Protocol
1. Посадка
- Пробку поддоны (128 клеток; 28 х 54 см с ячейками 3 см квадратных и 5 см в глубину) со смесью плагин почвы. Для помощи в равномерного заполнения ячеек сжатия почвы в каждом лотке с помощью пустого лотка зажигания.
- Завод салат семена ¼ дюйма в глубину 2-3 семян на ячейку. Завод все экспериментальные линии в повторяющихся лотков обеспечивают как засуха подчеркнул и лотки управления для судебного разбирательства засухи.
- Вставьте вилку лотков в поддоном без отверстий.
- Водные лотки и крышки с перевернутой лоток или пластиковой купол. Прорастание обычно происходит в 48-72 ч. После прорастания снять крышку и перейти лотки в теплице.
Примечание: Этот протокол также может быть выполнена в ростовых камерах.
2. Рост и Уход за растениями
- Водные лотки по мере необходимости из 1-4 недель после появления всходов, обычно это 2-3 раза в неделю, заполнив нижний лоток и позволяет почву насыщается (~ 1 час) лучи, чтобы сидеть в течение длительного периодас в воде, как это может негативно повлиять на здоровье растений и развитие корневой системы и может повлиять на экран засухи.
- Оплодотворите лотки один раз в неделю с коммерческой растворимого 20-20-20 удобрения, смешанного со скоростью 1,5 ч.л. / галлон.
- Тонкие лотки до одного завода в клеточных 1-2 недель после прорастания.
3. Инициирование засухи
- Когда растения четыре недель отдельные лотки в 2 группах. Тема одна группа для острого дефицита воды. Используйте другие лотки, а также поливают управления. Вода в контрольной группе, что и в стадии 2,1 в течение всего эксперимента. В инициации засухи приостановить удобрения всех лотков для остальной части эксперимента.
- Экспериментальный период засухи происходит в течение одной недели. На начальном день суда засухи (день 0) заполнить все нижние лотки с водой и дайте почвы в пробке лотков, чтобы стать полностью насыщенным затем слить воду из лотков. Насыщение почвы непосредственно перед началом тHe период стресса поможет свести к минимуму любые изменения в почвенной влаги между отдельными клетками в пробке лотков.
4. Проведение стресс-экрана Основные засухой измеряемых параметров
Примечание: Следующие шаги описывают, как собрать три физиологических измерений, которые будут записаны в течение части экрана засухи в то время как В таблице 1 приводится график проведения измерений в каждый день от засухи стресс испытательного срока.
- Измерьте Leaf Относительная доля воды (RWC) в дни 0, 2, 4 судебного разбирательства.
- Клип салата растение из лотка и удалите 2 листьев.
- Удар 3 диски с каждого листа, используя # 9 пробки буром (~ диаметр 1,6 см). Комбинат листьев ударов, как одного образца.
- Взвесить дисков листьев, это значение сырого веса (FW), используемый для расчета RWC, затем поместить диски в чашку Петри.
- Добавить дистиллированной воды ровно столько, чтобы пластины для всехой все листовые пластинки плавать. Это необходимо для полной гидратации дисков листьев, чтобы собрать напыщенный веса для RWC анализа. Разрешить диски листьев, чтобы плавать в течение 24 ч при комнатной температуре.
- Снимите теперь полностью гидратированных диски лист из пластин и осторожно высушить Внешний вид листовых дисков с бумажными полотенцами перед взвешиванием диски. Запишите эти веса, как напыщенный веса (TW) для RWC расчета.
- Место листовые диски на лабораторном бумаги стереть или фильтровальную бумагу диска в открытом Петри и сушат в термостате при 55 ° С в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: бумага предотвращает дисков листьев от присоединения к чашке Петри во время сушки. - Взвешивание сухих листьев диски и записывать в виде сухих веса (DW) для RWC расчета.
- Рассчитать RWC по формуле Уэзерли, как описано умные и Бингем 11,12.
RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
FW = сырой массы, в TW = напыщенный масса, СМ = сухая масса - Повторите шаг 4,1 для каждого зародышевой плазмы и лечения в исследовании.
- Запишите завод хочешь один раз в день, начиная с дня 1 судебного разбирательства засухи и заканчивая, когда 100% растений увядшие, как правило, 4 день или 5.
