Protocol
1. زراعة
- ملء صواني قابس (128 الخلية؛ 28 × 54 سم مع الخلايا 3 سم و 5 سم مربع العميقة) مع مزيج التربة المكونات. للمساعدة في ملء موحد للخلايا ضغط التربة في كل علبة باستخدام علبة المكونات فارغة.
- نبات الخس البذور ¼ بوصة في عمق 2-3 بذور لكل خلية. محطة كل الخطوط التجريبية في صواني منسوخة لتوفير أكد كل من الجفاف والصواني لمراقبة المحاكمة الجفاف.
- وضع صواني المكونات في علبة قاعدة بدون ثقوب.
- صواني المياه والغطاء مع علبة مقلوب أو قبة بلاستيكية. إنبات يحدث عادة في 48-72 ساعة. بعد الإنبات إزالة الغطاء وتتحرك الصواني في الاحتباس الحراري.
ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذا البروتوكول في غرف النمو.
2. النمو ورعاية النباتات
- صواني الماء حسب الحاجة 1-4 أسابيع بعد الإنبات، وعادة هذا هو 2-3 مرات أسبوعيا، عن طريق ملء الدنيا علبة والسماح التربة لتصبح مشبعة (~ 1 ساعة) أشعة للجلوس لفترة طويلةالصورة في الماء لأن هذا قد يؤثر سلبا على صحة النبات والتنمية الجذرية ويمكن أن تؤثر على الشاشة الجفاف.
- تسميد صواني مرة واحدة أسبوعيا مع التجارية القابلة للذوبان 20-20-20 الأسمدة مختلطة بمعدل 1.5 ملعقة شاي / غال.
- صواني رقيقة لمصنع واحد لكل خلية 1-2 أسابيع وظيفة في الإنبات.
3. المبادرة للجفاف الإجهاد
- عندما النباتات هي صواني منفصلة أربعة أسابيع من العمر إلى 2 المجموعات. تخضع مجموعة واحدة لإجهاد مائي شديد. استخدام الأدراج الأخرى كما الماء جيدا الضوابط. المياه السيطرة على المجموعة كما في الخطوة 2.1 في كافة مراحل التجربة. في الشروع في إجهاد الجفاف تعليق تخصيب جميع الأدراج للفترة المتبقية من التجربة.
- وتحدث هذه الفترة التجريبية الجفاف خلال أسبوع واحد. في اليوم الأول من المحاكمة إجهاد الجفاف (يوم 0) ملء جميع الأدراج السفلية مع المياه والسماح للتربة في الأدراج المكونات حتى تصبح مشبعة تماما ثم استنزاف المياه من الصواني. تشبع التربة مباشرة قبل بدء روقال انه فترة التوتر يساعد على تقليل أي تغيير في رطوبة التربة بين الخلايا الفردية في الأدراج المكونات.
4. إجراء الشاشة الإجهاد الجفاف الأساسية مع المعلمات ليتم قياس
ملاحظة: توضح الخطوات التالية كيفية جمع القياسات الفسيولوجية الثلاث التي سيتم تسجيلها على مدار الشاشة الجفاف في حين يوفر الجدول 1 جدول القياسات التي اتخذت في كل يوم من الفترة التجريبية الجفاف من الإجهاد.
- قياس ليف النسبي محتوى الماء (RWC) في أيام 0، 2، 4 من المحاكمة.
- كليب مصنع الخس من الدرج وإزالة 2 الأوراق.
- لكمة 3 أقراص من كل ورقة باستخدام رقم 9 حفار الفلين (~ 1.6 سم القطر). الجمع بين اللكمات ورقة كما عينة واحدة.
- الموازنة بين أقراص ورقة، وهذا هو قيمة الوزن الطازج (FW) المستخدمة لحساب RWC، ثم وضع الأقراص في طبق بتري.
- إضافة الماء المقطر فقط ما يكفي من لوحة للجميعآه كل أسطوانة ورقة لتطفو. هذا هو لترطيب تماما أقراص رقة لجمع الأوزان متورمة لتحليل RWC. السماح للأقراص ورقة لتعويم لمدة 24 ساعة على RT.
