Protocol
1. L'impianto
- Riempire vassoi spina (128 cellule, 28 x 54 cm con celle quadrate 3 cm e 5 centimetri di profondità) con miscela di suolo spina. Per facilitare il riempimento uniforme delle cellule comprimere suolo in ciascun vassoio utilizzando un alveolo vuoto.
- Impianto lattuga seme ¼ di pollice di profondità 2-3 semi per cella. Impianto tutte le linee sperimentali vassoi replicati per fornire sia un periodo di siccità ha sottolineato e vassoi di controllo per il processo di siccità.
- Mettere vassoi spina in un vassoio di base senza fori.
- Vassoi d'acqua e coprire con vassoio rovesciato o cupola di plastica. La germinazione avviene normalmente in 48-72 ore. Dopo la germinazione rimuovere il coperchio e spostare i vassoi in serra.
NOTA: Questo protocollo può essere eseguito anche in camere di crescita.
2. Crescita e Cura delle piante
- Vassoi acqua qb 1-4 settimane dopo la germinazione, di solito si tratta di 2-3 volte a settimana, compilando vassoio inferiore e permettendo il suolo si saturi (~ 1 ora) i raggi di sedersi per lungo periodos in acqua come questo può avere un impatto negativo sulla salute delle piante e lo sviluppo delle radici e possono influenzare lo schermo siccità.
- Fertilizzare vassoi una volta alla settimana con un commerciale solubile 20-20-20 fertilizzante mescolato ad una velocità di 1,5 cucchiaino / gal.
- Vassoi sottili a una pianta per cellulari 1-2 settimane dopo la germinazione.
3. Avvio stress idrico
- Quando le piante sono quattro settimane vassoi separati in 2 gruppi. Salvo un gruppo a forte stress idrico. Utilizzare gli altri vassoi come controlli irrigui. L'acqua del gruppo di controllo, come nel passo 2.1 tutto l'esperimento. Alla apertura di stress della siccità suspend concimazione tutti i vassoi per il resto dell'esperimento.
- Il periodo di siccità sperimentale si verifica più di una settimana. Il giorno prima del processo stress idrico (Giorno 0) riempire tutti i vassoi inferiori con acqua e lasciare il terreno nei vassoi spina per diventare completamente saturo poi defluire l'acqua dai vassoi. Saturando immediatamente il terreno prima di iniziare la tl periodo di stress aiuterà a ridurre al minimo qualsiasi variazione di umidità del suolo tra le singole cellule nei vassoi spina.
4. L'esecuzione Stress schermata di base siccità con parametri da misurare
NOTA: Le seguenti operazioni delineano come raccogliere i tre misurazioni fisiologiche che verranno registrati nel corso dello schermo siccità mentre la tabella 1 fornisce un calendario delle misure effettuate ogni giorno del periodo di prova di siccità-stress.
- Misurare la Leaf relativo contenuto di acqua (RWC) nei giorni 0, 2, 4 del processo.
- Agganciare un impianto di lattuga dal vassoio e rimuovere 2 foglie.
- Punch 3 dischi di ogni foglia utilizzando un piralide # 9 di sughero (~ 1,6 centimetri di diametro). Combina pugni foglia come un campione.
- Pesare i dischi fogliari, questo è il valore di peso fresco (FW) utilizzato per il calcolo RWC, quindi inserire i dischi in una piastra di petri.
- Aggiungere sufficiente solo acqua distillata alla piastra a tuttiow tutti i dischi di foglie di galleggiare. Questo è quello di idratare completamente i dischi fogliari per raccogliere pesi turgidi per l'analisi RWC. Lasciare i dischi fogliari di galleggiare per 24 ore a temperatura ambiente.
- Rimuovere i dischi fogliari ora completamente idratati dai piatti e asciugare delicatamente la parte esterna dei dischi fogliari con asciugamani di carta prima di pesare i dischi. Registrare questi pesi come peso turgido (TW) per il calcolo RWC.
- Posizionare dischi fogliari su un laboratorio di carta pulire o disco di carta filtro in una capsula di Petri aperta e secca in incubatore a 55 ° C per 24 ore.
NOTA: La carta impedisce ai dischi fogliari di aderire alla scatola Petri durante l'essiccazione. - Pesare dischi foglia secca e registrare pesi secche (DW) per il calcolo RWC.
- Calcola RWC usando la formula di Weatherley come descritto da Smart e Bingham 11,12.
RWC = (FW-DW / TWDW) * 100
FW = peso fresco, TW = peso turgido, DW = peso secco - Ripetere il passaggio 4.1 per ogni germoplasma e trattamento in studio.
