreagerer med sebrafisk keratocytter kulturer. Forslaget om at fargingen i sebrafisk ark kan lokaliseres til de strukkede celler ved den fremre kant 31 er i samsvar med andre data som antyder at MMP14 kan tjene som en mekanisk sensor 32.

Det er ikke mulig å lage en helt sterilt eksplantering fra en fisk som svømmer i unsterile akvarier vann. Som de fleste av våre eksperimenter er fullført innen 24 timer, opplever vi ingen problemer med bakteriell eller soppsporer av explants. Imidlertid, når lengre inkuberingsperioder er ønsket, å opprettholde sterilitet of eksplantater kan bli et problem. Når du planlegger et eksperiment som involverer tre eller flere dagers inkubasjon, er flere forholdsregler tas for å øke sannsynligheten for at kulturene forbli uberørt. Først, for å redusere bakteriemengden, blir fisken tillates å svømme i ca. 1 time i tre endringer av frisk, deklorerte vann fra springen med eller uten tilsetning av 100 ug / ml kanamycin. For det andre er det media utvekslet på en daglig basis for å opprettholde tilstrekkelig nivå av antibiotika og redusere antall eventuelle bakterier tilstede. For spesielt lange inkuberinger (> 5 dager) tre vasker med 1x PBS er utført med hver medieveksling. Imidlertid introduserer dette en variabel som må tas i betraktning i den eksperimentelle design når eksplantatet kultur behandles med en eksogen forbindelsen som denne trenger for å bli erstattet med media. I tillegg vil cytokiner og vekstfaktorer som utskilles av eksplantatet fjernes med hver medieutveksling. Imidlertid, ettersom celletallet er lavt og volumet av medieter stor i et typisk keratocyte eksplantat, kan denne effekten ikke være betydelige.

Som fiskeskjell krever tre uker til fullstendig regenerere 33, anbefales det å la fisken til å gjenopprette denne periode før gjentatt bruk av fisken i eksperimentene. Selv reformere epitellaget skjer mye raskere, antar vi at du venter denne tiden mellom å bruke den samme fisken minimerer sjansen for systemiske inflammatoriske effekter som er rapportert i kutan sårtilheling i fisk 34.

Eksplantater har lenge vært anvendt for å studere oppførselen til epitelceller. Eksplantater fra et bredt spekter av fiskearter og amfibier har lignende bevegelige egenskaper ved de individuelle og kollektive celle migrasjon nivåer 3-6,35-37. Disse cellene har distinkt forskjellige bevegelige egenskaper enn pattedyr eksplantater men den overordnede strukturen og organiseringen synes å ha en høy grad av likhet 8,30,38 14.

Vi har funnet ut at denne protokollen tillater oss å studere den kollektive migrasjon av sebrafisk keratocytter hjelp primære celle eksplantater som modellerer de tidlige stadiene av sårtilheling 14. Gjennomføre eksperimenter ved hjelp nyetablerte primærkulturer unngår problemstillinger knyttet til passering av primærceller eller bruk av transformerte cellelinjer. Eksplantater kan anvendes for å studere rollen til EMT i kutan sårheling som EMT initieres ved kulturer blir etablert. Våre studier tyder på at disse primære eksplantater mer nøyaktig etterligne den naturlige adferd og migrering av keratocytter innenfor den sårede epitellaget in vivo. Denne protokollen gir grunnlag for å etablere primære kulturer for anvendelse i migrasjons analyser, så vel som for behandlingen av endringer i genet og / eller protein-ekspresjon i en tilsynelatende uendelig rekke eksperimentelle conditioner. Prosedyrene er rask, enkel, billig, reproduserbar, og egnet for bruk til enhver forskningsinstitusjon.

Oppsummert gir denne teknikken eksplantat en hurtig analyse for kollektiv cellemigrering i sammenheng med en sårheling modell som er under EMT. Tilstedeværelsen av flere celletyper i flere lag med en orienterings skala gir kompleksiteten til denne ex vivo kultursystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Midwestern Universitetet College of Health Sciences Research Tilrettelegging Grant tildelt Eeh og Midwestern Universitetet Office of Research and Sponset programmer utført Grant tildelt KJL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) MatTek P35GC-1.5-14-C 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 VWR 21909-460 We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
  2. Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
  3. Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
  4. Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
  5. Kolega, J. The Movement of Cell Clusters. J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).
  6. Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
  7. Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
  8. Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
  9. Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
  10. Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
  11. Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
  12. Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
  13. Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
  14. McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
  15. Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
  16. Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
  17. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
  18. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
  19. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).
  20. Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).
  21. Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
  22. Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
  23. Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
  24. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  25. Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
  26. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
  27. Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
  28. Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
  29. Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
  30. Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
  31. McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
  32. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
  33. Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
  34. Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
  35. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
  36. Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
  37. Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
  38. Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).

Tags

Developmental Biology Collective cellemigrasjon reepithelization sebrafisk keratocyte epitelial til mesenchymale overgang celle-celle adhesjon kutan sårtilheling
Sebrafisk Keratocyte eksplantater å studere Collective Cell Migrasjon og reepithelialization i Kutan Wound Healing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rapanan, J. L., Pascual, A. S.,… More

Rapanan, J. L., Pascual, A. S., Uppalapati, C. K., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing. J. Vis. Exp. (96), e52489, doi:10.3791/52489 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter