Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

추 잠재적 가뭄 내성 세미 높은 처리량 검열 ( Published: April 17, 2015 doi: 10.3791/52492
Automatic Translation
1, 1
1Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Protocol

1. 심기

  1. 플러그 트레이 채우기 (128 셀; 3cm 사각형 셀 28 X 54cm와 5cm 깊이) 플러그 토양 믹스. 세포의 균일 한 충전에 도움이 빈 플러그 트레이를 사용하여 각 트레이에 흙을 압축합니다.
  2. 식물 상추 씨앗 ¼ 깊이 셀 당 2 ~ 3 씨앗 인치. 식물 복제 트레이에있는 모든 실험 선은 가뭄 모두 스트레스와 가뭄 재판 제어 트레이를 제공합니다.
  3. 구멍이없는 바닥 판에 플러그 트레이를 놓습니다.
  4. 반전 트레이 또는 플라스틱 돔 물 트레이 커버. 발아는 일반적으로 48 ~ 72 시간에 발생합니다. 발아 후 덮개를 분리하고 온실에 트레이를 이동합니다.
    참고 :이 프로토콜은 또한 성장 챔버에서 수행 될 수있다.

2. 성장과 식물 케어

  1. 발아 후 1~4주 필요에 따라 물 트레이, 일반적으로이 땅을 하단 트레이를 채우고 수 있도록하여, 2 ~ 3 회 (매주)는 오랜 시간 동안 앉아 (~ 1 시간) 광선 포화되기 위해이 같은 물에서의 부정적인 식물의 건강과 루트 개발에 영향을 미칠 수 있으며, 가뭄 화면에 영향을 줄 수 있습니다.
  2. 1.5 작은 술 / 여자의 비율로 혼합 상업적 가용성 20-20-20 비료와 함께 매주 한 번 용지함을 기름지게.
  3. 세포 1-2주 당 하나의 공장 얇은 트레이는 발아를 게시합니다.

3. 시작 가뭄 스트레스

  1. 식물은 2 그룹으로 사주 된 별도의 트레이는 경우. 심각한 물 부족에 따라 하나의 그룹. 뿐만 아니라 컨트롤을 물을 다른 용지함을 사용합니다. 실험을하는 단계 2.1에서와 같이 대조군 물. 가뭄의 시작에서 실험의 나머지 부분에 대한 모든 트레이 시비 일시 중단합니다.
  2. 실험 가뭄 1 주일 기간에 걸쳐 발생한다. 가뭄 스트레스 시험 (0 일)의 첫 날에 물과 그 이하의 모든 트레이를 작성하고 플러그 트레이에 토양이 다음 완전히 포화 될 트레이에서 물을 배수 할 수 있습니다. t의 개시 직전에 토양을 포화그는 스트레스 기간은 플러그 트레이에 개별 셀 사이의 토양 수분에 어떤 변화를 최소화하는 데 도움이 될 것입니다.

매개 변수와 기본 가뭄 스트레스 화면을 실시 4. 측정한다

주 : 다음 단계는 표 1은 가뭄 스트레스 시험 기간의 각각의 날에 측정 된 값의 일정을 제공한다 가뭄 화면의 과정을 통해 기록되는 세 가지 생리 학적 측정을 수집하는 방법을 설명합니다.

