Protocol
1.植栽
- プラグ土壌ミックスで、（セル3センチの正方形と28のx 54センチメートル5cmの深い128セル）プラグトレーを埋める。細胞の均一な充填を助けるためには、空のプラグトレイを使用して、各トレイに土を圧縮する。
- 深さの植物レタス種子¼インチセル当たり2-3の種子。干ばつの両方を提供するために、プラント複製されたトレー内のすべての実験的なラインは、干ばつのトライアル用のトレーを強調し、コントロール。
- 穴のないベーストレイにプラグトレーを置きます。
- 水トレイ、反転トレイやプラスチックドームでカバー。発芽は、通常は48〜72時間で起こる。発芽後はカバーを取り外し、温室にトレイを移動します。
注：このプロトコルは、成長チャンバ内で行うことができた。
2.成長と事業所ケア
- 水のトレイは、発芽後1-4週間後から必要に応じて、通常は、これは下トレイを充填し、土壌が（〜1時間）飽和になるようにすることで、週に2〜3回で長時間座って光線このような水の中では、負に植物の健康および根の発達に影響を与えることができ、干ばつ画面に影響を与え得る。
- 1.5 TSP /ガロンの割合で混合し、市販の水溶性20-20-20肥料を週1回のトレイを受精。
- セル1〜2週間ごとに1つのプラントに薄いトレイは、発芽を投稿。
3.開始乾燥ストレス
- 植物は2つのグループに4週齢の別々のトレイがあるとき。深刻な水ストレスにさらさつのグループ。同様にコントロールを骨抜きに他のトレイを使用してください。実験を通してステップ2.1のように、対照群に水を。乾燥ストレス開始時の実験の残りのためのすべてのトレイを施肥一時停止。
- 実験的な干ばつ期間は1週間にわたって行われます。乾燥ストレス試験（0日目）の最初の日に、水ですべての下のトレイを記入し、プラグトレイの土壌が、その後完全に飽和状態になるのトレイから水を排出することができます。トンの開始直前に土壌を飽和彼ストレス期間は、プラグトレー内の個々のセル間の土壌水分の任意の変動を最小限に抑えるのに役立ちます。
測定されるべきパラメータを使用した基本的な乾燥ストレス画面を実施4。
注：次の手順は、 表1は、干ばつストレスの試用期間のそれぞれの日に行われた測定のスケジュールを提供しながら、干ばつ画面の過程で記録されます3生理学的な測定値を収集する方法の概要を示します。
- 日0,2、裁判の4葉の相対水分量（RWC）を測定します。
- トレイからレタス植物をクリップし、2葉を取り除く。
- ＃9コルクボーラー（〜直径1.6cm）を使用して、各葉から3ディスクをパンチ。 1サンプルとして葉のパンチを結合します。
- リーフディスクを量り、これはRWC計算に用いる新鮮重量（FW）値であり、その後ペトリプレートにディスクを配置します。
- すべてのプレートにちょうど十分な蒸留水を追加します。OWすべてのリーフディスクをフロートする。これは、完全RWC分析用の腫れ上がった重みを収集するために、葉ディスクを水和することです。葉ディスクを室温で24時間、フロートすることを許可する。
- プレートから完全に水和した葉ディスクを外し、静かにディスクを計量する前にペーパータオルで葉ディスクの外側を乾燥させます。 RWC計算に腫れ上がった重量（TW）として、これらの重みを記録します。
- 紙のラボに置きリーフディスクを24時間55℃のインキュベーター内でワイプまたはオープンペトリ皿にろ紙ディスクとドライ。
注：紙は乾燥中に、シャーレに付着するのリーフディスクを防ぐことができます。 - ドライリーフディスクを秤量し、RWC計算のためにとして乾燥重量（DW）を記録。
- スマートとビンガム11,12によって記載されているようRWCはWeatherleyの式を用いて計算します。
RWC =（FW-DW / TW- DW）* 100
FW =生体重、TW =腫れ上がった重量、DW =乾燥重量 - 裁判における各遺伝資源及び治療のために手順を繰り返し4.1。
- 乾燥ストレス試験の1日目に一日一回初め萎凋や植物の100％が正常に4日または5、しおれているときに終了する植物を記録します。
- 回復期と成長差
- 6日目に、干ばつストレス期間を締結し、ストレスを受けた植物は裁判の回復期に入る。水と下のトレイを記入し、干ばつストレストレイはコントロールトレーとして、標準散水スケジュール、ステップ2.1を再開する前に24時間浸漬することができます。