- إزالة الأقراص ورقة الآن المائية بالكامل من لوحات وتجف بلطف السطح الخارجي للأقراص ورقة مع المناشف الورقية قبل وزنها الأقراص. تسجيل هذه الأوزان كما الوزن متورم (TW) لحساب RWC.
- أقراص مكان ورقة على معمل الورق أو مسح القرص رقة الترشيح في طبق بتري مفتوح وجاف في حاضنة عند 55 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: يمنع الورقة أقراص رقة من الانضمام إلى طبق بتري أثناء التجفيف. - تزن أقراص الأوراق الجافة وسجل الأوزان الجافة مثل (DW) لحساب RWC.
- حساب RWC باستخدام صيغة Weatherley وكما وصفها الذكية وبينغهام 11،12.
RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
FW = الوزن الطازج، TW = الوزن متورم، DW = الوزن الجاف - كرر الخطوة 4.1 لكل الأصول الوراثية والعلاج في المحاكمة.
- تسجيل نبات الذبول بداية مرة واحدة يوميا في يوم 1 من الإجهاد محاكمة الجفاف وتنتهي عندما يتم ذابلة 100٪ من النباتات، وعادة يوم 4 أو 5.
- مرحلة الانتعاش والنمو التفاضلي
- في يوم 6، اختتام فترة الجفاف من التوتر والنباتات وشدد يدخل مرحلة الانتعاش من المحاكمة. ملء أقل الصواني مع الماء والسماح للصواني-أكد الجفاف لينقع لمدة 24 ساعة قبل استئناف الجدول الزمني للسقي القياسية، خطوة 2.1، والصواني السيطرة.
- السماح لجميع النباتات لاستعادة لمدة 10 يوما.
- في 10 أيام آخر الجفاف من التوتر حصاد كامل فوق الأرض جزء من كل مصنع وتسجيل الوزن الطازج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند تنفيذ شاشة كبيرة من أجل فصل السكان عن طريق سمة التجريبية المطلوبة، في حالة هذا البروتوكول استجابة الجفاف من التوتر، والبيانات التي تم إنشاؤها في المقابل سوف تكون متنوعة من جدا تؤكد عرضة للالمحتمل للجفاف وجميع النقاط في ما بين. ويتضمن الشكل 1 الرسوم البيانية التي تمثل نوع النتائج التي يمكن توقعها من هذا البروتوكول. تدرج أصناف تمثيلية من ثلاثة أنواع الخس مختلفة (رومين (كوس)، crisphead، وbutterhead) في البيانات الواردة. في حين أظهرت البيانات التي تمثل أنواع الخس ثلاثة فقط هنا تم تطوير هذا البروتوكول خلال فحص الآلاف من الخس والسبانخ المادة الوراثية في معظم الأنواع. بالإضافة إلى ثلاثة أنواع من الخس المذكورة سابقا تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح إلى الشاشة الحمراء والخضراء ورقة ووقف نوع الخس جنبا إلى جنب مع الأصول الوراثية من الأنواع serriola خس ترتبط ارتباطا وثيقا، وكذلك لا علاقة جنيهafy السبانخ الخضار الخضراء. استخدم واضعو البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول لتضييق مجموعة الخس من أكثر من 4،000 إلى بركة مرشح 200 أصناف الخس لتجارب ميدانية.
الشكل 1. ممثل النتائج البيانات المعروضة شملت ممثل القياسات الفسيولوجية الثلاث في هذا البروتوكول لمدة ثلاثة أنواع الخس، بما في ذلك رومين (كوس، ROM)، crisphead (CRSP)، وbutterhead (ولكن). (A) النسبة المئوية من النباتات التي وذبل في كل يوم من فترة الجفاف من التوتر المحاكمة، بدءا من اليوم 1، يتم تسجيلها حتى تصل إلى جميع النباتات ذابلة 100٪. ويقاس (B) ورقة المحتوى المائي النسبي في أيام 0، 2، و4. -D : الجفاف والإجهاد، و-C: التحكم (C) الوزن النباتات بعد فترة الجفاف من التوتر والانتعاش 10 يوم تظهر التفاضلي النمو نظرا لالجفاف من الإجهاد. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. صواني التمثيلية والمثال زرع الرسوم البيانية (A و B) صواني مثال تظهر استجابة الجفاف من التوتر في يوم 3 من محاكمة باستخدام هذا البروتوكول بالمقارنة مع صواني السيطرة. (C و D) هذه المخططات صينية تمثل صواني المكونات المستخدمة 128 تظهر طريقتين زراعة المستخدمة في هذا البروتوكول. الحواف الخارجية للصواني (الرمادي الخلايا المظللة) ينبغي زرعت، ولكن لا تستخدم للعينات التجريبية، نظرا لنزوع الخلايا الحافة لتجف بسرعة أكبر من الخلايا الداخلية.
