Protocol
1. Dikim
- Fiş tepsileri doldurun (128 hücre; 3 cm kare hücreleri ile 28 x 54 cm ve 5 cm derinliğinde) fiş toprak karışımı ile. Hücrelerin düzgün dolum yardımcı olmak için boş bir fiş tepsisini kullanarak her tepsiye toprak sıkıştırmak.
- Bitki marul tohumu ¼ derinlemesine hücre başına 2-3 tohum inç. Bitki Çoğaltılmış tepsiler tüm deneysel hatları kuraklık hem stresli ve kuraklık deneme için kontrol tepsiler sağlamak.
- Deliksiz bir taban tepsisine fiş tepsilerini yerleştirin.
- Ters tepsiye veya plastik kubbe Su tepsiler ve kapak. Çimlenme normal olarak 48-72 saat içinde, gerçekleşir. Çimlenme sonra kapağı çıkarın ve sera içine tepsileri taşımak.
NOT: Bu protokol, aynı zamanda büyüme odalarına gerçekleştirilebilir.
2. Büyüme ve Bitki Bakımı
- Çimlenme sonrası 1-4 hafta gerektiğinde su tepsiler, normalde bu toprak alt tepsiyi doldurarak ve izin vererek, 2-3 kez haftalık uzun süre oturmak (~ 1 saat) ışınları doymuş hale içinBu gibi suda s olumsuz bitki sağlığı ve kök gelişimini etkileyebilecek ve kuraklık ekranı etkileyebilir.
- 1.5 tk / galon bir oranda karıştırılmış ticari çözünür 20-20-20 gübresi ile haftada bir kez tepsileri döller.
- Hücre 1-2 hafta başına bir bitki İnce tepsiler çimlenme sonrası.
3. başlatılıyor Kuraklık Stres
- Bitkiler 2 gruba dört haftalık ayrı tepsiler zaman. Şiddetli su stresine tabi bir grup. Yanı sıra kontrolleri sulanan diğer tepsileri kullanın. Deney boyunca adım 2.1 gibi kontrol grubu sulayın. Kuraklık stresi başlangıcında deney kalanı için tüm tepsileri gübreleme askıya alma.
- Deneysel kuraklık dönemi bir hafta içinde oluşur. Kuraklık stresi deneme (Gün 0) ilk gününde su ile düşük tepsileri doldurmak ve fiş tepsilere toprak sonra tam doymuş hale kasetlerden suyu tahliye için izin verir. T başlamasından hemen önce toprak doyurulmasıHe stres dönemi fiş tepsiler bireysel hücreler arasında toprak nem herhangi bir varyasyonu en aza indirmek için yardımcı olacaktır.
Parametreler ile Temel Kuraklık Stres Ekranı yapılması 4. Ölçülen edilecek
NOT: Aşağıdaki adımlar Tablo 1 kuraklığa stres deneme süresi her gün alınan ölçümlerin bir program sağlarken kuraklık ekran boyunca kaydedilecektir üç fizyolojik ölçümler toplamak için nasıl özetlemektedir.
- Gün 0, 2, deneme 4 Yaprak Oransal Su İçeriği (OSK) ölçün.
- Tepsiden bir marul bitki Klip ve 2 yaprak çıkarın.
- Bir 9. mantar delici (~ 1.6 cm çapında) kullanarak her yapraktan 3 diskleri Punch. Bir örnek olarak yaprak yumruklar birleştirin.
- Yaprak diskleri tartılır, bu RWC hesaplanmasında kullanılan taze ağırlığı (FW), bir değerdir, daha sonra da bir petri plakasında diskleri yerleştirin.
- Tüm plaka için yeterli Damıtılmış su ekleyinow tüm yaprak diskleri float. Bu tamamen RWC analiz için şiş ağırlıkları toplamak için yaprak diskleri hidrat etmektir. Yaprak diskleri, oda sıcaklığında 24 saat boyunca kalmasına izin verin.
- Plakalardan artık tamamen hidrate yaprak diskleri çıkarın ve yavaşça diskleri tartı önce kağıt havlu ile yaprak diskleri dış kurulayın. RWC hesaplama için abartılı ağırlık (TW) olarak bu ağırlıkları kaydedin.
- Bir kağıt laboratuarda yerleştirin yaprağı diskleri, 24 saat boyunca 55 ° C'de inkübatör içinde silme ya da açık bir petri filtre kağıdı diski ve kurutulur.
NOT: Kağıt kurutma sırasında petri yapışmasını yaprak diskleri engeller. - Kuru yaprak diskleri ve RWC hesaplama için rekor olarak kuru ağırlıkları (DW) tartılır.
- Smart ve Bingham 11,12 tarafından tarif edildiği gibi OSK Weatherley formülü kullanılarak hesaplayın.
OSK = (FW-DW / TW-DW) x 100
FW taze ağırlık, TW = şiş ağırlık, DW = kuru ağırlığı = - Deneme her germplazma ve tedavi için yineleyin 4.1.
