Protocol
1. Das Einpflanzen
- Füllen Steckfächer (128 Zelle; 28 x 54 cm mit Zellen 3 cm im Quadrat und 5 cm tief) mit Stecker Erde-Mischung. Um eine gleichmäßige Befüllung der Zellen helfen komprimieren Boden in jedes Fach mit einem leeren Steckfach.
- Pflanzensalatsaatgut ¼ Zoll in der Tiefe 2-3 Samen pro Zelle. Pflanzen alle experimentellen Linien in replizierten Tabletts, um sowohl eine Dürre gestresst und Steuersatz für die Dürre-Studie.
- Zeigen Steckfächer in eine Bodenwanne ohne Löcher.
- Wasser-Schalen und Deckel mit umgekehrten Schale oder Plastikhaube. Die Keimung erfolgt in der Regel in 48 bis 72 Stunden. Nach der Keimung nehmen Sie den Deckel und ziehen Tabletts in Gewächshaus.
Hinweis: Dieses Protokoll kann auch in Klimakammern durchgeführt werden.
2. Wachstum und Pflanzenpflege
- Wasserschalen je nach Bedarf 1 bis 4 Wochen nach der Keimung, normalerweise ist 2-3 mal pro Woche, indem untere Fach und so Boden zu gesättigten (~ 1 h) Strahlen geworden, um für längere Zeit zu sitzens in Wasser, da dies negative Auswirkungen auf die Pflanzengesundheit und die Wurzelentwicklung und kann die Trockenheit Bildschirm auswirken.
- Befruchten Schalen einmal wöchentlich mit einem kommerziellen löslichen 20-20-20 Düngemittel mit einer Rate von 1,5 TL / gal gemischt.
- Dünne Tabletts auf eine Pflanze pro Zelle 1-2 Wochen nach der Keimung.
3. Initiieren Trockenstress-
- Wenn die Pflanzen vier Wochen alten separaten Kabelpritschen in 2 Gruppen. Vorbehaltlich einer Gruppe in hohem Wasserstress. Verwenden Sie die anderen Fächer sowie bewässert Kontrollen. Gießen Sie die Kontrollgruppe, wie in Schritt 2.1 während des gesamten Versuchs. Bei der Einleitung der Trockenstress suspend Düngen Sie alle Fächer für den Rest des Experiments.
- Die experimentelle Dürreperiode erfolgt über eine Woche. Auf der ersten Tag des Trockenstress-Studie (Tag 0) fuellen unteren Böden mit Wasser und lassen Sie den Boden in den Steckfächer, sich vollständig gesättigt, dann lassen Sie das Wasser aus Trays. Tränken des Bodens unmittelbar vor der Einleitung der ter Stressperiode wird dazu beitragen, eine Variation der Bodenfeuchte zwischen einzelnen Zellen in den Steckfächer zu minimieren.
4. Durchführung der Grundtrockenstress-Bildschirm mit zu messenden Parameter
Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben, wie die drei physiologische Messungen, die im Laufe der Dürre Bildschirm aufgezeichnet werden, während Tabelle 1 gibt einen Zeitplan der durchgeführten Messungen an jedem Tag der Dürre-Stress-Testzeitraum zu sammeln.
- Messen Sie das Blatt Relative Wassergehalt (RWC) an den Tagen 0, 2, 4 der Studie.
- Clip eine Salatpflanze aus dem Fach, und entfernen Sie 2 Blätter.
- Lochen 3 Scheiben von jedem Blatt mit einem # 9 Korkbohrer (~ 1,6 cm Durchmesser). Kombinieren Blatt Schläge als eine Probe.
- Wiegen Sie die Blattscheiben, das ist das Frischgewicht (FW) Wert für das RWC Berechnung verwendet, und legen Sie die Scheiben in einer Petrischale.
- Fügen Sie gerade genug destilliertes Wasser auf die Platte, um alleow alle Blattscheiben zu schweben. Dies ist auf die Blattscheiben vollständig hydratisieren turgid Gewichte für RWC Analyse zu sammeln. Ermöglichen, dass die Blattscheiben für 24 h bei RT schweben.