  1. 일 0, 2, 재판의 4 잎 상대 수분 함량 (RWC)을 측정한다.
    1. 트레이에서 양상추 식물 클립 및 2 잎을 제거합니다.
    2. # 9 코르크 천공 충 (~ 1.6 cm 직경)를 사용하여 각각의 잎에서 3 디스크를 펀치. 하나의 샘플로 잎 펀치를 결합합니다.
    3. 잎 디스크를 달아이 RWC 계산에 사용 생체중 (FW) 값이고, 다음 페트리 접시에 디스크를 배치했다.
    4. 모든 판에 충분한 증류수를 추가아야 모든 잎 디스크는 떠 있습니다. 이것은 완전히 RWC 분석을 위해 과장된 가중치를 수집하기 위해 잎 디스크를 수화하는 것입니다. 잎 디스크는 실온에서 24 시간 동안 떠있게 할 수 있습니다.
    5. 플레이트에서 이제 완전히 수화 잎 디스크를 제거하고 부드럽게 디스크를 계량하기 전에 종이 타월로 잎 디스크의 외부를 건조. RWC 계산을위한 과장된 무게 (TW) 이러한 가중치를 기록합니다.
    6. 종이 실험실에 배치 잎 디스크는 24 시간 동안 55 ° C에서 인큐베이터에서 닦아 또는 페트리 접시에 여과지 디스크 및 건조.
      참고 : 용지가 건조하는 동안 배양 접시에 부착 잎 디스크를 방지 할 수 있습니다.
    7. 마른 잎 디스크와 RWC 계산을위한 기록 건조 무게 (DW)를 달아.
    8. 스마트 빙햄 (11, 12)에 의해 설명 된 RWC는 Weatherley의 공식을 사용하여 계산합니다.
      RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
      FW 신선한 무게, TW = 과장된 무게, DW는 = 건조 중량을 =
    9. 시험의 각 생식과 치료 단계를 반복 4.1.
  2. 기록 식물 윌 가뭄 스트레스 시험의 1 일 및 식물의 100 %가 일반적으로 하루 4, 5, 시들 때 종료에 회 시작입니다.
  3. 복구 단계 및 성장 차동
    1. 하루 6 일, 가뭄 스트레스 기간을 체결하고 스트레스 식물은 재판의 회복 단계를 입력합니다. 제어 트레이로, 2.1 단계, 물 아래 트레이를 입력하고 가뭄 스트레스 트레이 표준 물 일정을 다시 시작하기 전에 24 시간 동안 흡수 할 수 있습니다.
    2. 모든 식물 10 일 동안 복구 할 수 있습니다.
    3. 십일에서 포스트 가뭄 스트레스 각 식물의 지상 부분 위의 전체를 수확하고 신선한 무게를 기록한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

이 프로토콜 가뭄 스트레스 반응의 경우에, 원하는 실험 형질하여 모집단을 분리하기 위해 대형 스크린을 수행 할 때, 대응 매우까지 변화한다 생성 데이터 가능성 가뭄 내성 사이의 모든 지점에 민감 강조한다. 그림 1은이 프로토콜에서 예상 할 수있는 결과의 유형을 나타내는 그래프가 포함되어 있습니다. 세 가지 다른 양상추 유형 (로메인 (COS), crisphead 및 Butterhead 상)의 대표 품종​​은 표시된 데이터에 포함되어 있습니다. 만 세 상추 유형을 나타내는 데이터가 여기에 표시되어 있지만이 프로토콜은 대부분의 유형에서 양상추와 시금치 생식의 수천의 심사 중에 개발되었습니다. 상추의 세 가지 유형 외에도 이전에이 프로토콜이 성공적으로 제작 관련이없는 것으로도 밀접한 관련이 왕 고들빼기 속 serriola 종에서 생식과 함께 유형 양상추 빨간색과 녹색 잎을 화면과 줄기를 사용 하였다 언급afy 녹색 야채 시금치. 저자는 현장 시험 200 상추 품종의 후보 풀에 4,000의 양상추 수집 범위를 좁힐이 프로토콜을 사용하여 생성 된 데이터를 사용했다.

그림 1
그림 그림 1. 대표 결과 데이터는 세 가지 생리 학적 측정의 대표 로메인 (COS, ROM), crisphead (CRSP) 및 Butterhead 상 (BUT) 등 3 상추 유형,이 프로토콜에 포함되어 있습니다. (A) 식물의 비율이 모든 식물이 100 %가 시들에 도달 할 때까지 1 일에 시작, 재판의 가뭄 스트레스 기간 하루에 시들된다, (B) 잎 상대 수분 함량이 일 0, 2에서 측정됩니다. 기록, 4 -D : 가뭄 스트레스, -C :.로 인해 성장 차이를 보여주는 가뭄 스트레스 기간 이후 식물과 십일 복구 제어 (C) 무게가뭄 스트레스. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 대표 트레이 예를 심기도 (A와 B) 예 트레이는 제어 트레이에 비해이 프로토콜을 사용하여 시험의 3 일에 가뭄 스트레스 반응을 보여줍니다. (C와 D)이 트레이 다이어그램은이 프로토콜에서 사용이 재배 방법을 보여주는 데 사용되는 128 플러그 트레이를 나타냅니다. 트레이 (회색 셀을 회색)의 바깥 쪽 가장자리는 심어하지만, 더 내부 세포보다 빠르게 건조 인해 셀 가장자리 성향으로, 실험 샘플을 위해 이용되지 않을 것이다.

