Protocol
1. Plantning
- Fyld plug bakker (128 celle; 28 x 54 cm med celler 3 cm firkantede og 5 cm dyb) med stik jordblanding. For at hjælpe i uniform fyldning af celler komprimere jord i hver bakke ved hjælp af en tom plug bakke.
- Plant salat frø ¼ tommer i dybden 2-3 frø pr celle. Plant alle eksperimentelle linjer i replikerede bakker til at afgive både tørke stresset og bakker til forsøget tørke kontrol.
- Placer plug bakker ind i en base bakke uden huller.
- Vand bakker og låg med omvendt bakke eller plast kuppel. Spiring sker normalt i 48-72 timer. Efter spiring fjern dækslet og flytte bakker ind i drivhuset.
BEMÆRK: Denne protokol kan også udføres i vækstkamre.
2. Vækst og plantepleje
- Vand bakker efter behov 1-4 uger efter spiring, normalt er det 2-3 gange om ugen, ved at udfylde nederste bakke og lade jord at blive mættet (~ 1 time) stråler til at sidde i længeresi vand, da dette kan have en negativ indvirkning plantesundhed og rodudvikling og kan påvirke skærmens tørke.
- Gød bakker gang ugentligt med en kommerciel opløselig 20-20-20 gødning blandet med en hastighed på 1,5 tsk / gal.
- Tynde bakker til en plante pr celle 1-2 uger efter spiring.
3. Start Tørke Stress
- Når planterne er fire uger gamle, separate bakker i 2 grupper. Om en gruppe til svær vand stress. Brug de andre bakker også vandes kontroller. Vand kontrolgruppen som i trin 2.1 under hele forsøget. Ved indledningen af tørkestress suspendere befrugtende alle skuffer i resten af forsøget.
- Den eksperimentelle tørke periode sker over en uge. På den første dag i tørkestress forsøget (dag 0) udfylde alle lavere bakker med vand og lad jorden i plug bakker for at blive fuldt mættet derefter dræne vand fra bakkerne. Mætte jorden umiddelbart før indledningen af than stress periode vil bidrage til at minimere enhver variation i jordens fugtighed mellem de enkelte celler i plug bakker.
4. Gennemførelsen af de grundlæggende tørkestress skærm med der skal måles
BEMÆRK: Følgende trin skitsere, hvordan at samle de tre fysiologiske målinger, der vil blive optaget i løbet af skærmen tørke mens Tabel 1 giver en oversigt over målingerne på hver dag i tørke-stress prøveperiode.
- Mål Leaf Relativ vandindhold (RWC) på dag 0, 2, 4 af forsøget.
- Klip en salat plante fra bakken, og fjern 2 blade.
- Punch 3 discs fra hvert blad ved hjælp af en # 9 propbor (~ 1,6 cm i diameter). Kombiner blad slag som en prøve.
- Bladskiverne afvejes, dette er værdien frisk vægt (FW), der anvendes til RWC beregning, derefter placere diskene i en petriskål.
- Tilføj netop tilstrækkeligt vand til pladen til alleow alle bladskiver til at flyde. Dette er fuldt ud at fugte bladskiverne at samle saftspændte vægte for RWC analyse. Tillad bladskiverne til at flyde i 24 timer ved stuetemperatur.
- Fjern nu fuldt hydratiserede bladskiver fra pladerne og forsigtigt tørre det ydre af bladskiverne med papirservietter før vejning skiverne. Optag disse vægte som saftspændte vægt (TW) for RWC beregning.
- Place bladskiver på et papir lab tørre eller filtrerpapir disk i en åben petriskål og tørres i varmeskab ved 55 ° C i 24 timer.
BEMÆRK: papir forhindrer bladskiverne klæbe til petriskålen under tørring. - Tørre blade diske og optage som tørre vægte (DW) til RWC beregning afvejes.
- Beregn RWC hjælp Weatherley formel som beskrevet af Smart og Bingham 11,12.
RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
FW = frisk vægt, TW = saftspændte vægt, DW = tørvægt - Gentag trin 4.1 for hver kimplasma og behandling i forsøget.
- Optag planten visner gang dagligt start på dag 1 af tørken stress forsøg og slutter, når 100% af planterne er visne, normalt dag 4 eller 5.