| يوم | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RWC-FW | X | X | X | ||||
| الذبول | X | X | X | X | (X) | (X) | |
| حجب المياه | X | ||||||
| استئناف سقي | X |
الجدول 1. الجدول الزمني للفترة الجفاف من الإجهاد. وحجب المياه من التجريبيةتؤخذ صواني ابتداء من اليوم 0 المحاكمة وسقي يستأنف في يوم 6. عينات جديدة لقياس المحتوى رقة المياه النسبي في أيام 0، 2، 4، ونسبة النباتات ذابلة تسجل بداية اليومية في يوم 1 و مستمرة حتى 100 وذابلة٪ من النباتات، وعادة يوم 4، ولكن قد تمتد إلى يوم 5 أو حتى 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اعتبارات عدد عينة للشاشة.
وينبغي أن تستند عدد العينات اللازمة على استخدام المطلوب من البيانات من هذه الشاشة. وإذا رغبت نتائج جيدة المنشور فمن المستحسن أن يحصد 3 النباتات الفردية (3 مكررات البيولوجية) من كل سطر وتنفيذ ما لا يقل عن 2 مكررات التجريبية لإعطاء نقاط كافية للتحليل الإحصائي الجودة. إذا كانت النتيجة المرجوة هي ببساطة لتضييق بسرعة مجموعة كبيرة من الأصول الوراثية مرشح من أجل إجراء تجارب المياه من التوتر أكثر صرامة أو معقدة، وعينات أقل وأو قد يكون مكررات ضروريا. يجب أن قرر عدد من العينات المطلوبة في وقت الغرس.
تخطيط الزراعة واعتبارات تجفيف التربة في الصواني.
أحد الاعتبارات المهمة جدا هو أن التربة في الخلايا على حافة علبة المكونات سوف تجف بسرعة أكبر من الخلايا الداخلية والرعايةينبغي اتخاذها لتجنب التحيز في النتائج وفقا لحصاد النباتات من الداخل فقط وعلبة (الشكل 2). حصاد النباتات فقط من الخلايا الداخلية من المرجح أن تؤثر على تخطيط زراعة الدرج. خلال الشاشة التي تم تطوير هذا البروتوكول بين زرعت 3 و 6 الأصول الوراثية فريدة من نوعها لكل علبة المكونات جنبا إلى جنب مع الصنف السيطرة الخس. واحدة من التحديات من فحص لتحمل الجفاف في محصول تخصص في كثير من الأحيان لا يوجد اي الإجهاد معرفة الأصول الوراثية متسامح أو عرضة للاستخدام الضوابط الإيجابية أو السلبية. عندما لم مراقبة إيجابية أو سلبية المتاحة كما هو الحال في تطوير هذا البروتوكول استخدام الأصول الوراثية القياسية في جميع المحاكمات يسمح لمستوى أساسي من الرقابة الداخلية لتباين الظروف طوال كل الشاشة. عدد الأصول الوراثية المختلفة التي يمكن زراعتها تساهم بشكل مباشر في السرعة التي جمع الأصول الوراثية يمكن فرزهم، ولكن يقتصر على عدد من النباتات اللازمة لمجموعة شرق افريقياح قياس اتخذت أثناء سير المحاكمة. عن طريق الحد من عدد من الأصول الوراثية فريدة من نوعها في كل علبة إلى ما بين 3 و 6 عن الخس يمكن زراعته في موقعين داخل كل علبة مؤكدا أنه لا يوجد الخس هي التي زرعت في الخلايا الخارجية فقط. وهناك اعتبار آخر هو أن التباين في معدل النمو وحجم النبات بين المادة الوراثية قد يؤدي إلى انخفاض معدلات تجفيف التربة في الخلايا التي تحتوي على أصناف صغيرة. ويحتمل أن النتائج التحيز في اتجاه أصناف صغيرة يجري أكثر من ممثلة بين المحتملين الأصول الوراثية المقاومة للجفاف سحبها من هذه الشاشة، ولكن هذا لا يبدو أن هذا هو الحال على أساس النتائج الملاحظة. وعلاوة على ذلك، واستخدام منهجيات الثانوية صارمة لدراسة الأصول الوراثية مرشح من هذا البروتوكول يجب إما تأكيد أو دحض هذه النتائج.
