Protocol
1. Plantering
- Fyll plug brickor (128 cell, 28 x 54 cm med celler 3 cm fyrkantiga och 5 cm djup) med plugg jord mix. För att underlätta en enhetlig fyllning av celler komprimera jord i varje magasin med hjälp av en tomt plug facket.
- Växt sallad frö ¼ tum på djupet 2-3 frön per cell. Plantera alla experimentella linjer i replike brickor för att ge både torka stressad och kontroll fack för rättegången torkan.
- Placera plug brickor i en bas fack utan hål.
- Vatten brickor och lock med inverterad bricka eller plastkupol. Groning sker normalt i 48-72 timmar. Efter groning ta bort locket och flytta brickor i växthus.
NOTERA: Detta protokoll skulle även kunna utföras i tillväxtkammare.
2. Tillväxt och växt Care
- Vatten brickor som behövs 1-4 veckor efter groning, detta är normalt 2-3 gånger i veckan, genom att fylla nedre facket och låta marken bli mättad (~ 1 timme) strålar att sitta för längre tidsi vatten eftersom detta kan inverka negativt växtskydd och rotutveckling och kan påverka skärmen torkan.
- Gödsla brickor gång i veckan med en kommersiell löslig 20-20-20 gödnings blandas med en hastighet av 1,5 tsk / gal.
- Tunna brickor till en planta per cell 1-2 veckor efter groning.
3. Initiera Torka Stress
- När plantorna är fyra veckor gamla separata fack i 2 grupper. Angående en grupp till svår vattenstress. Använd de andra facken samt vattnas kontroller. Vattna kontrollgruppen som i steg 2.1 under hela experimentet. Vid initieringen av torkstress suspend gödsling alla magasin för återstoden av experimentet.
- Den experimentella torka perioden sker över en vecka. På den första dagen av tork rättegången (dag 0) fyller alla lägre fack med vatten och låt jorden i stickfacken för att bli helt mättad låt rinna vatten från facken. Mättar marken omedelbart före initieringen av tHan stressen perioden kommer att bidra till att minimera eventuella variationer i markfuktighet mellan enskilda celler i plug magasinen.
4. Genomföra grund Torka Stress skärmen med parametrar som skall mätas
OBS: I det följande beskrivs hur man samlar de tre fysiologiska mätningar som kommer att registreras under loppet av skärmen torkan medan tabell 1 ger en tidsplan för de mätningar som gjorts på varje dag av torkan-stress prövotid.
- Mät Leaf Relativ Vattenhalt (RWC) på dag 0, 2, 4 av rättegången.
- Clip en salladsväxt ur facket och ta bort 2 blad.
- Punch 3 skivor från varje blad med en # 9 korkborr (~ 1,6 cm i diameter). Kombinera blad stansar som ett prov.
- Väg bladskivor, är detta den färskvikt (FW) värde som används för RWC beräkning, sedan placera skivorna i en petriplatta.
- Lägg bara tillräckligt Destillerat vatten till plattan för allaow alla bladskivor att flyta. Detta för att till fullo återfukta bladskivorna för att samla svulstiga vikter för RWC analys. Tillåt bladskivorna att flyta under 24 h vid RT.
- Avlägsna de nu fullt hydratiserade bladskivor från plattorna och försiktigt torka utsidan av bladskivorna med pappershanddukar före vägning skivorna. Spela dessa vikter som turgid vikt (TW) för RWC beräkningen.
- Placera bladskivorna på ett papper labb torka eller filterpappersskiva i en öppen petriskål och torka i inkubator vid 55 ° C under 24 h.
OBS: Det papper förhindrar bladskivorna från att vidhäfta vid petriskål under torkning. - Väg torra bladskivor och rekord som torrvikt (DW) för RWC beräkning.
- Beräkna RWC använder Weatherley formel som beskrivs av Smart och Bingham 11,12.
RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
FW = färskvikt, TW = svulstiga vikt, DW = torrvikt - Upprepa steg 4,1 för varje arvsmassa och behandling i rättegången.
- Spela växten vissnar gång dagligen början på dag 1 av tork rättegången och slutar när 100% av plantorna vissnat, normalt dagen 4 eller 5.