- Recovery fase og vækstdifferentiale
- På dag 6 indgå tørke-stress periode, og de stressede planter indtaste inddrivelse fase af forsøget. Fyld de lavere bakker med vand og lad den tørke-stressede bakker i blød i 24 timer, inden de genoptager standard vanding tidsplan, trin 2.1, da kontrol- bakker.
- Lad alle planter til at restituere i 10 dage.
- Ved 10 dage efter tørke-stress udnytte hele den over jorden del af hver plante og registrerer den friske vægt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når du udfører en stor skærm for at adskille en population af den ønskede eksperimentel træk, i tilfælde af denne protokol tørke-stress respons, de data, der genereres, vil tilsvarende variere fra meget stress modtagelige for sandsynligt tørke-tolerante og alle punkter i mellem. Figur 1 indeholder grafer, der repræsenterer den type resultater, der kan forventes fra denne protokol. Repræsentative sorter af tre forskellige salat typer (romaine (COS), crisphead, og butterhead) er inkluderet i de viste data. Mens data, der repræsenterer kun tre salat typer Her vises denne protokol blev udviklet i screeningen af tusindvis af salat og spinat kimplasma tværs af de fleste typer. Ud over de tre typer salat tidligere nævnt denne protokol blev succesfuldt brugt til at screene rød og grønne blade og dæmme typen salat sammen med kimplasma fra nært beslægtede Lactuca serriola arter samt den uafhængige leAFY grønne grøntsager spinat. Forfatterne anvendte data genereret ved hjælp af denne protokol til at indsnævre en salat samling på over 4.000 til en kandidat pulje på 200 salat sorter for markforsøg.
Figur 1. Repræsentative resultater viste data er repræsentativ for de tre fysiologiske målinger inkluderet i denne protokol for tre salat typer, herunder romaine (cos, ROM), crisphead (CRSP), og butterhead (men). (A) Procentdelen af planter, er visnet på hver dag i tørke-stress periode af forsøget, startende på dag 1, registreres indtil alle planter nå op på 100% visne. (B) Leaf relative vandindhold måles på dag 0, 2, og 4. -D : tørke-stress, -C:. kontrol (C) Vægt af planter efter tørke-stress periode og 10 dages restitutionsperiode viser vækstdifferentiale grundtørke-stress. Error søjler repræsenterer standardafvigelsen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Repræsentative bakker og eksempel plantning diagrammer (A og B) eksempel bakker viser tørke-stress respons på dag 3 i en retssag ved hjælp af denne protokol i forhold til kontrol- bakker. (C og D) Disse bakke diagrammer repræsenterer de 128 plug bakker viser to plantning metoder brugt i denne protokol. De ydre kanter af bakkerne (grå skraverede celler) skal plantes, men ikke anvendes til eksperimentelle prøver på grund af tilbøjeligheden af Edge celler til at tørre hurtigere end indvendige celler.
| Dag | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RWC-FW | X | X | X | ||||
| Visner | X | X | X | X | (X) | (X) | |
| Tilbageholde vand | X | ||||||
| Genoptag vanding | X |
Tabel 1. Tidsplan for tørke-stress periode. Vand tilbageholdes fra den eksperimentellebakker begynder på dag 0 af forsøget og vanding genoptages på dag 6. Friske prøver til indhold blad relative vand målinger på dag 0, 2, 4, og procentdelen af planter visne registreres dagligt start på dag 1 og indtil 100 % af planterne er visne, normalt dag 4, men kan strække sig til dag 5 eller endda 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overvejelser af prøvenummer for skærmen.
Antallet af prøver, der er nødvendige, bør være baseret på den ønskede anvendelse af data fra denne skærm. Hvis der ønskes offentliggørelse kvalitet resultater anbefales det at høste 3 individuelle planter (3 biologiske gentagelser) fra hver linje og udfører mindst 2 eksperimentelle gentagelser for at give fyldestgørende point for statistisk analyse kvalitet. Hvis det ønskede resultat er simpelthen for hurtigt indsnævre en stor pulje af kandidat kimplasma for at udføre strengere eller komplekse vand-stress eksperimenter, mindre prøver og eller gentagelser kan være nødvendig. Antallet af prøver, der er nødvendige, skal afgøres på tidspunktet for udplantning.
Plantning layout og overvejelser af jord tørring i bakker.