- すべての植物が10日間回復できるようにします。
- 10日目に、干ばつストレスを投稿各植物の地上部の上方全体を収穫し、新鮮な重量を記録します。
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Representative Results
このプロトコル干ばつストレス応答の場合には、所望の実験的な特色によって集団を分離するために、大画面を行う場合には、それに応じて非常に異なっても、生成されるデータは、おそらく干ばつ耐性との間のすべての点に対して感受性強調する。 図1は、このプロトコルが期待できる結果の種類を示すグラフを含む。三つの異なるレタスタイプ（ロメインレタス（COS）、crisphead、およびバター）の代表的な品種は、示されたデータに含まれています。唯一の3レタスの種類を表すデータがここに示されているが、このプロトコルは、ほとんどのタイプ間レタスとほうれん草遺伝資源の何千ものスクリーニングの間に開発されました。レタスの3つのタイプに加えて、以前にこのプロトコルが正常に赤と緑の葉を選別し、密接に関連したレタスserriola種からの遺伝資源だけでなく、関係のないルと一緒に型レタスを食い止めるために利用された言及AFY緑の野菜のほうれん草。著者らは、実地試験のための200レタス品種の候補プールに4,000以上のレタスコレクションを狭めるためにこのプロトコルを使用して生成されたデータを使用する。
示す図1.代表的な結果のデータは、3つの生理学的測定を代表するロメインレタス（COS、ROM）、crisphead（CRSP）、及びバター（BUT）を含む3レタスタイプ、のためにこのプロトコルに含まれています。（A）植物の割合ことすべての植物が100％しおれに到達するまで1日目に開始し、試験の干ばつストレス期間の各日にしおれている、（B）葉の相対水分含量は、0日目、2日に測定される。記録され、4 -D ：干ばつストレス、-C：。起因する成長の差を示す干ばつストレス期間後の植物や10日間の回復のコントロール（C）重量干ばつストレス。エラーバーは標準偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2の代表的なトレイ及び例えば植栽図（A及びB）例トレイは、制御トレーと比較して、このプロトコルを使用して、試験の3日目の干ばつストレス応答を示す。 （CおよびD）これらのトレー図は、このプロトコルで利用される2植え付け方法を示す使用128プラグトレーを表す。トレイ（網掛け灰色）の外側のエッジが植えられますが、より急速に内部の細胞よりも乾燥することにより、エッジ·セルの性向に、実験サンプルのために利用されていないする必要があります。
| デイ | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RWC-FW | X | X | X | ||||
| 萎凋 | X | X | X | X | （X） | （X） | |
| 水を差し控える | X | ||||||
| 散水再開 | X |
干ばつストレス期間の表1.時刻表。水は、実験から源泉徴収されている葉相対含水量測定のための6新鮮なサンプルを試験の0日目に開始し、当日に履歴書を散水トレイは0日、2、4で撮影されており、植物の割合は、1日目に毎日の始まりを記録し、100まで継続していしおれ植物の％は、通常は4日目、しおれているが、5日目、あるいは6に延びていてもよい。
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Discussion
スクリーンのためのサンプル数の考慮事項。
必要なサンプル数は、この画面からのデータの所望の用途に基づくべきである。出版品質の結果が必要な場合には、各ラインから3個々の植物（3生物学的複製）を収穫し、品質統計分析のために十分なポイントを与えるために2実験の繰り返しの最小を実行することをお勧めします。所望の結果は、単に迅速に、より厳格なまたは複雑な水ストレス実験を行うために、候補遺伝資源の大きなプールを狭くする場合、以下のサンプル及び又は複製を必要とすることができる。必要なサンプル数は、植え付けの時に決定されなければならない。
トレイに土壌乾燥のレイアウトと考慮事項を植える。