- Återhämtningsfas och tillväxt differential
- På dag 6, avslutar torkan-stress perioden och de stressade växterna in i återhämtningsfasen av rättegången. Fyll de nedre facken med vatten och låta torka stressade brickor i blöt i 24 timmar innan återuppta standard vattning schema, steg 2,1, eftersom kontrollfacken.
- Låt alla växter att återhämta sig i 10 dagar.
- Vid 10 dagar efter torka-stress fånga hela den ovan jord delen av varje växt och registrera den färska vikten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När du utför en stor skärm för att segregera en population av den önskade experimentella drag, i fallet med detta protokoll torka stress, de data som genereras kommer motsvarande varieras från mycket betona mottagliga för troligt torka toleranta och allt däremellan. Figur 1 innehåller grafer som representerar den typ av resultat som kan förväntas av detta protokoll. Representativa sorter av tre olika salladstyper (roman (COS), crisphead, och butter) ingår i de data som visas. Medan data som representerar endast tre salladstyper Här visas detta protokoll utvecklades under screening av tusentals sallat och spenat arvsmassa i de flesta typer. Förutom de tre typer av sallad tidigare nämnts här protokollet framgångsrikt används för att screena rött och grönt blad och stjälk typ sallad tillsammans med arvsmassa från närbesläktade Lactuca serriola arter samt orelaterade leafy gröna grönsaker spenat. Författarna använde data som genereras med hjälp av detta protokoll för att begränsa en sallad samling av över 4000 till en kandidat pool av 200 sallads sorter för fältförsök.
Figur 1. Representativa resultat visas information representativ för de tre fysiologiska mätningar som ingår i detta protokoll för tre salladstyper, inklusive roman (cos, ROM), crisphead (CRSP), och butter (BUT). (A) Andelen plantor som är vissnat på varje dag av perioden av rättegången torka stress, med start på dag 1, registreras förrän alla växter når 100% vissnat. (B) Leaf relativa vatteninnehåll mäts på dag 0, 2, och 4. -D : torka-stress, -C:. kontroll (C) Vikt av växter efter torka-stress perioden och 10 dagars återhämtning visar tillväxtskillnaden på grund avtorka-stress. Felstaplar representerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa brickor och exempel plantera diagram (A och B) Exempel brickor visar torkan-stress på dag 3 i en studie med detta protokoll jämfört med kontrollfacken. (C och D) Dessa brickdiagram representerar de 128 plug brickor som används visar två planteringsmetoder som används i detta protokoll. De yttre kanterna av brickorna (grå skuggade celler) ska planteras, men inte utnyttjas för experimentprover, på grund av benägenheten hos kantcellerna att torka snabbare än inre cellerna.
| Dag | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RWC-FW | X | X | X | ||||
| Vissnar | X | X | X | X | (X) | (X) | |
| Undanhålla vatten | X | ||||||
| Återuppta vattning | X |
Tabell 1. Tidsplan för torka-stress period. Vatten undanhöll den experimentellabrickor som börjar den dag 0 av rättegången och vattning återupptas på dag 6. Färska prover för mätning blad relativa vatteninnehåll tas på dag 0, 2, 4, och andelen plantor vissnade registreras dagligen början på dag 1 och fortsätter fram till 100 % av växter vissnat, normalt dagen 4, men kan sträcka sig till dag 5 eller till och med 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Överväganden av provnummer för skärmen.
Antalet prover som behövs bör baseras på den önskade användningen av data från den här skärmen. Om publicering kvalitetsresultat önskas rekommenderas att skörda 3 enskilda växter (3 biologiska replikat) från varje linje och utföra minst 2 experimentella replikat för att ge tillräckliga poäng för kvalitet statistisk analys. Om det önskade resultatet är helt enkelt att snabbt minska en stor pool av kandidatarvsmassa för att utföra strängare eller komplexa vatten-stress experiment, mindre prover och eller replikat kan vara nödvändigt. Antalet prover som krävs skall beslutas vid tiden för plantering.
Plantering layout och överväganden om mark torkning i magasinen.