하루 0 (1) 이 3 4 (5) (6)
RWC-FW 엑스 엑스 엑스
장승 병 엑스 엑스 엑스 엑스 (X) (X)
물을 보류 엑스
물을 다시 시작 엑스

가뭄 스트레스 기간 표 1. 시간표. 실험에서 원천 징수되는 물잎 상대 수분 함량 측정을위한 6 신선한 샘플을 재판 0 일에 시작하여 하루에 이력서를 물 트레이는 일 0, 2, 4에 촬영하고, 식물의 비율은 1 일에 매일 시작을 기록하고 100까지 계속되고 시들 식물의 %는 일반적으로 4 일, 시들되지만, 5 일 또는 6으로 연장 될 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

화면 샘플 수의 고려 사항.

필요한 샘플의 수는이 화면에서 희망 데이터에 기초하여 이용되어야한다. 공개 품질 결과가 요구되는 경우에는 각 행에서 세 개별 식물 (3 생물학적 복제물)을 수확 및 품질 통계 분석에 적절한 포인트를주고 2 회 반복 실험의 최소값을 수행하도록 권장한다. 원하는 결과 인 경우 단순히 빨리 더 엄격한 복잡한 물 스트레스 실험, 적은 샘플을 수행하기 위해 후보 유전자 원의 큰 수영장을 축소하고 또는 반복 실험이 필요할 수 있습니다. 필요한 샘플 수는 파종시에 결정되어야한다.

심기 레이아웃과 트레이 토양 건조의 고려 사항.

하나의 매우 중요한 고려 사항은 플러그 트레이의 가장자리에 세포에서 토양이 내부 세포 및 관리에보다 더 빠르게 건조 것입니다만 트레이 내부 (그림 2)에서 식물을 수확하여 결과에 편견을 방지하기 위해주의해야한다. 만 가능성이 트레이의 심기 레이아웃에 영향을 미칠 것이다 내부 세포로부터 식물을 수확. 3, 6 고유의 유전자 원이 제어 상추 품종과 함께 플러그 트레이 당 심은 사이에이 프로토콜이 개발되는 화면 중. 특수 작물에 가뭄 내성 선별 검사의 과제 중 하나는 종종 양 또는 음의 컨트롤을 사용하여 더 알고 스트레스 내성과 감수성 유전자 원이 존재하지 않습니다. 어떤 양 또는 음의 컨트롤이 프로토콜의 개발로 사용할 수없는 경우 모든 시험 전반에 걸쳐 표준 생식의 사용 각 화면에 걸쳐 조건의 변화에​​ 대한 내부 통제의 기본적인 수준 수 있습니다. 직접 생식 컬렉션 스크리닝 할 수있는 속도에 기여할 심은 수 있지만 EAC 필요한 식물의 수에 의해 제한되는 다른 유전자 원의 개수시간 측정은 재판 과정에서 촬영. 모든 추 세 사이의 6 각 트레이에 고유 한 유전자 원의 수를 제한함으로써 더 양상추 만 외부 세포에 심어되지 않았 음을 보장 각 트레이 내의 두 위치에 심어 할 수 있습니다. 또 다른 고려 사항은 생식 사이 성장율 및 플랜트 규모 가변성 작은 ​​종류를 함유하는 세포에서 토양 건조 속도의 감소로 이어질 수 있다는 점이다. 이 수 가능성이 화면에서 가져온 잠재적 인 가뭄에 강한 유전자 원 중에서 표현하지만,이 관찰 된 결과에 따라 경우 될 것 같지 않았다 위에있는 작은 품종의 방향으로 바이어스 결과. 또한,이 프로토콜에서 후보 유전자 원을 연구하는 엄격한 보조 방법의 사용을 확인하거나 결과를 반박해야 하나.