- Entfernen Sie die nun vollständig hydratisiert Blattscheiben von den Platten und vorsichtig das Äußere der Blattscheiben mit Papiertüchern trocknen vor dem Wiegen die Scheiben. Notieren Sie diese Gewichte als prall Gewicht (TW) für das RWC Berechnung.
- Ort Blattscheiben auf einem Papiertuch oder Laborfilterpapier-Rondelle in eine offene Petrischale und trocken im Brutschrank bei 55 ° C für 24 Stunden.
ANMERKUNG: Das Papier verhindert, daß die Blattscheiben von während des Trocknens auf die Petrischale anhaften. - Wiegen trockene Blattscheiben und Aufzeichnung als Trockengewicht (DW) für RWC Berechnung.
- Berechnen RWC mit Weatherley-Formel, wie Smart und Bingham 11,12 beschrieben.
RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
FW = Frischgewicht, TW = prall Gewicht, DW = Trockengewicht - Wiederholen Sie Schritt 4.1 für jede Keimplasma und Behandlung in der Studie.
- Notieren Sie die Anlage willst einmal täglich Beginn an Tag 1 des Trockenstress-Studie und endet, wenn 100% der Pflanzen sind verwelkt, normalerweise Tag 4 oder 5.
- Erholungsphase und Wachstumsdifferenz
- An Tag 6 Abschluss der Dürre-Stress-Periode und die gestressten Pflanzen geben Sie die Erholungsphase der Studie. Füllen Sie die unteren Böden mit Wasser und lassen Sie die Dürre spannten Fächer für 24 Stunden einweichen vor dem Fortsetzen des Standardbewässerungsplan, Schritt 2.1, wie die Kontrollschalen.
- Lassen Sie alle Pflanzen um 10 Tage zu erholen.
- Bei 10 Tage nach der Dürre-Stress zu ernten die gesamte oberirdische Teil jeder Anlage und notieren Sie die Frischgewicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bei der Durchführung einer großen Bildschirm, um eine Bevölkerung durch die gewünschte experimentelle Merkmal zu trennen, im Falle dieses Protokolls Dürre-Stress-Reaktion, die erzeugt werden, entsprechend von sehr variiert werden Daten betonen anfällig für wahrscheinlich trockentoleranten und alle Punkte dazwischen. Abbildung 1 enthält Graphen, die die Art der Ergebnisse, die von diesem Protokoll erwartet werden kann. Vertreter von drei verschiedenen Sorten Salat-Typen (romaine (cos), crisphead und Butter) sind in den aufgeführten Daten enthalten. Während die Daten nur drei Salatarten, die hier gezeigt werden dieses Protokoll wurde während der Vorführung von Tausenden von Kopfsalat und Spinat Keimplasma in den meisten Typen entwickelt. Zusätzlich zu den drei Arten von Salat zuvor erwähnt dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um rote und grüne Blatt zusammen mit Keimplasma von den eng verwandten Lactuca serriola Arten sowie screenen Stengeltyp Kopfsalat als unabhängige leAFY grüne Gemüse Spinat. Die Autoren verwendeten Daten, die unter Verwendung dieses Protokoll, um einen Salat Sammlung von über 4.000 auf einen Kandidatenpool von 200 Salatsorten für Feldversuche einzugrenzen.
Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse gezeigte Daten sind repräsentativ für die drei physiologische Messungen in diesem Protokoll enthalten drei Salatarten, einschließlich romaine (cos, ROM), crisphead (CRSP) und Butter (BUT). (A) Der Prozentsatz der Pflanzen, werden an jedem Tag der Dürre-Stress-Zeitraum der Studie verwelkt, beginnend am Tag 1 wird aufgezeichnet, bis alle Pflanzen erreichen 100% verwelkt. (B) Blatt relativen Wassergehalt an den Tagen 0, 2 gemessen und 4-D : Dürre-Stress, -C:. Kontrolle (C) Gewicht der Pflanzen nach Dürre-Stress-Periode und 10 Tage Erholung, die Wachstumsdifferenz aufgrundDürre-Stress. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Representative Schalen und beispielsweise das Pflanzen-Diagramme (A und B) Beispiel Schalen zeigen die Dürre-Stress-Reaktion an Tag 3 eines Prozesses mit diesem Protokoll im Vergleich zu den Kontrollschalen. (C und D) Diese Schale Diagramme stellen die 128 Steckfächer verwendet, die zwei in diesem Protokoll verwendeten Anbaumethoden. Die äußeren Kanten der Schalen (grau schattierten Zellen) sollten gepflanzt werden, aber nicht für Versuchsproben verwendet werden, aufgrund der Neigung der Randzellen schneller als innere Zellen trocknen.
| Tag | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RWC-FW | X | X | X | ||||
| Wilt | X | X | X | X | (X) | (X) | |
| Zurückhalten, Wasser | X | ||||||
| Fortsetzen Bewässerung | X |
Tabelle 1: Zeitplan der Dürre-Stress-Periode. Das Wasser wird aus dem experimentellen vorenthaltenFächer, die am Tag 0 der Studie und die Bewässerung wieder aufgenommen am 6. Tag Frische Proben für Blatt relativen Wassergehalt Messungen werden an den Tagen 0, 2, 4 genommen, und der Prozentsatz der Pflanzen welk werden täglich Beginn an Tag 1 aufgezeichnet und Weiterbildung bis 100 % der Pflanzen verwelkt normalerweise Tag 4, kann aber bis Tag 5 oder sogar 6 erstrecken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Überlegungen der Probennummer für Bildschirm.
Die Anzahl der Proben erforderlich ist von der gewünschten Verwendung der Daten aus diesem Bildschirm erfolgen. Bei Veröffentlichung hochwertige Ergebnisse gewünscht werden, wird empfohlen, 3 Einzelanlagen (3 biologischen Replikaten) aus jeder Zeile zu ernten, und führen Sie ein Minimum 2 Experimentwiederholungen angemessene Punkte für Qualität der statistischen Analyse zu geben. Wenn das gewünschte Ergebnis ist einfach, schnell einzugrenzen einen großen Pool von Kandidaten Keimplasma um strengeren oder komplexen Wasser-Stress-Experimente durchführen und weniger Proben oder Wiederholungen erforderlich sein. Die Anzahl der erforderlichen Proben müssen zum Zeitpunkt der Pflanzung entschieden werden.
Pflanz Layout und Überlegungen der Bodentrocknung in Schalen.
Ein sehr wichtiger Aspekt ist, dass der Boden, in Zellen, die auf der Kante der Steckschale wird schneller trocknen, als innere Zellen und Pflegesollte darauf geachtet werden, um Verzerrungen in den Ergebnissen nur die Ernte Pflanzen aus dem Fach Innere (Abbildung 2) zu vermeiden. Nur Ernte Pflanzen aus den inneren Zellen wird die Pflanzung Layout des Fachs wahrscheinlich beeinflussen. Während der Bildschirm, in dem dieses Protokoll wurde entwickelt, zwischen 3 und 6 einzigartigen Keimplasma wurde per Steckschale zusammen mit einem Steuerkopfsalat Sorte gepflanzt. Eine der Herausforderungen der Screening für Trockentoleranz in einer Sonderkulturen oft gibt es kein Know stresstoleranter oder anfällig Keimplasma als positive oder negative Kontrollen mitführen. Wenn keine positive oder negative Kontrolle ist in der Entwicklung dieses Protokoll zur Verfügung die Verwendung eines Standard-Keimplasma in allen Versuchen ermöglicht eine Grundstufe der interne Kontrolle für die Variabilität der Bedingungen in jedem Bildschirm. Die Anzahl der verschiedenen Keimplasma, die eingepflanzt werden können, werden direkt an die Geschwindigkeit, mit der eine Keimplasmasammlung kann gescreent werden, bei, sondern wird durch die Anzahl der Pflanzen zum EAC notwendig beschränkth-Messung im Verlauf der Studie genommen. Durch die Begrenzung der Anzahl der einzelnen Keimplasma in die einzelnen Fächer, um zwischen 3 und 6 aller Salat kann in zwei Positionen innerhalb jedes Fach sicherzustellen, dass keine Kopfsalat ist in nur Außenzellen gepflanzt werden. Eine weitere Überlegung ist, dass Schwankungen der Wachstumsrate und der Anlagengröße zwischen Keimplasma kann, ermäßigte Sätze von Bodentrocknung in Zellen mit kleinen Sorten führen. Dies könnte möglicherweise Befunden in Richtung des kleinen Sorten dass unter den potenziellen trockentolerante Keimplasma überrepräsentiert zog von diesem Bildschirm aus, aber das schien nicht der Fall ist, basierend auf den beobachteten Ergebnissen. Weiterhin ist die Verwendung von strengen Sekundär Methoden aus diesem Protokoll, um den Kandidaten Keimplasma studieren sollte, entweder zu bestätigen oder zu widerlegen diese Ergebnisse.