- Registrare la pianta appassiscono inizio una volta al giorno il giorno 1 del processo di stress siccità e termina quando il 100% delle piante sono appassiti, normalmente il giorno 4 o 5.
- Fase di recupero e differenziale di crescita
- Il giorno 6, concludere il periodo di siccità stress e le piante stressate entrano nella fase di recupero del processo. Riempire i vassoi inferiori con acqua e lasciare i vassoi siccità sottolineato in ammollo per 24 ore prima di riprendere il programma di irrigazione normale, passo 2.1, come i vassoi di controllo.
- Consentire a tutti gli impianti di recupero per 10 giorni.
- A 10 giorni dopo la siccità stress raccogliere tutta la porzione di terreno sopra di ogni pianta e registrare il peso fresco.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Quando si esegue un grande schermo per separare una popolazione dal carattere sperimentale desiderato, nel caso di questo protocollo di risposta alla siccità-stress, i dati generati corrispondentemente variare da molto sottolineano suscettibile di probabile siccità tollerante e tutti i punti intermedi. Figura 1 contiene grafici che rappresentano il tipo di risultati che si può aspettare da questo protocollo. Cultivar rappresentative di tre diversi tipi di lattuga (Romaine (cos), Crisphead, e Butterhead) sono inclusi nei dati riportati. Mentre i dati che rappresentano solo tre tipi di lattuga sono mostrati qui questo protocollo è stato sviluppato durante la proiezione di migliaia di lattuga e spinaci germoplasma attraverso maggior parte dei tipi. Oltre ai tre tipi di lattuga precedentemente menzionato questo protocollo è stato utilizzato con successo per schermare foglio rosso e verde e stelo tipo lattuga con germoplasma dalle specie strettamente correlate Serriola Lactuca nonché il correlato leAFY spinaci verdura verde. Gli autori hanno utilizzato dati generati utilizzando questo protocollo per restringere una raccolta lattuga di oltre 4.000 per un pool di candidati di 200 varietà di lattuga per prove sul campo.
Figura 1. Rappresentante Risultati I dati indicati sono rappresentativi delle tre misurazioni fisiologiche incluso in questo protocollo per tre tipi di lattuga, tra cui romaine (cos, ROM), Crisphead (CRSP), e butterhead (MA). (A) La percentuale di piante che sono appassiti ogni giorno del periodo di siccità stress del processo, a partire dal giorno 1, si registra fino a quando tutte le piante raggiungono il 100% appassito. (B) Leaf contenuto di acqua rispetto è misurato nei giorni 0, 2, e 4-D : siccità stress, -C:. di controllo (C) Peso di piante dopo un periodo di siccità di stress e di recupero 10 giorni mostrano differenziale di crescita a causa disiccità-stress. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. vassoi di rappresentanza e di esempio piantando diagrammi (A e B) vassoi di esempio mostrano la risposta alla siccità stress il giorno 3 di un processo utilizzando questo protocollo rispetto ai vassoi di controllo. (C e D) Questi schemi vassoio rappresentano i vassoi 128 spina impiegati che mostrano due metodi di impianto utilizzati in questo protocollo. I bordi esterni delle vaschette (grigio celle ombreggiate) dovrebbero essere piantati, ma non utilizzati per i campioni sperimentali, causa la propensione delle cellule bordo ad asciugare più rapidamente delle cellule interne.
| Giorno | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RWC-FW | X | X | X | ||||
| Wilt | X | X | X | X | (X) | (X) | |
| Trattenere l'acqua | X | ||||||
| Riprendi innaffiamento | X |
Tabella 1. Calendario del periodo di siccità-stress. L'acqua viene trattenuta dalla sperimentalevassoi inizio il giorno 0 del processo e irrigazione riprende il giorno 6. campioni freschi per le misurazioni del contenuto foglia acqua relative sono prese nei giorni 0, 2, 4, e la percentuale di piante avvizzite sono registrati all'inizio quotidiano il giorno 1 e fino a 100 % di piante sono appassiti, normalmente il giorno 4, ma può estendersi al giorno 5 o addirittura 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Considerazioni di numero di campione per schermo.
Il numero di campioni necessari deve basarsi sull'uso desiderata dei dati da questa schermata. Se i risultati di qualità pubblicazione si desiderano, si raccomanda di raccogliere 3 impianti individuali (3 repliche biologiche) da ogni linea ed eseguire un minimo di 2 repliche sperimentali per dare punti adeguati per l'analisi statistica di qualità. Se il risultato desiderato è semplicemente quello di restringere rapidamente una grande piscina di candidati germoplasma per eseguire esperimenti di acqua-stress più severi o complessi, meno campioni e o repliche possono essere necessarie. Il numero di campioni necessari deve essere deciso al momento della piantagione.