1つの非常に重要な考慮事項は、プラグトレイの端にある細胞内の土壌は、内部細胞や介護よりも急速に乾燥することです唯一のトレイ内部（ 図2）から植物を収穫することにより、結果の偏りを避けるために注意すべきである。唯一の可能性が高いトレイの植栽のレイアウトに影響を与える内部の細胞から植物を収穫する。このプロトコルは3と6ユニークな遺伝資源の間に開発された画面中に制御レタス栽培品種と一緒にプラグトレーごとに植えました。専門作物に乾燥耐性についてのスクリーニングの課題の一つは、多くの場合のように、正または負のコントロールを使用しない既知のストレス耐性または感受性の遺伝資源が存在しないです。全く正または負のコントロールは、このプロトコルの開発のように利用できない場合には全ての試験を通して標準遺伝資源の使用は、各画面全体に条件の変動性のための内部統制の基本的なレベルを可能にします。植えることができ、異なる生殖質の数は、直接遺伝資源コレクションをスクリーニングすることができるが、EACに必要な植物の数によって制限される速度に貢献する時間測定は、裁判の過程で取ら。すべてレタス3〜6に、各トレイに固有の遺伝資源の数を制限することなくレタスのみ外部セルに植えられていないことを保証する各トレイ内の二つの場所に植えすることができる。別の考慮事項は、生殖質の中で成長率および植物サイズのばらつきが小さい品種を含む細胞における土壌乾燥の減少率につながる可能性があることである。これは、潜在的にわたって潜在的な干ばつに強い遺伝資源の中で表現される小さな品種の方向にバイアスの結果は、この画面から引き出すことができますが、これは観察された結果に基づいて、ケースのようには思えなかった。さらに、このプロトコルから候補遺伝資源を研究するための厳格な二次の方法論を使用すると、これらの結果を確認または論駁すべきどちらか。
萎凋の観測上の一貫性の重要性。
萎凋病のための植物のモニタリングは同じで行ってください植物ストレスの外観の小さな変動を回避するために毎日の時間は、のように枯れやすい温室ならびに気孔の概日調節に存在する温度および湿度変動による観察。また、しおれたりしないように植物をスコアリングするとき一貫するようにしてください。複数の個人が一貫した結果を保証するために画面を実行する場合のスコアリング萎凋で一連のガイドラインを確立することは特に重要です。このプロトコルのために使用される閾値は、植物の全ての葉がしおれていると植物を獲得するためにしおれされなければならないです。
測定されたパラメータの選択。
このプロトコルで測定されたパラメータは、最小の利用可能な労働力を利用する半ハイスループットシステムの測定の適応性と共に、水ストレスを同定におけるそれらの有用性に基づいて選択した。他の多くの測定は、干ばつストレス（ 例えば 、光合成活動を識別するのに非常に役に立ちます、根の成長、気孔コンダクタンス...）、および実行される画面の性質に基づいて（ すなわち、使用される遺伝資源の数、反復数、所望のスループットレート...）他のパラメータは、簡単にこの画面に組み込むことができる。
プロトコル結果の利用に関するコメント。
USDAのコレクションは、非現実的なすべての遺伝資源を取り入れたフィールドトライアルを作る数である4,000以上の個々のレタスの遺伝資源が含まれています。このプロトコルは、潜在的な乾燥耐性のためのUSDAのコレクションをスクリーニングするために、研究者の非常に小さな数（1-2個人）を可能にするという唯一の目的で開発されました。これらのメソッドを使用することによりUSDA収集がより密接に干ばつストレス状態を再現することができ、フィールド試験で使用された200種類に狭めた。このプロトコルは、フィールドトリアで使用するために40に400以上のほうれん草の遺伝資源の人口を狭くするために使用されたLS。一人でこのプロトコルは、フィールドの水ストレス条件下での耐久性のある干ばつ耐性が含まれている確実性の遺伝資源の高い識別するのに十分考慮されるべきではなく、単に急速に水分欠乏条件下での潜在的なストレス耐性をスクリーニングするためのツールとして役立つことができる遺伝資源を大量に利用する迅速かつ効率的なスクリーン。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
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