أهمية الاتساق على ملاحظة الذبول.
يجب أن يتم تنفيذ رصد النباتات لالذبول في الوقت نفسهالوقت يوميا لتجنب تقلبات صغيرة في ظهور الإجهاد في النبات، لاحظ كما الذبول، من المحتمل الناجم عن الحرارة والرطوبة التقلبات الحالية في دفيئة فضلا عن تنظيم الساعة البيولوجية من الثغور. أيضا، تأكد من أن تكون متسقة عندما سجل النباتات وذابلة أو لا. وضع مجموعة من المبادئ التوجيهية في يحرز الذبول أمر مهم خاصة إذا الأفراد متعددة سيتم أداء الشاشة لضمان نتائج متسقة. العتبة المستخدمة لهذا البروتوكول هو يجب ذابلة جميع أوراق النبات ليسجل النبات بأنها ذابلة.
اختيار المعلمات قياس.
وقد تم اختيار المعلمات قياس في هذا البروتوكول على أساس فائدتها في تحديد الإجهاد المائي جنبا إلى جنب مع القدرة على التكيف من القياسات إلى نظام الإنتاجية شبه عالية باستخدام الحد الأدنى من العمالة المتاحة. يمكن أن العديد من القياسات الأخرى أن تكون مفيدة جدا في تحديد الجفاف من التوتر (على سبيل المثال، النشاط الضوئي، نمو الجذور، تصرف الثغور ...)، واستنادا إلى طبيعة الشاشة التي سوف يتم تنفيذها (أي عدد من الأصول الوراثية المستخدمة، وعدد من مكررات، ومعدل الإنتاجية المرجوة ...) يمكن بسهولة أن تدمج غيرها من المعالم في هذه الشاشة.
تعليقات على استخدام نتائج البروتوكول.
مجموعات USDA تحتوي على أكثر من 4،000 فرد الأصول الوراثية الخس وهو الرقم الذي يجعل التجارب الميدانية يشمل جميع الأصول الوراثية غير عملي. وقد تم تطوير هذا البروتوكول بهدف وحيد من السماح لعدد قليل جدا من الباحثين (1-2 أفراد) لفحص مجموعات USDA لالمحتملين تحمل الجفاف. من خلال استخدام هذه الأساليب كان ضاقت جمع USDA إلى 200 نوعا واستخدمت بعد ذلك في التجارب الميدانية التي يمكن تكرارها بشكل وثيق ظروف الجفاف من الإجهاد. وقد استخدم هذا البروتوكول أيضا لتضييق يبلغ عدد سكانها أكثر من 400 السبانخ المادة الوراثية إلى 40 لاستخدامها في المحاكمه الحقلليرة سورية. لا ينبغي أن يعتبر هذا البروتوكول وحدها كافية لتحديد بدرجة عالية من اليقين الأصول الوراثية التي تحتوي دائم الجفاف التسامح في ظل ظروف الإجهاد المائي الميدان، ولكن يمكن أن تكون ببساطة كأداة للكشف بسرعة عن تحمل الإجهاد المحتمل في ظل ظروف العجز المائي في الشاشة بسرعة وكفاءة استخدام أعداد كبيرة من الأصول الوراثية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