- Фаза восстановления и дифференциального роста
- На 6-й день, заключить период засухи стресс и ударные установки войти в фазу восстановления судебного разбирательства. Заполните нижние лотки с водой и дайте засуха подчеркнул лотки впитаться в течение 24 часов, прежде чем возобновить стандартный график полива, шаг 2,1, как управляющие лотков.
- Разрешить все растения восстановиться в течение 10 дней.
- В 10 дней после засухи стресс урожай надземной части каждого растения полностью, и записать свежий вес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При выполнении большого экрана, позволяющей сортировать население желаемым экспериментальной признака, в случае этого протокола ответ от засухи стресс, данные, полученные будет соответственно изменяться от очень подчеркнуть восприимчивы к вероятной засухоустойчивых и во всех пунктах между ними. Рисунок 1 содержит графы, представляющие тип результатов, которые можно ожидать от этого протокола. Представительства сортов трех различных типов салата (ромэн (CoS), crisphead и butterhead) включены в приведенных данных. В то время как данные, представляющие только три вида салата показаны здесь этот протокол был разработан в ходе проверки тысяч салата и шпината зародышевой плазмы через большинство типов. В дополнение к трем типам салата упоминалось ранее этот протокол был успешно использованы для скрининга красный и зеленый лист и стебель салата типа наряду с зародышевой плазмы из близкородственных видов Lactuca serriola а также связаны леAFY зеленый овощ шпината. Авторы использовали данные, полученные с помощью этого протокола, чтобы сузить салата Коллекция из более чем 4000-кандидата бассейна 200 салата сортов для полевых испытаний.
Рисунок 1. Представитель Результаты Приведенные данные являются репрезентативными для трех физиологических измерений, включенных в этот протокол для трех типов салата, в том числе ромэн (CoS, ROM), crisphead (CRSP), и butterhead (Но). () Процент растений, которые которые завяли на каждый день от засухи пиковый период судебного разбирательства, начиная с 1 дня, будет записываться, пока все растения не достигают 100% сник. (B) Leaf относительное содержание воды измеряется в дни 0, 2 и 4. -D : засухи стресс, -С:. контроль (C) Вес растений после периода засухи стресса и восстановления 10 дней с указанием дифференциал роста в связи сзасухи стресс. Усы представляют стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Представитель лотки и примеры посадки диаграммы (А и B) Пример поддоны показывает отклик от засухи стресс на 3 день суда, используя этот протокол, по сравнению с контрольными лотков. (C и D) Эти диаграммы лоток представляют подключаемые лотки 128, используемые, показывающие два способа посадки, используемые в этом протоколе. Внешние края лотков (серым цветом клетки) должны быть установлены, но не используются для экспериментальных образцов, из-за склонности краевых клеток высохнуть быстрее, чем внутренние клетки.
| День | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RWC-FW | X | X | X | ||||
| Уилт | X | X | X | X | (Х) | (Х) | |
| Удерживать воду | X | ||||||
| Резюме полива | X |
Таблица 1. Расписание период засухи стресс. Вода удерживается из экспериментальныхЛотки, начиная с дня 0 судебного разбирательства и полив возобновляется в день 6. Свежие образцы для измерения содержания лист относительно воды берутся в дни 0, 2, 4 и процент растений увядшие записываются ежедневно, начиная с 1 дня и продолжается до 100 % растений увядшие, как правило, 4 день, но может быть продлен до 5 или даже 6 день.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Соображения объема выборки для экрана.
Количество образцов, необходимых должны быть основаны на желаемой использования данных из этого экрана. Если результаты качественное издание желательно рекомендуется собирать 3 отдельных растений (3 биологических повторяет) из каждой строки и выполнить минимум 2 экспериментальных повторов, чтобы дать адекватные баллов за качество статистического анализа. Если желаемый результат просто быстро сузить большой бассейн кандидата зародышевой плазмы в целях выполнения более строгих или сложных экспериментов водного стресса, меньше сэмплов и или дублированные может быть необходимым. Количество образцов, необходимых должно быть принято во время посадки.
Расположение Посадка и соображения сушки почвы в лотках.
