Protocol
1. De aanplant
- Vul plug trays (128 cel; 28 x 54 cm met cellen 3 cm in het vierkant en 5 cm diep) met stekker bodem mix. Om te helpen in uniform vullen van cellen comprimeren bodem in elke lade met behulp van een lege stekker lade.
- Plant slazaad ¼ inch in de diepte 2-3 zaden per cel. Plant alle experimentele lijnen in gerepliceerde trays te bieden zowel een droogte gestresst en controle trays voor de droogte proef.
- Plaats plug trays in een bodemprofiel zonder gaten.
- Water bakjes en deksel met omgekeerde bak of plastic koepel. Kieming komt normaal voor in 48-72 uur. Na kieming verwijder het deksel en trays verhuizen naar kas.
LET OP: Dit protocol kan ook in groeikamers worden uitgevoerd.
2. Groei en Plant Care
- Water trays als nodig is 1-4 weken na het ontkiemen, normaal gesproken is dit 2-3 keer per week, door het invullen onderste lade en het toestaan van de bodem te verzadigd raken (~ 1 uur) stralen te zitten voor langere tijds in het water, want dit kan een negatieve invloed gezondheid van planten en ontwikkeling van de wortels en kan de droogte scherm beïnvloeden.
- Bemesten trays eenmaal per week met een commerciële oplosbare 20-20-20 meststof gemengd met een snelheid van 1,5 tl / gal.
- Dunne laden om één plant per cel 1-2 weken na het ontkiemen.
3. Initiëren Droogtestress
- Wanneer de planten zijn vier weken oud aparte bakjes in 2 groepen. Behoudens de ene groep tot ernstige waterstress. Gebruik de andere laden als goed bewaterd controles. Water de controlegroep als in stap 2.1 gedurende het experiment. Bij de inleiding van de droogtestress te schorten bemesten alle laden voor de rest van het experiment.
- De experimentele droogte periode optreedt meer dan een week. Op de eerste dag van de droogtestress trial (Dag 0) vult alle lagere bakken met water en laat de bodem in de stekker trays volledig verzadigd te worden dan drainwater uit trays. Verzadigen van de bodem vlak voor de start van de thij stress-periode zal helpen om elke variatie in bodemvocht tussen individuele cellen in de stekker trays minimaliseren.
4. Het uitvoeren van de Basis Droogte Stress-scherm met te meten parameters
OPMERKING: De volgende stappen geven aan hoe de drie fysiologische metingen die zullen worden opgenomen in de loop van de droogte scherm terwijl Tabel 1 geeft een overzicht van de metingen die op elke dag van de droogte-stress-proefperiode verzamelen.
- Meet de Leaf Relative Water Content (RWC) op dag 0, 2, 4 van het proces.
- Clip een slaplant uit de lade en verwijder 2 bladeren.
- Punch 3 schijven van elk blad met een # 9 kurkboor (~ 1,6 cm diameter). Combineer blad stoten als één monster.
- Weeg de bladschijven, dit is het versgewicht (FW) waarde gebruikt voor de RWC berekening, dan plaatst u de schijven in een petri plaat.
- Voeg net genoeg gedestilleerd water om de plaat om alleow alle bladschijven te zweven. Dit is om volledig te hydrateren de bladschijven aan gezwollen gewichten te verzamelen voor RWC analyse. Laat de bladschijven te drijven gedurende 24 uur bij KT.
- Verwijder de nu volledig gehydrateerde bladschijven van de platen en voorzichtig droog vervolgens van de bladschijven met papieren handdoeken voor het wegen van de schijven. Noteer deze gewichten zo gezwollen gewicht (TW) voor de RWC berekening.
- Plaats bladschijven op een papieren doekje of laboratorium filtreerpapier schijf in een open petrischaal en droog in incubator bij 55 ° C gedurende 24 uur.
OPMERKING: Het papier voorkomt dat de bladschijven van het naleven van de petrischaal tijdens het drogen. - Weeg droog blad schijven en record als droog gewicht (DW), voor RWC berekening.
- Bereken RWC behulp Weatherley de formule zoals beschreven door Smart en Bingham 11,12.
RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
FW = vers gewicht, TW = gezwollen gewicht, DW = drooggewicht - Herhaal stap 4.1 voor elke kiemplasma en de behandeling in het proces.
- Noteer de plant verwelken eenmaal daags beginnend op dag 1 van de droogtestress proces en eindigt wanneer 100% van planten verwelkt, gewoonlijk dag 4 of 5.
