Protocol
1. Plantio
- Preencha bandejas plugue (128 cela; 28 x 54 cm, com células 3 centímetros quadrados e 5 cm de profundidade) com mix plugue solo. Para ajudar no preenchimento uniforme de células compactar solo em cada bandeja usando uma bandeja de plugue vazio.
- Sementes de alface Planta ¼ de polegada de profundidade 2-3 sementes por célula. Planta de todas as linhas experimentais em bandejas replicadas para fornecer tanto uma seca estressado e bandejas de controle para o julgamento de seca.
- Coloque as bandejas de plug em uma bandeja de base sem buracos.
- Bandejas de água e cubra com bandeja invertida ou cúpula de plástico. A germinação ocorre normalmente em 48-72 h. Após a germinação retire a tampa e mover bandejas em estufa.
NOTA: Este protocolo também pode ser realizada em câmaras de crescimento.
2. Crescimento e plantas cuidados
- Bandejas de água, conforme necessário 1-4 semanas após a germinação, normalmente este é 2-3 vezes por semana, através do preenchimento de bandeja inferior e permitindo que o solo a ficar saturadas (~ 1 hr) raios de se sentar por período prolongados na água, pois isso pode impactar negativamente a saúde das plantas e desenvolvimento radicular e pode afetar a tela de seca.
- Fertilize bandejas uma vez por semana com um solúvel 20-20-20 fertilizante comercial misturado a uma taxa de 1,5 colher de chá / gal.
- Bandejas fina para uma planta por celulares 1-2 semanas após a germinação.
3. Início de estresse hídrico
- Quando as plantas são quatro semanas bandejas separadas em 2 grupos. Assunto um grupo ao estresse hídrico severo. Use as outras bandejas, bem regadas controles. Regue o grupo controle como no passo 2.1 durante todo o experimento. No início do estresse seca suspender fertilizar todas as bandejas para o resto da experiência.
- O período de seca experimental ocorre ao longo de uma semana. No dia inicial do julgamento de estresse hídrico (Dia 0) preencher todas as bandejas inferiores com água e permitir que o solo nas bandejas de plug para se tornar totalmente saturado, em seguida, drenar a água da bandeja. Saturando o solo imediatamente antes do início do tele período de estresse vai ajudar a minimizar qualquer variação na umidade do solo entre as células individuais nas bandejas de ficha.
4. Realização da tela estresse hídrico básico com parâmetros a serem medidos
NOTA: As seguintes etapas descrevem como coletar as três medidas fisiológicas que serão registrados ao longo de tela a seca enquanto que a Tabela 1 apresenta um cronograma das medidas tomadas em cada dia do período experimental seca-stress.
- Medir a Folha Relativa conteúdo de água (RWC) nos dias 0, 2, 4 do julgamento.
- Clipe de uma planta alface da bandeja e remover 2 folhas.
- Perfure 3 discos de cada folha usando uma broca de cortiça # 9 (de ~ 1,6 cm de diâmetro). Combine socos folha como uma amostra.
- Pese os discos de folhas, este é o valor do peso fresco (FW) utilizado para o cálculo RWC, em seguida, coloque os discos em uma placa de petri.
- Adicione água destilada apenas o suficiente para a placa para todosow todos os discos de folha a flutuar. Isto é para hidratar completamente os discos de folha para reunir pesos túrgidas para análise RWC. Permitir que os discos de folha para flutuar durante 24 horas à temperatura ambiente.
- Remover os discos foliares agora totalmente hidratados a partir das placas e secar suavemente a superfície exterior dos discos de folha com toalhas de papel antes da pesagem, os discos. Grave estes pesos como peso bombástico (TW) para o cálculo RWC.
- Discos de folha no lugar um laboratório de papel limpe ou disco de papel de filtro numa placa de Petri aberta e seco em estufa a 55 ° C durante 24 horas.
NOTA: O papel impede que os discos de folha de aderir à placa de Petri durante a secagem. - Pesar discos de folha seca e registre pesos como seca (MS) para o cálculo da RWC.
- Calcule RWC usando a fórmula de Weatherley como descrito por Smart e Bingham 11,12.
RWC = (FW-DW / TWDw) * 100
FW = peso fresco, TW = peso bombástico, DW = peso seco - Repita o passo 4.1 para cada germoplasma e tratamento no julgamento.