Один очень важным фактором является то, что почва в клетках на краю пробки лоток высохнет быстрее, чем внутренние клетки и уходадолжны быть приняты, чтобы избежать предвзятости в результатах лишь сбором растений из салона лоток (рис 2). Только уборки растений от внутренних клеток, скорее всего, влияют на посадку расположение лотка. В экране, в котором этот протокол был разработан от 3 до 6 уникально зародышевой плазмы была посажена на штекер лоток вместе с управления салата сорта. Одна из проблем скрининга на засухоустойчивость в специализированном урожая часто не существует ноу стрессоустойчивость или чувствительный зародышевой плазмы для использования в качестве положительного или отрицательного контроля. При отсутствии положительной или отрицательной управления не доступен также в разработке этого протокола использование стандартного зародышевой плазмы в течение всех испытаний позволяет базовом уровне внутреннего контроля изменчивости условий в течение каждого экрана. , Которые могут быть установлены непосредственно способствовать скорости, с которой сбор зародышевой плазмы могут быть подвергнуты скринингу, но ограничен по количеству растений, необходимых для ВАС количество другой зародышевой плазмойч измерения, проведенные в ходе судебного разбирательства. Ограничивая количество уникальных зародышевой плазмы в каждом лотке между 3 и 6 все салата можно высаживать в двух местах в каждом лотке заверив, что не салат не посадили только в наружных клетках. Еще одно соображение, что изменчивость темпов роста и размера растений, среди зародышевой плазмы может привести к снижению темпов сушки почвы в клетках, содержащих малые сортов. Это может потенциально результаты смещения в сторону малых сортов, находящихся над представлена среди потенциальных засухоустойчивых зародышевой плазмы вытащил из этого экрана, но это, кажется, не пример, основанный на наблюдаемых результатов. Кроме того, использование жестких вторичных методов для изучения кандидата зародышевой плазмы из этого протокола следует подтвердить или опровергнуть эти результаты.
Важность согласованности по наблюдению увядания.
Мониторинг растений для увядания должны быть выполнены в то же самоераз в день в, чтобы избежать даже незначительные колебания в появлении напряжения растений, наблюдается как хочешь, скорее всего, вызвано температуры и влажности колебаний, присутствующих в теплице, а также циркадного регулирования устьица. Кроме того, убедитесь, что согласуется когда забил растения, как увядшие или нет. Создание набора руководящих принципов в выигрыше увядания особенно важно, если несколько лиц, будет выступать на экран гарантирует стабильность результатов. Порог, используемый для данного протокола является все листья растения должны быть увядших забить растение как время сник.
Выбор измеряемых параметров.
Измеряемые параметры в этом протоколе были выбраны на основе их полезности в определении водного стресса наряду с адаптивностью измерений на полу-Высокая пропускная способность системы с использованием минимального доступного труда. Многие другие измерения могут быть очень полезны в выявлении засухи стресс (например,., Фотосинтетической активности, Рост корней, устьичную проводимость ...), и в зависимости от характера экрана, который будет выполняться (т.е. количество зародышевой плазмы используется, количество повторов, скорость пропускной лучшего ...) и другие параметры могут быть легко включены в этот экран.
Комментарии по применению результатов протокол.
Коллекции USDA содержит более 4000 индивидуальных салата зародышевой плазмы, которая число, которое делает полевые испытания, включающие все зародышевой плазмы непрактично. Этот протокол был разработан с одиноким целью позволить очень небольшое количество исследователей (1-2 особей) на экран коллекции USDA для потенциального засухоустойчивость. Благодаря использованию этих методов сбора АССР была сужена до 200 сортов, которые затем были использованы в ходе полевых испытаний, которые могут более тесно копирующих условия засухи стресс. Этот протокол был также использован, чтобы сузить населением более 400 шпинатом зародышевой плазмы 40 для использования в полевых TriaLs. Только в этом протоколе не следует считать достаточным для идентификации с высокой степенью уверенности зародышевой плазмы, которая содержит прочный засухи терпимости в условиях водного стресса на местах, а может просто служить в качестве инструмента для быстрого скрининга для потенциального стрессоустойчивости в условиях дефицита воды в быстрое и эффективное экран с использованием большого количества зародышевой плазмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