- Herstel fase en groeiverschil
- Op dag 6, concluderen de droogte-stress-periode en de gestresste planten voer het herstel fase van het proces. Vul het onderste bakken met water en laat het door droogte benadrukte trays om te genieten gedurende 24 uur vóór het hervatten van de standaard sproeisysteem schema, stap 2.1, als de controle trays.
- Laat alle planten om te herstellen voor 10 dagen.
- Bij 10 dagen oogsten na de droogte stress het hele bovengrondse deel van elke plant en noteer de versgewicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij het uitvoeren van een groot scherm om een populatie scheiden van de gewenste experimentele eigenschap, bij dit protocol droogte-stress-respons, de gegenereerde dienovereenkomstig gevarieerd van zeer gegevens wijzen gevoelig waarschijnlijke droogtetolerante en alle punten daartussen. Figuur 1 bevat grafieken die de aard van de resultaten die kunnen worden verwacht van dit protocol. Representatieve cultivars van drie verschillende typen sla (romaine (cos), crisphead en botersla) worden opgenomen in de vermelde gegevens. Terwijl de gegevens die slechts drie soorten sla hier worden getoond dit protocol werd ontwikkeld tijdens de screening van duizenden sla en spinazie kiemplasma in de meeste soorten. Naast de drie slasoorten eerder genoemde Dit protocol werd met succes gebruikt voor rood en groen blad screenen en stengeltype sla met kiemplasma van de nauw verwante Lactuca serriola soorten als de verbonden leAFY groene groente spinazie. De auteurs gebruikt gegevens die zijn gegenereerd met behulp van dit protocol om een sla collectie van meer dan 4000 beperken tot een kandidaat-pool van 200 slasoorten voor veldproeven.
Figuur 1. Representatieve resultaten getoonde gegevens zijn representatief voor de drie fysiologische metingen opgenomen in dit protocol voor drie soorten sla, met inbegrip van romaine (cos, ROM), crisphead (CRSP), en botersla (maar). (A) Het percentage van de planten die zijn verwelkt op elke dag van de droogte-stress-periode van het proces, te beginnen op dag 1, opgenomen totdat alle planten oplopen tot 100% verwelkt. (B) Blad relatieve vochtgehalte wordt gemeten op dag 0, 2 en 4. -D : droogte-stress, -C:. control (C) Gewicht van de planten na droogte-stress-periode en 10 dagen herstel tonen groei verschil te wijten aandroogte-stress. Fout balken geven de standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Representatieve trays en voorbeeld planten diagrammen (A en B) Voorbeeld trays tonen de droogte-stress respons op dag 3 van een proef met dit protocol vergeleken met de controle trays. (C en D) Deze lade diagrammen vertegenwoordigen de 128 stekker trays met twee planten methoden gebruikt in dit protocol. De buitenste randen van de bakken (grijs gearceerde cellen) moeten worden geplant, maar niet gebruikt voor experimentele monsters, vanwege de neiging van de rand cellen sneller dan interne cellen drogen.
| Dag | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RWC-FW | X | X | X | ||||
| Verwelken | X | X | X | X | (X) | (X) | |
| Achterhouden water | X | ||||||
| Hervatten besproeien | X |
Tabel 1. Tijdschema van droogte-stress-periode. Water wordt ingehouden op de experimenteletrays beginnend op dag 0 van de proef en drenken cv op dag 6. Verse monsters voor blad relatieve watergehalte metingen worden genomen op dag 0, 2, 4, en het percentage planten verwelkt zijn opgenomen dagelijks begin op dag 1 en doorgaat tot 100 % van planten verwelkt normaliter dag 4, maar kan zich uitstrekken tot dag 5 of 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overwegingen van het sample nummer voor het scherm.
Het aantal monsters nodig moet worden gebaseerd op het gewenste gebruik van de gegevens van dit scherm. Als publicatie kwaliteit van de resultaten gewenst zijn, wordt aanbevolen om 3 individuele planten (3 biologische herhalingen) van elke lijn te oogsten en het uitvoeren van een minimum van 2 experimentele herhalingen om voldoende punten te geven voor de kwaliteit van de statistische analyse. Indien het gewenste resultaat gewoon snel smal een grote pool van kandidaat kiemplasma om strengere of complexe water stress experimenten minder monsters uitgevoerd en of herhalingen nodig zijn. Het aantal benodigde monsters moet worden vastgesteld op het ogenblik van het planten.
Aanplant layout en overwegingen van de bodem drogen in trays.