- Grave a planta murcha início uma vez por dia no 1º dia do julgamento estresse da seca e termina quando 100% das plantas estão murchas, normalmente 4 ou 5 dias.
- Fase de recuperação e diferencial de crescimento
- No dia 6, concluir o período da seca-stress e as plantas estressadas entrar na fase de recuperação do julgamento. Encha as bandejas inferiores com água e deixe as bandejas sob estresse de molho por 24 horas antes de retomar o plano de rega padrão, passo 2.1, como as bandejas de controle.
- Permitir que todas as plantas recuperar durante 10 dias.
- Aos 10 dias após a seca-stress colher toda a parte acima do solo de cada planta e registrar o peso fresco.
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Representative Results
Ao realizar uma tela grande, a fim de segregar uma população experimental pelo traço desejado, no caso de este protocolo de resposta seca-stress, os dados gerados será correspondentemente ser variada de muito susceptível a salientar provável tolerante a secas e todos os pontos entre eles. A Figura 1 contém gráficos que representam o tipo de resultado que pode ser esperado a partir deste protocolo. Cultivares representativos de três tipos de alface (alface romana (cos), alface crespa, e Butterhead) estão incluídos nos dados apresentados. Embora os dados que representam apenas três tipos de alface são mostrados aqui este protocolo foi desenvolvido durante a triagem de milhares de alface e espinafres germoplasma na maioria dos tipos. Além dos três tipos de alface anteriormente mencionado este protocolo foi utilizado com sucesso para a tela de folha vermelha e verde e haste tipo alface juntamente com germoplasma das espécies de Lactuca serriola estreitamente relacionadas, bem como a não relacionado leafy espinafre vegetal verde. Os autores utilizaram dados gerados usando esse protocolo para estreitar uma coleção de mais de 4.000 alface a um grupo de candidatos de 200 variedades de alface para ensaios de campo.
Figura 1. Resultados representante Os dados mostrados são representativos das três medições fisiológicas incluídos neste protocolo para três tipos de alface, incluindo alface (cos, ROM), crespa (CRSP), e butterhead (MAS). (A) A percentagem de plantas que estão murchas em cada dia do período de seca-stress do julgamento, começando no dia 1, é gravado até que todas as plantas atingem 100% murchas. (B) Folha teor relativo de água é medido nos dias 0, 2 e 4. D : seca-stress, -C.: controle (C) Peso das plantas após o período de seca-stress e recuperação de 10 dias, mostrando diferencial de crescimento, devido àseca-stress. As barras de erro representam o desvio padrão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. bandejas representativos e exemplo o plantio de diagramas (A e B) bandejas de exemplo mostram a resposta seca-stress no dia 3 de um ensaio utilizando este protocolo, em comparação com as bandejas de controle. (C e D) Esses diagramas bandeja representam os 128 bandejas de ficha utilizados mostrando dois métodos de plantio utilizados neste protocolo. As bordas exteriores das bandejas (cinzento células sombreadas) deve ser plantada, mas não utilizados para amostras experimentais, devido à propensão das células ponta para secar mais rapidamente do que as células interiores.
| Dia | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RWC-FW | X | X | X | ||||
| Wilt | X | X | X | X | (X) | (X) | |
| Reter água | X | ||||||
| Retomar a rega | X |
Tabela 1. Horários do período de seca-stress. A água é retido do experimentalbandejas com início no dia 0 do julgamento e rega recomeça no dia 6. amostras frescas para a medição do teor relativo de água folha são tomadas nos dias 0, 2, 4, e a percentagem de plantas murchas são registrados por dia começando no dia 1 e continuando até 100 % das plantas estão murchas, normalmente dia 4, mas pode estender-se ao dia 5 ou mesmo 6.
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Discussion
Considerações do número da amostra para a tela.
O número de amostras necessárias deve ser baseada na utilização desejada dos dados a partir deste ecrã. Se os resultados de qualidade de publicação são desejados, recomenda-se colher 3 plantas individuais (3 repetições biológicas) de cada linha e realizar um mínimo de 2 repetições experimentais para dar pontos adequados para a análise estatística de qualidade. Se o resultado desejado é simplesmente para estreitar rapidamente um grande conjunto de candidato germoplasma, a fim de realizar experimentos água-stress mais rigorosos ou menos complexas, e amostras ou repetições pode ser necessária. O número de amostras exigidas deve ser decidido no momento do plantio.
Layout de Plantio e considerações de secagem do solo em bandejas.