Layout impianto e considerazioni di essiccamento del suolo in vassoi.
Una considerazione importante è che il terreno in cellule sul bordo del vassoio spina si asciuga più rapidamente delle cellule e cura internidovrebbero essere prese per evitare distorsioni nei risultati solo raccolta delle piante dall'interno cassetto (Figura 2). Solo raccolta delle piante dalle cellule interne potrebbe influenzare il layout semina del vassoio. Durante la schermata in cui questo protocollo è stato sviluppato tra il 3 e il 6 germoplasma unico è stato piantato per alveolo con un cultivar di controllo lattuga. Una delle sfide di screening per la tolleranza alla siccità in una coltura di specialità è spesso non esiste lo stress conoscenze germoplasma tolleranti o suscettibili di utilizzare i controlli come positivi o negativi. Quando nessun controllo positivo o negativo è disponibile come nello sviluppo di questo protocollo l'uso di un normale germoplasma in tutte le prove consente un livello base di controllo interno per la variabilità di condizioni presenti ogni schermata. Il numero di diversi germoplasma che può essere piantato contribuirà direttamente alla velocità con cui una collezione di germoplasma può essere schermato, ma è limitata dal numero di impianti necessari per eacmisura h scattate durante il corso del processo. Limitando il numero di germoplasma unico in ogni vassoio tra 3 e 6 tutte lattuga possono essere piantati in due posizioni all'interno di ogni cassetto assicurando che nessun lattuga è piantato in solo le cellule esterne. Un'altra considerazione è che la variabilità del tasso di crescita e le dimensioni dell'impianto tra germoplasma può portare a tassi ridotti di essiccazione del suolo nelle cellule contenenti piccole varietà. Questo potrebbe potenzialmente risultati di polarizzazione in direzione di piccole varietà di essere al di sopra rappresentato tra potenziale Resistente germoplasma tirato da questa schermata, ma questo non sembra essere il caso sulla base dei risultati osservati. Inoltre, l'utilizzo di metodologie secondari severi per studiare il germoplasma candidato da questo protocollo dovrebbe confermare o confutare questi risultati.
L'importanza di coerenza sull'osservazione di avvizzimento.
Il monitoraggio degli impianti per appassire deve essere eseguita allo stessotempo quotidiano per evitare piccole fluttuazioni nella comparsa di stress delle piante, ha osservato come vuoi, probabilmente causato da temperatura e umidità fluttuazioni presenti in una serra e regolazione circadiana degli stomi. Inoltre, essere sicuri di essere coerenti quando segnando piante appassite o no. Stabilire una serie di linee guida a punteggio appassire è particolarmente importante se più persone si esibiranno lo schermo per garantire risultati coerenti. La soglia utilizzata per questo protocollo è tutte le foglie della pianta devono essere appassite di segnare la pianta ad essere appassito.
Selezione dei parametri misurati.
I parametri misurati in questo protocollo sono stati scelti in base alla loro utilità per identificare stress idrico con l'adattabilità delle misure ad un sistema semi-alta velocità che utilizza il minimo lavoro disponibile. Molte altre misure possono essere molto utili per identificare siccità stress (ad es., L'attività fotosintetica, La crescita delle radici, conduttanza stomatica ...), e sulla base della natura dello schermo che verrà eseguita (ad esempio, il numero di germoplasma utilizzato, numero di repliche, il tasso di rendimento desiderato ...) altri parametri possono essere facilmente incorporati in questa schermata.
Osservazioni sull'uso dei risultati di protocollo.
Le collezioni USDA contiene oltre 4.000 germoplasma lattuga individuale che è un numero che fa esperimenti sul campo che incorporano tutti germoplasma impraticabile. Questo protocollo è stato sviluppato con lo scopo di consentire solo un piccolo numero di ricercatori (1-2 persone) per schermare le collezioni USDA per il potenziale di tolleranza alla siccità. Attraverso l'uso di questi metodi di raccolta USDA è stato ridotto a 200 varietà che venivano poi utilizzati in prove sul campo in grado di replicare più da vicino le condizioni di siccità-stress. Questo protocollo è stato utilizzato anche per limitare una popolazione di oltre 400 spinaci germoplasma a 40 per l'utilizzo in campo trials. Questo protocollo da solo non dovrebbe essere considerata sufficiente per identificare con un alto grado di certezza germoplasma che contiene resistente alla siccità tolleranza, in condizioni di stress idrico, ma può semplicemente servire come strumento di screening rapido per la tolleranza allo stress potenziale in condizioni di deficit idrico in un schermo rapida ed efficace utilizzando un gran numero di germoplasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