장승의 관찰에 일관성의 중요성.

장승에 대한 식물의 모니터링은 같은에서 수행되어야한다식물 스트레스의 외관에서 작은 변동을 피하기 위해 매일 시간은, 같은 재선충 가능성뿐만 아니라, 온실 기공의 주기성 조절에서 현재 온도와 습도 변동에 의한 관찰했다. 또한, 시들 여부로 식물을 득점 할 때 일치해야합니다. 다수의 개인들이 일관된 결과를 보장하기 위해 화면을 수행 할 경우에 채점 시들음병 가이드 라인을 확립하는 것은 특히 중요하다. 이 프로토콜에 사용되는 임계 값은 식물의 모든 잎이 시들 것으로 식물의 점수에 시들해야합니다.

파라미터의 선택은 측정.

이 프로토콜에서 측정 가능한 파라미터는 최소의 인력을 이용한 세미 고 스루풋 시스템으로 측정 적응성과 함께 물 스트레스를 식별 유용성에 기초하여 선택되었다. 다른 많은 측정 (가뭄 스트레스를 식별 예., 광합성 활동에 매우 도움이 될 수 있습니다루트 성장 기공 컨덕턴스 ...), 및 수행 될 화면의 특성에 기초하여 (즉, 유전자 원의 수는, 다른 파라미터는 쉽게 화면에 통합 될 수있다), 회 반복 수, 원하는 처리량 비율 ... 사용.

프로토콜 결과의 사용에 대한 댓글.

USDA 모음은 모든 생식 질 비현실적 통합 현장 시험을 만드는 수는 4,000 개인 상추 생식 이상이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 잠재적 인 가뭄 내성에 대한 USDA 컬렉션을 화면 연구자의 매우 작은 숫자 (1-2 개인)을 허용하는 고독한 목적으로 개발되었다. 이러한 방법의 사용을 통해 USDA 수집은 더 밀접 가뭄 스트레스 조건을 복제 할 수있는 현장 시험에서 사용 된 200 종류로 좁혀졌다. 이 프로토콜은 또한 필드 트리아에 사용하기 위해 (40)에 400 시금치 생식의 인구를 축소하는 데 사용LS. 혼자이 프로토콜은 필드 물 스트레스 조건에서 내구성이 가뭄에 내성을 포함 확신 생식 질 높은 수준의 식별이 충분히 고려되지해야하지만, 단순히 빠르게 물 부족 조건에서 잠재적 인 스트레스 내성을 선별하는 도구로 역할을 할 수 생식의 큰 숫자를 사용하는 신속하고 효율적인 화면.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
plug tray 128 T.O. Plastics
Hummert International		 11-8595-1 Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials.
lower tray (Display tray) T.O. Plastics
Hummert International		 11-3305-1
plug/planting mix (Sunshine Mix #5) Sunshine
Hummert International		 10-0467-1 A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop.  Sunshine mix #4 was used in spinach trials.
fertilizer (20-20-20) Jack's: Professional water-soluble fertilizer
Hummert International		 07-5915-1 Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
  2. Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
  3. Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
  4. Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
  5. Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
  6. Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
  7. Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
  8. Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
  9. Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
  10. Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
  11. Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
  12. Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).

Tags

환경 과학 문제 98 상추, 가뭄 물 스트레스 비 생물 적 스트레스 상대 수분 함량
추 잠재적 가뭄 내성 세미 높은 처리량 검열 (<em&gt; 왕 고들빼기 속 sativa로구나</em&gt;) 유전자 원의 컬렉션
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knepper, C., Mou, B. Semi-High… More

Knepper, C., Mou, B. Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections. J. Vis. Exp. (98), e52492, doi:10.3791/52492 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter