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Environment

半高通量筛选潜在的抗干旱的生菜( Published: April 17, 2015 doi: 10.3791/52492

Protocol

1.种植

  1. 填写穴盘(128细胞; 28×54厘米与细胞3厘米见方的5厘米深)带插头的土壤结构。为了帮助细胞均匀填充使用空穴盘压缩土壤中的每个托盘。
  2. 植物种子生菜¼英寸深入每个细胞2-3种子。工厂所有的实验线的复制盘,以提供一个干旱强调和控制托盘干旱试验。
  3. 将穴盘成无孔基盘。
  4. 水盘和盖倒托盘或塑料圆顶。发芽通常发生在48〜72小时。发芽后取下盖子和移动托盘到温室。
    注:此协议也可以在生长室进行。

2.生长和植物护理

  1. 根据需要1-4周发芽后的水盘,通常是2-3倍每周填写下层纸盒,并允许土壤趋于饱和(约1小时),光线坐长时间水[参考译文]这可能植物健康和根系发育产生负面影响,并可能影响干旱屏幕。
  2. 施肥盘每周一次与商业水溶性肥料20-20-20混合的1.5小勺/加仑的速度。
  3. 薄盘,以每单元1-2周一个工厂后发芽。

3.起爆干旱胁迫

  1. 当植物四个周龄独立纸盒分为2组。受一组严重缺水。使用以及浇水控制其它纸盘。水的对照组如在步骤2.1在整个实验。在干旱胁迫的开始暂停施肥所有托盘的实验的剩余部分。
  2. 实验干旱时期发生在一个星期。在干旱胁迫试验(0天)的初始日填补所有较低塔板与水,并允许塞状育苗盘的土壤变得完全饱和,然后从盘排水。之后的t的开始之前饱和土壤他紧张时期,将有助于最大限度地减少单个细胞的穴盘中的土壤水分的任何变化。

4.开展基本干旱胁迫屏幕采用的参数进行测量

注:以下步骤概述如何收集三个生理测量,将被记录在干旱屏幕的过程中,而表1提供对干旱胁迫试用期的每一天采取的测量的时间表。

  1. 测量叶片相对含水量(RWC)在天0,2,4审判。
    1. 从托盘夹生菜厂,并删除2叶。
    2. 冲从每个叶片用#9软木螟(〜1.6厘米直径)3盘。结合叶冲作为一个样本。
    3. 权衡的叶盘,这是用于计算RWC的鲜重(FW)的值,然后将盘在一个培养皿。
    4. 加入足够的蒸馏水至板所有嗷嗷所有叶盘浮动。这是充分滋润叶盘收集肿胀的权重RWC分析。让叶盘漂浮24小时,在RT。
    5. 从板中取出现在完全水合叶盘和称量盘前轻轻擦干叶盘用纸巾的外部。记录这些权重肿胀重量(TW)的RWC计算。
    6. 在纸的实验室地点叶盘在55℃下擦拭或滤纸盘在一个开放的培养皿中,并干燥培养箱24小时。
      注意:纸张防止叶盘从干燥过程中附着在陪替氏培养皿。
    7. 称取干叶盘并记录干重(DW)为RWC计算。
    8. 使用RWC Weatherley公式所描述的智能和宾汉姆11,12计算。
      RWC =(FW-DW / TW-DW)* 100
      FW =鲜重,TW =肿胀重,DW =干重
    9. 每个种质和治疗的试验重复步骤4.1。
  2. 记录植物枯萎,每日一次开始对干旱胁迫试验的第1天,当植物的100%的枯萎,一般4天或5结束。
  3. 恢复阶段和增长差
    1. 第6天,得出结论:干旱胁迫期间和强调植物进入审判的复苏阶段。下部托盘装满水,并允许干旱强调托盘恢复标准浇水时间表前浸泡24小时,步骤2.1,为控制托盘。
    2. 让所有的植物恢复为10天。
    3. 10天后干旱胁迫收获上述每一种植物的地上部分全部并记录鲜重。

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Representative Results

当为了由所希望的实验性状偏析人口,在该协议干旱应激反应的情况下,执行一个大屏幕,生成将相应地从非常不同的数据强调易受可能耐旱和之间的所有点。 图1包含表示结果,可以从这个协议来预期的类型图。三种不同类型的莴苣(莴苣(COS),crisphead和butterhead)代表品种都包含在显示的数据。而代表只有三个生菜类型的数据都在这里显示这个协议是成千上万的莴苣和菠菜种质资源在大多数类型的筛选过程中开发的。除了 ​​这三种类型的生菜前面提到这个协议成功地用于筛选的红色和绿色的叶和茎莴苣类型一起从密切相关的检疫性杂草毒莴苣物种种质以及无关乐AFY绿色蔬菜菠菜。笔者使用该协议缩小4000生菜收集到的200生菜品种田间试验的候选池中使用时产生的数据。