Uma consideração muito importante é que o solo em células no rebordo da gaveta do bujão vai secar mais rapidamente do que as células interiores e cuidadosdevem ser tomadas para evitar distorções na resultados por apenas colhendo plantas a partir do interior da bandeja (Figura 2). Apenas as plantas da colheita a partir das células interiores deverá influenciar a disposição do tabuleiro de plantação. Durante a tela em que este protocolo foi desenvolvido entre 3 e 6 de germoplasma original foi plantada por bandeja ficha juntamente com uma cultivar controle alface. Um dos desafios de triagem para tolerância à seca em uma cultura especialidade é muitas vezes não existe estresse saber germoplasma tolerante ou suscetíveis a usar controles como positivos ou negativos. Quando nenhum controlo positivo ou negativo está disponível como no desenvolvimento deste protocolo a utilização de um padrão ao longo de germoplasma todos os ensaios permite um nível de base de controlo interno para a variabilidade de condições ao longo de cada tela. O número de germoplasma diferente, que pode ser plantada irá contribuir directamente para a velocidade a que uma colecção de germoplasma podem ser rastreados, mas é limitado pelo número de plantas necessários para each medida tomada durante o curso do julgamento. Limitando o número de germoplasma único em cada bandeja de entre 3 e 6 todos alface podem ser plantadas em dois locais dentro de cada tabuleiro assegurando que nenhum alface é plantada em apenas células exteriores. Outra consideração é que a variabilidade da taxa de crescimento e tamanho da planta entre germoplasma pode levar à redução das taxas de secagem do solo em células que contêm pequenas variedades. Isso poderia distorcer os resultados na direção de pequenas variedades sendo sobre-representadas entre potencial tolerante à seca germoplasma puxou a partir desta tela, mas isso não parece ser o caso com base nos resultados observados. Além disso, o uso de metodologias rigorosas secundárias para estudar o germoplasma candidato deste protocolo deve confirmar ou refutar esses resultados.
A importância da consistência na observação de murcha.
O monitoramento de plantas para murcha deve ser realizada ao mesmotempo diário para evitar pequenas flutuações na aparência do estresse das plantas, observada como murcha, provavelmente causada por flutuações de temperatura e umidade presentes em uma estufa, bem como a regulação circadiana dos estômatos. Além disso, certifique-se de ser consistente quando marcou como plantas murchas ou não. O estabelecimento de um conjunto de orientações na pontuação murcha é especialmente importante se vários indivíduos estará se apresentando na tela para garantir resultados consistentes. O limite utilizado para este protocolo é todas as folhas da planta deve ser murchas para marcar a planta como sendo murchas.
Selecção dos parâmetros medidos.
Os parâmetros medidos neste protocolo foram escolhidos com base em sua utilidade na identificação de estresse hídrico, juntamente com a capacidade de adaptação das medidas a um sistema de semi-alto rendimento, utilizando o mínimo de trabalho disponível. Muitas outras medidas podem ser muito úteis na identificação de seca-stress (eg., Atividade fotossintética, O crescimento da raiz, a condutância estomática ...), e com base na natureza da tela que vai ser executada (ou seja, o número de germoplasma utilizado, o número de repetições, a velocidade de transferência desejada ...) de outros parâmetros podem ser facilmente incorporados neste ecrã.
Comentários sobre a utilização dos resultados do protocolo.
As coleções do USDA contém mais de 4.000 germoplasma alface indivíduo que é um número que faz testes de campo que incorporam todos germoplasma impraticável. Este protocolo foi desenvolvido com o objetivo de permitir que um solitário número muito pequeno de pesquisadores (1-2 indivíduos) para rastrear as coleções do USDA para tolerância à seca em potencial. Através da utilização desses métodos a coleção USDA foi reduzido para 200 variedades que foram então utilizados em ensaios de campo que podem se replicar mais de perto as condições de seca-stress. Este protocolo foi também utilizada para restringir uma população de mais de 400 espinafre germoplasma a 40 para uso no campo trials. Este protocolo sozinho não deve ser considerada suficiente para identificar-se com um alto grau de certeza de germoplasma que contém durável tolerância à seca em condições de campo água-stress, mas pode simplesmente servir como uma ferramenta para rastrear rapidamente a tolerância ao estresse potencial em condições de déficit hídrico em um rastreio rápido e eficiente, utilizando um grande número de germoplasma.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