En meget vigtig overvejelse er, at jorden i celler på kanten af proppen bakken vil tørre hurtigere end indvendige celler og plejebør tages for at undgå skævheder i resultaterne ved kun at høste planter fra bakken indre (figur 2). Kun høste planter fra de indvendige celler vil sandsynligvis påvirke plantning layout af bakken. Under skærmen, hvor denne protokol blev udviklet mellem 3 og 6 unikke kimplasma blev plantet pr stik bakke sammen med en kontrol salat sort. En af udfordringerne ved screening for tørke tolerance i en specialitet afgrøde ofte findes der ingen kender stress tolerant eller modtagelig kimplasma at bruge som positive eller negative kontroller. Når der ikke positiv eller negativ kontrol er tilgængelig som i udviklingen af denne protokol at anvende en standard kimplasma i alle forsøg giver mulighed for et grundlæggende niveau af intern kontrol for variabilitet forhold i hvert skærmbillede. Antallet af forskellige kimplasma, der kan plantes direkte vil bidrage til den hastighed, hvormed en kimplasma samling kan screenes, men er begrænset af antallet af planter nødvendige for each måling i løbet af retssagen. Ved at begrænse antallet af unikke kimplasma i hver bakke til mellem 3 og 6 alle salat kan plantes i to steder i hver bakke at sikre, at ingen salat er plantet i kun udvendige celler. Et andet forhold er, at variation i væksten og anlægsstørrelse blandt kimplasma kan medføre reducerede satser for tørring jord i celler, der indeholder små sorter. Dette kunne potentielt indflydelse på resultaterne i retning af små sorter bliver overrepræsenteret blandt potentielle tørke-tolerante kimplasma trukket fra denne skærm, men det synes ikke at være tilfældet på grundlag af de observerede resultater. Desuden bør anvendelsen af strenge sekundære metoder til at studere den kandidat kimplasma fra denne protokol enten bekræfte eller afkræfte disse resultater.
Vigtigheden af konsistens på observation af visnesyge.
Overvågningen af planter til visnesyge skal udføres på sammetid dagligt for at undgå små udsving i forekomsten af planten stress, observeret nedvisning, sandsynligvis forårsaget af temperatur og luftfugtighed udsving til stede i et drivhus samt døgnrytmen regulering af stomata. Sørg også for at være konsekvent, når lave planter visne eller ej. Etablering af et sæt retningslinjer i scoring visnesyge er især vigtigt, hvis flere personer skal udføre på skærmen for at sikre ensartede resultater. Den anvendes til dette protokol tærskel er alle blade af planten skal visne at score planten som værende visne.
Udvælgelse af målte parametre.
De målte parametre i denne protokol er valgt ud fra deres nytte i at identificere vandstress sammen med tilpasningsevne målingerne til en semi-high throughput, der anvender minimal tilgængelig arbejdskraft. Mange andre målinger kan være meget nyttigt at identificere tørke-stress (f.eks., Fotosyntetiske aktivitet, Rodvækst, stomatakonduktans ...), og baseret på arten af skærmen, der vil blive udført (dvs. antal kimplasma, antal gentagelser, satsen for gennemløb ønskes ...) andre parametre kan nemt indarbejdes i dette skærmbillede.
Bemærkninger om brug af protokol resultater.
De USDA samlinger indeholder over 4.000 individuelle salat kimplasma som er et tal, der gør markforsøg omfattende al germplasma upraktisk. Denne protokol blev udviklet med den enlige formål at tillade en meget lille antal forskere (1-2 personer) til at screene USDA kollektioner til potentiel tørke tolerance. Gennem brug af disse metoder USDA samlingen blev indsnævret til 200 sorter, som derefter blev brugt i markforsøg, der i højere grad kan replikere tørke-stress betingelser. Denne protokol blev også anvendt til at indsnævre en befolkning på over 400 spinat kimplasma til 40 til anvendelse i felt trials. Denne protokol alene bør ikke anses for tilstrækkeligt til at identificere sig med en høj grad af sikkerhed kimplasma som indeholder holdbare tørke-tolerance under praktiske vand-stress betingelser, men kan simpelthen fungere som et værktøj til hurtigt at screene for potentielle stress tolerance under forhold vand underskud i en hurtig og effektiv skærm anvender et stort antal kimplasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