图1
示出图1代表结果数据代表三个生理测量的包括在此协议为3莴苣类型,包括生菜(COS,ROM),crisphead(CRSP)和butterhead(BUT)。(A)的植物的百分比枯萎的审判的干旱应激期的每一天,从第1天,被记录,直到所有的植物达到100%枯萎。(B)叶片相对含水量是衡量天0,2,和4 -D :干旱胁迫,-C:由于干旱后应激期的植物和10日恢复呈现增长差异的控制(C)重量干旱压力。误差条表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.代表性塔板和例如种植图(AB)实施例的托盘上显示使用此协议相比,控制盘试验的第3天的干旱应激反应。 (CD),这些托盘图代表所使用的128穴盘示出在这个协议中使用的两个种植方法。托盘(灰色阴影单元格)的外边缘应种植,但不用于实验的样品中,由于在边缘单元的倾向干比内部细胞更迅速。

0 1 2 3 4 6
RWC-FW X X X
威尔特 X X X X (X) (X)
扣压水 X
恢复浇水 X

表1.时间表干旱胁迫期。水从实验扣留托盘开始在试验的第0天,并于一天浇水简历6.新鲜样品叶片相对含水量的测量是在第0天,2,4,和植物的百分比枯萎记录每日开始第1天并持续到100 %的植物的枯萎,通常为4天,但可以延伸到5或甚至6天。

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Discussion

样本数量的考虑屏幕。

所需样品的数量应根据数据从该屏幕的期望用途。如果出版物质量结果所需的建议收获来自每个线路3的个体植物(3次生物学重复),并执行一个最少的2次重复实验,得到足够的点质量的统计分析。如果期望的结果是简单地快速缩小候选种质的大池,以便执行更严格的或复杂的水胁迫实验,更少的样品和或重复可能是必要的。所需样品的数量必须在种植时决定。

种植布局和土壤干燥盘的考虑。

其中一个很重要的考虑是,在穴盘边缘的土壤细胞就会枯竭速度超过了内部细胞和护理应注意避免偏差在结果中只从托盘内部( 图2)收获的植物。只收获从内部细胞工厂将有可能影响到托盘的种植布局。期间,其中该协议被开发3至6个独特的种质是每穴盘种植连同一个控制莴苣品种的屏幕。一种在一个特殊作物筛选干旱耐受的挑战往往存在没有知道胁迫耐受性或易患种质使用作为阳性或阴性对照。当没有正面或负面的控制可作为该协议的开发利用标准的种质资源遍及所有试验允许对整个画面的每个条件变化内部控制的基本水平。不同种质的数量可以种植将直接有助于将在哪个种质集合可筛选的速度,而是通过所需EAC植物的数量的限制在审判过程中,H测量拍摄。通过限制在每一托盘独特种质的数量为所有莴苣之间3和6可以种植在各托盘确保没有生菜是种植在只有外装单元内的两个位置。另外一个考虑是变异的增长速度和工厂规模种质之间可能导致土壤干燥含小品种细胞率降低。这可能会导致偏见的小品种是中潜在的抗旱种质代表了从该屏幕拉,但是这似乎并没有成为基于观察到的结果的情况下的方向。此外,使用严格的二次方法来研究候选人的种质从这个协议应该确认或反驳这些结果。

一致性的观察萎的重要性。

应该在相同的被执行的植物对萎蔫的监视时间每天,以避免在植物胁迫的外观的小波动,观察到萎,可能是由温度和湿度的波动出现在温室以及气孔的昼夜调节引起的。此外,一定得分植物时,作为枯萎或不保持一致。建立一套在得分萎指引尤为重要,如果多个个体将要执行的屏幕,以确保一致的结果。用于该协议的阈是植物的所有叶必须枯萎的植物评分为被枯萎。

选择参数测量。

基于其在确定水应力随着测量的适应性,以利用可用的最少的劳动的半高通量系统效用被选择在这个协议中测得的参数。许多其他的测量可以是在确定干旱胁迫( 例如 ,光合活性非常有益,根系生长,气孔导...),并且基于将被执行的屏幕的性质( 即,所用的种质数,数重复的,吞吐量速率所需...)的其他参数可以很容易地结合到该屏幕。

对使用协议的结果的意见。

美国农业部集合包含了超过4000个人莴苣种质这是一个数字,使合并所有种质不切实际的现场试验。该协议与允许极少数的研究人员(1-2人),以筛选USDA收集潜在耐旱的唯一目的而开发的。通过使用这些方法的USDA收集一度收窄至200个品种然后将其在现场试验,可以更紧密地复制干旱胁迫条件下使用。该协议也被用于缩小超过400菠菜种质群40在字段TRIA使用LS。独此协议不应该被认为足以识别具有高程度的确定性种质包含字段水胁迫条件下耐用耐旱性,但可以简单地作为一个工具水分亏缺条件下一个快速筛选潜在的胁迫耐受性快速,高效的屏幕采用了大量种质资源。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
plug tray 128 T.O. Plastics
Hummert International
11-8595-1 Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials.
lower tray (Display tray) T.O. Plastics
Hummert International
11-3305-1
plug/planting mix (Sunshine Mix #5) Sunshine
Hummert International
10-0467-1 A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop.  Sunshine mix #4 was used in spinach trials.
fertilizer (20-20-20) Jack's: Professional water-soluble fertilizer
Hummert International
07-5915-1 Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs.

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References

  1. Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
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环境科学,第98,生菜,
半高通量筛选潜在的抗干旱的生菜(<em&gt;莴苣</em&gt;)种质资源
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Cite this Article

Knepper, C., Mou, B. Semi-HighMore

Knepper, C., Mou, B. Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections. J. Vis. Exp. (98), e52492, doi:10.3791/52492 (2015).

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