Die Bedeutung der Konsistenz auf der Beobachtung von Welke.
Die Überwachung von Anlagen zur Welke sollten gleichzeitig durchgeführt werden,täglich die Zeit geringe Schwankungen in der Erscheinung des Pflanzenstress zu vermeiden, beobachtet Welke, wahrscheinlich durch Temperatur- und Feuchtigkeitsschwankungen im Gewächshaus als auch circadiane Regulierung der Spaltöffnungen vorhanden verursacht. Auch sicher sein, konsequent zu sein bei der Punktwertung Pflanzen welk oder nicht. Festlegung einer Reihe von Leitlinien in Scoring-Welke ist besonders wichtig, wenn mehrere Personen wird die Durchführung des Bildschirms, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten. Die für dieses Protokoll verwendet Schwelle alle Blätter der Pflanze sind verwelkt, die Anlage als verwelkt punkten werden.
Auswahl der Parameter gemessen.
Die in diesem Protokoll gemessenen Parameter wurden anhand ihrer Nützlichkeit bei der Identifizierung von Wasserstress sowie die Anpassung der Messwerte an eine halb System mit hohem Durchsatz unter Verwendung von minimal verfügbaren Arbeitskräfte ausgewählt. Viele andere Messungen kann sehr hilfreich bei der Identifizierung von Dürre-Stress (z. B. photosynthetische Aktivität, Wurzelwachstum, stomatäre Leitfähigkeit ...), und basierend auf der Art des Schirms, die ausgeführt werden (dh die Anzahl von Keimplasma verwendet, die Anzahl der Wiederholungen, die Geschwindigkeit der Durch gewünschten ...) andere Parameter können einfach in diese Maske eingebracht werden.
Bemerkungen über die Verwendung von Protokoll führt.
Die USDA Sammlung enthält über 4.000 Einzel Salat Keimplasma, das eine Zahl, die Feldversuche unter Einbeziehung aller Keimplasma unpraktisch macht. Dieses Protokoll wurde mit dem freien Zweck, dass eine sehr kleine Zahl von Forschern (1-2 Personen), um die USDA-Kollektionen für potentielle Trockentoleranz Bildschirm entwickelt. Durch den Einsatz dieser Methoden der USDA Sammlung wurde auf 200 Sorten, die dann in Feldversuchen, die Dürre-Stress-Bedingungen genauer zu replizieren kann verwendet werden, wurden verringert. Dieses Protokoll wurde auch verwendet, um eine Population von mehr als 400 Spinat Keimplasma bis 40 zur Verwendung in Feld tria verengenls. Dieses Protokoll allein nicht als ausreichend, mit einem hohen Maß an Sicherheit Keimplasma, die haltbar Dürretoleranz unter Feld Wasser-Stress-Bedingungen enthält identifizieren, sondern einfach als Werkzeug zur schnellen Screening für potenzielle Stresstoleranz unter Wassermangel Bedingungen in ein zu dienen schnelle und effiziente Bildschirm Verwendung einer großen Anzahl von Keimplasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