En mycket viktig faktor är att jorden i celler på kanten av pluggen facket torkar snabbare än invändiga celler och omsorgbör vidtas för att undvika en snedvridning i resultatet genom att endast skörda växter från facket interiör (Figur 2). Endast skörda växter från de inre cellerna kommer sannolikt att påverka plantering layout facket. Under skärmen där detta protokoll utvecklades mellan 3 och 6 unika arvsmassa planterades per plug bricka tillsammans med en kontroll sallad sort. En av utmaningarna med screening för tolerans torka i en specialitet gröda ofta finns det ingen know stressen toleranta eller känsliga arvsmassa för att använda som positiva eller negativa kontroller. När ingen positiv eller negativ kontroll finns som i utvecklingen av detta protokoll att använda en standardarvsmassa i alla prövningar möjliggör en grundläggande nivå av intern kontroll för variabilitet villkor i hela varje skärm. Antalet olika arvsmassa som kan planteras kommer direkt att bidra till den hastighet med vilken en arvsmassa samling kan screenas, men begränsas av antalet plantor som behövs för each mätning tas under rättegången. Genom att begränsa antalet unika arvsmassa i varje magasin till mellan 3 och 6 alla sallat kan planteras på två platser inom varje fack säkerställa att ingen sallat är planterad i endast yttre celler. En annan faktor är att variationer i tillväxttakt och anläggningens storlek bland arvsmassa kan leda till reducerade mark torkning i celler som innehåller små sorter. Detta kan potentiellt partiskhet resultat i riktning mot små sorter vara överrepresenterade bland potentiella torka toleranta arvsmassa dras från denna skärm, men det verkar inte vara fallet utifrån de observerade resultaten. Vidare användning av stränga sekundära metoder för att studera den kandidat arvsmassa från detta protokoll bör antingen bekräfta eller vederlägga dessa resultat.
Vikten av samstämmighet på observation av vissnesjuka.
Övervakningen av anläggningar för vissnesjuka bör utföras vid sammatid varje dag för att undvika små svängningar i utseendet på anläggningen stress, observeras som vissnar, troligen orsakad av temperatur- och fuktighetsvariationer som förekommer i ett växthus samt dygnsrytm reglering av klyvöppningar. Se också till att vara konsekvent när scoring växter vissna eller inte. Etablera en uppsättning riktlinjer i scoring vissnesjuka är särskilt viktigt om flera individer kommer att utföra på skärmen för att säkerställa konsekventa resultat. Tröskeln för detta protokoll är alla bladen måste vissnat att göra mål växten som att vissna.
Val av parametrar mäts.
De parametrar som mäts i detta protokoll valdes utifrån deras användbarhet i att identifiera vattenstress tillsammans med anpassningsförmåga mätningarna till en halv hög genomströmning som utnyttjar minimal tillgängliga arbetskraften. Många andra mätningar kan vara till stor hjälp för att identifiera torka stress (t.ex.., Fotosyntetisk aktivitet, Rottillväxt, stomata konduktans ...), och baseras på arten av skärmen som ska utföras (dvs antal arvsmassa som används, antalet replikat, genomströmningen önskas ...) andra parametrar kan lätt integreras i den här skärmen.
Synpunkter på användningen av protokollresultat.
USDA samlingar innehåller över 4.000 individuella sallat arvsmassa som är ett nummer som gör fältförsök innehåller all arvsmassa opraktiskt. Detta protokoll har utvecklats med ensamstående syfte att möjliggöra ett mycket litet antal forskare (1-2 personer) för att screena USDA kollektioner för potentiell torka tolerans. Genom att använda dessa metoder USDA samlingen minskat till 200 sorter som sedan användes i fältförsök som kan närmare replikera torka stressförhållanden. Detta protokoll användes också för att begränsa en befolkning på över 400 spenatarvsmassa till 40 för användning i fält trials. Detta protokoll ensamt bör inte anses tillräckliga för att identifiera sig med en hög grad av säkerhet arvsmassa som innehåller varaktig torka tolerans under fältvattenstressförhållanden, men kan helt enkelt fungera som ett verktyg för att snabbt screena för potentiella stresstolerans under förhållanden vatten underskott i en snabb och effektiv skärm använder stora mängder arvsmassa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