Een belangrijke overweging is dat de bodem in cellen op de rand van de plug tray sneller droogt dan interne cellen en verzorgingmoeten worden genomen om vertekening van de resultaten te vermijden door alleen oogsten planten uit de inwendige lade (figuur 2). Slechts oogsten planten uit de inwendige cellen het planten indeling van de lade zal beïnvloeden. Tijdens het scherm waarin dit protocol werd ontwikkeld tussen de 3 en 6 unieke kiemplasma werd geplant per pluglade samen met een controle sla cultivar. Een van de uitdagingen van de screening voor droogte tolerantie in een specialiteit gewas is vaak bestaat er geen kennis stresstolerantie of gevoelig kiemplasma als positieve of negatieve controles gebruikt. Wanneer geen positieve en negatieve controle is als in de ontwikkeling van dit protocol de toepassing van een standaard kiemplasma in alle beproevingen maakt een basisniveau van de interne controle van variabiliteit van omstandigheden in elk scherm. Het aantal verschillende kiemplasma die kunnen worden geplant direct bijdragen aan de snelheid waarmee een kiemplasma verzameling kan worden gescreend, maar is beperkt door het aantal planten nodig voor each meting tijdens het proces. Door de beperking van het aantal unieke kiemplasma in elke lade tussen 3 en 6 alle sla kan worden geplant in twee locaties binnen elke lade verzekeren dat geen sla geplant slechts exterieur cellen. Een andere overweging is dat de variatie in de groeisnelheid en de omvang van de installatie onder germplasm kan leiden tot verlaagde tarieven van de bodem drogen in cellen met kleine rassen. Dit kan mogelijk hoger resultaat in de richting van kleine rassen zijn oververtegenwoordigd onder potentiële droogtetolerante germplasm getrokken van dit scherm, maar dit lijkt niet het geval op basis van de waargenomen resultaten zijn. Bovendien moet het gebruik van strenge secundaire methoden om de kandidaat germplasm bestuderen van dit protocol te bevestigen of te weerleggen deze resultaten.
Het belang van consistentie op de observatie van verwelken.
De opvolging van de installaties voor de verwelkingsziekte moeten op hetzelfde worden uitgevoerdmaal daags kleine schommelingen in de verschijning van stress bij planten te vermijden, waargenomen verwelken, waarschijnlijk veroorzaakt door de temperatuur en vochtigheid schommelingen aanwezig in een kas en circadiane regulatie van huidmondjes. Zorg er ook voor om consistent te zijn bij het scoren van planten als verwelkt of niet. De oprichting van een set van richtlijnen in het noteren verwelkingsziekte is vooral belangrijk als er meerdere personen zal optreden op het scherm om consistente resultaten te waarborgen. De drempel die voor dit protocol is alle bladeren van de plant moet worden verwelkt om de plant te scoren als zijnde verwelkt.
Selectie van parameters gemeten.
De parameters gemeten in dit protocol werden gekozen op basis van hun bruikbaarheid in het identificeren van waterstress, samen met het aanpassingsvermogen van de metingen tot een semi-high throughput systeem gebruik te maken van een minimale beschikbare arbeid. Veel andere metingen kan zeer nuttig zijn bij het identificeren van droogte-stress (bv., Fotosynthetische activiteit, Wortelgroei, stomatale geleidbaarheid ...), en op basis van de aard van het scherm dat zal worden uitgevoerd (dat wil zeggen, het aantal kiemplasma gebruikt, aantal herhalingen, de snelheid van doorvoer gewenste ...) andere parameters kunnen gemakkelijk in dit scherm worden opgenomen.
Opmerkingen over het gebruik van protocol resultaten.
De USDA collecties bevat meer dan 4.000 individuele sla kiemplasma dat is een nummer dat veldproeven waarin alle germplasma onpraktisch maakt. Dit protocol werd ontwikkeld met de eenzame doel van het toestaan van een zeer klein aantal onderzoekers (1-2 personen) aan de USDA collecties voor potentiële droogte tolerantie screenen. Door het gebruik van deze werkwijzen werd de USDA collectie versmald tot 200 variëteiten die vervolgens werden gebruikt in veldproeven nauwer repliceren droogte stress condities. Dit protocol werd gebruikt om een populatie van meer dan 400 spinazie kiemplasma beperken tot 40 voor gebruik in het veld trials. Dit protocol alleen niet voldoende te identificeren met een hoge mate van zekerheid kiemplasma dat duurzaam droogte tolerantie onder praktijkomstandigheden water-stressomstandigheden bevat worden beschouwd, maar enkel dienen als middel om snel te screenen op potentiële stresstolerantie onder omstandigheden watertekort in een snelle en efficiënte scherm gebruik te maken van grote aantallen kiemplasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