- Kaydedin bitki solgunluk kuraklık stresi deneme gün 1 ve bitkilerin% 100 normal günde 4 ya da 5, soldu zaman biten günde bir kez bir başlangıç.
- Kurtarma fazı ve büyüme diferansiyel
- 6. günde, kuraklığa stres dönemi sonuçlandırmak ve stresli bitkiler deneme toparlanma sürecine girmek. Kontrol tepsiler gibi, 2.1 adım, su ile düşük tepsiler doldurun ve kuraklık vurguladı tepsiler standart sulama takvimi başlamadan önce 24 saat bekletin.
- Tüm bitkileri, 10 gün süre ile iyileşmeye izin verin.
- 10 gün post kuraklığa stres, her bitkinin toprak bölümü tüm yukarıdaki hasat ve taze ağırlığı kaydetmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kuraklığa stres yanıtı halinde, istenilen deneysel özellik bir nüfusa ayırmak için büyük bir ekran yaparken, buna çok çeşitlidir olacak oluşturulan veriler muhtemel kuraklık toleranslı ve aradaki tüm noktalarda duyarlı stres. Şekil 1, bu protokol beklenen sonuçlara türünü temsil eden grafikler içeriyor. Üç farklı marul türlerine (marul (COS), marullarda ve Butterhead) temsili çeşidi sunulan veriler dahil edilmiştir. Sadece üç marul türleri temsil eden veriler burada gösterilir iken bu protokol çoğu türleri arasında marul ve ıspanak germplazmı binlerce tarama sırasında geliştirilmiştir. Marul üç tür ek olarak daha önce bu protokol başarıyla le ilgisiz yanı sıra yakından ilişkili Lactuca serriola türlerinden germplazmında birlikte tipi marul, kırmızı ve yeşil yaprak ekran ve kök kullanılmıştır sözafy yeşil sebze ıspanak. Yazarlar tarla denemeleri için 200 marul çeşitleri aday havuzuna 4.000 bir marul koleksiyonu daraltmak için bu protokolü kullanılarak oluşturulan veriler kullanılır.
Gösterilen Şekil 1. Temsilcisi Sonuçlar Veriler üç fizyolojik ölçümlerin temsilcisi romaine (cos, ROM), marullarda (CRSP), ve Butterhead (AMA) olmak üzere üç marul türleri, bu protokolde yer olduğunu. (A) bitkilerin yüzdesi o Tüm bitkiler% 100 soldu ulaşana kadar günde 1 başlayarak, deneme kuraklığa stres döneminin her gününde soldu edilir, (B) Yaprak oransal su içeriği günlerde 0, 2 ölçülür. kaydedilir ve 4. D : kuraklığa stres, -C:. nedeniyle büyüme farkını gösteren kuraklık stres döneminden sonra bitki ve 10 gün iyileşme kontrolü (C) Ağırlıkkuraklığa stres. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Temsilcisi tepsiler ve örnek dikim diyagramlar (A ve B) Örnek tepsiler tepsiler, kontrol ile karşılaştırıldığında bu protokolü kullanan bir deneme günde 3 kuraklığa stres yanıtı göstermektedir. (C ve D) Bu tepsi şemaları bu protokolde kullanılan iki dikim yöntemleri gösteren kullanılan 128 fiş tepsileri temsil eder. tepsilerine (gölgeli hücreleri gri) dış kenarları dikilmiş, ancak daha hızlı bir iç hücrelerden daha kuruması nedeniyle kenar hücrelerinin eğilimi, deneysel örnekler için kullanılmaz edilmelidir.
| Gün | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| OSK-FW | X | X | X | ||||
| Wilt | X | X | X | X | (X) | (X) | |
| Su kesintisi | X | ||||||
| Sulama Özgeçmiş | X |
Kuraklığa stres dönemi Tablo 1. Zaman Çizelgesi. Deneysel tevkif edilir Suyaprak oransal su içeriği ölçümleri için 6. Taze örnekleri davanın günde 0 başlayan ve gün özgeçmişlerini sulama tekneler günlerde 0, 2, 4 alınır, ve bitkilerin yüzde 1 gün günlük başlangıç kaydedildi ve 100 yılına kadar devam ediyor wilted Bitkilerin% normalde günde 4, soldu, ancak günde 5 ya da 6 uzanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekran için örnek sayısının Hususlar.
gerekli numune sayısı bu ekrandan verilerin istenen kullanıma bağlı olmalıdır. Yayın kalitesi sonuçları istenirse her satırından 3 ayrı bitkiler (3 biyolojik çoğaltır) hasat ve kalite istatistiksel analiz için yeterli puan vermek için 2 deneysel çoğaltır en az gerçekleştirmek için tavsiye edilir. İstenilen sonuç ise sadece hızlı daha sıkı veya karmaşık su stres deneyleri, daha az örnekleri gerçekleştirmek için aday germplazmı büyük bir havuz daraltmak için ve ya çoğaltır gerekli olabilir. Gerekli örnek sayısı ekim sırasında karar verilmelidir.
Dikim düzeni ve tepsiler toprak kurutma hususlar.
Bir çok önemli bir göz fiş tepsinin kenarına hücrelerinde toprak iç hücreleri ve bakımı daha hızlı kurur olduğunuSadece tepsi iç (Şekil 2) bitkileri hasat sonuçların önyargı önlemek için alınmalıdır. Sadece büyük olasılıkla tepsinin dikim düzeni etkileyecek iç hücrelerden bitki hasat. 3 ve 6 benzersiz genetik materyaller bir kontrol marul çeşidi ile birlikte fiş tepsi başına dikildi arasındaki bu protokol geliştirilmiş olan ekran sırasında. Bir özel ekin kuraklık toleransı için tarama zorluklardan biri genellikle pozitif ya da negatif kontroller kullanmak için hiçbir teknik stres toleranslı veya duyarlı jermplazmanın vardır olduğunu. Pozitif veya negatif kontrol, bu protokolün geliştirilmesi gibi mevcut olduğunda tüm çalışmalarda boyunca standart germplazmı kullanımı her ekranın boyunca koşulların değişkenliği iç kontrol temel düzeyde sağlar. doğrudan tohum genetik materyalinin toplama taranabilir hızına katkıda dikilebilir ancak EAC için gereken bitkilerin sayısı ile sınırlıdır, farklı tohum genetik materyalinin sayısıh ölçüm yargılama sırasında alınan. Tüm marul 3 ila 6 her tepsiye tek germplazmı sayısını sınırlayarak hiçbir marul sadece dış hücrelerde ekili olduğunu güvence her tepsi içinde iki yerde dikilmiş olabilir. Başka bir göz germplazmında arasında büyüme oranı ve bitki büyüklüğü değişkenlik küçük çeşitleri içeren hücrelerde toprak kurutma oranlarının azalmasına neden olabilir olmasıdır. Bu olabilir potansiyel olarak bu ekrandan çekti potansiyel kuraklığa dayanıklı germplazma arasında temsil, ancak bu gözlenen sonuçlara göre durum değildi üzerinde olan küçük çeşitlerinin yönünde önyargı sonuçları. Ayrıca, bu protokol aday jermplazmalarını incelemek için sıkı ikincil yöntemlerinin kullanılması onaylamak veya bu sonuçları çürütmek gerekir ya.
Solgunluk gözlenmesi tutarlılık Önemi.
solgunluk için bitki izleme aynı yapılmalıdırBitki stres görünüm küçük dalgalanmaları önlemek için günlük zaman, gibi solgunluk olasılıkla bir sera gibi stoma sirkadiyen yönetmelikte mevcut sıcaklık ve nem dalgalanmalardan kaynaklanan gözlemledik. Ayrıca, soldu veya değil bitkiler puanlama yaparken tutarlı olmak emin olun. Birden bireyler tutarlı sonuçlar sağlamak için ekranı sahne olacak eğer puanlama solgunluk rehberlerin bir dizi oluşturulması özellikle önemlidir. Bu protokol için kullanılan eşik bitkinin tüm yaprakları solmuş olan gibi bitki puan soldu olması gerekir.
Parametrelerinin seçimi ölçüldü.
Bu protokolde ölçülen parametreler az kullanılabilir emek kullanan bir yarı-yüksek verimli sistemine ölçümlerin uyum ile birlikte su sıkıntısı belirlenmesinde onların kullanışlılığı dayalı seçildi. Birçok diğer ölçümler (kuraklığa stres belirlenmesi, örneğin., Fotosentez aktivitesinin çok yararlı olabilirKök büyümesi, ağıza ait iletkenlik ...), ve gerçekleştirilecek ekranın doğasına göre (örneğin, tohum genetik materyalinin sayısı diğer parametreler, bu ekran içine dahil edilebilir), kopya sayısı, istenen iş verimine oranını ... kullanılabilir.
Protokol sonuçlarının kullanımına ilişkin yorumlar.
USDA koleksiyonları tüm germplazmı pratik içeren alan denemeleri yapan bir sayıdır 4.000 bireysel marul germplazmında üzerinde içerir. Bu protokol, potansiyel kuraklık toleransı USDA koleksiyonlarını taramak için araştırmacıların çok az sayıda (1-2 kişi) izin veren tek amacı ile geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin kullanımı sayesinde USDA koleksiyonu sonra daha yakından kuraklığa stres koşullarını çoğaltabilirsiniz saha denemelerinde kullanılan 200 çeşit daraltılmıştır. Bu protokol ayrıca alan tria kullanılmak üzere 40 400 ıspanak germplazmı bir nüfusa daraltmak için kullanılanls. Tek başına bu protokol alan su stres koşullarında dayanıklı kuraklığa tolerans içeren kesinlik germplazmı yüksek derecesi ile tanımlamak için yeterli kabul edilmemelidir, ama sadece hızlı bir su açığı koşullarında potansiyel stres toleransı taranması için bir araç olarak hizmet verebilir germplazmı çok sayıda kullanarak hızlı ve verimli bir ekran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
