Introduction
دراسات التعبير الجيني للخلايا العصبية متباينة في المختبر من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) من قبلنا 1 وغيرها 2،3 تشير إلى أن الخلايا العصبية hiPSC تشبه الجنين بدلا من الكبار أنسجة المخ. في الوقت الحاضر، قد تكون النماذج القائمة hiPSC-أكثر ملاءمة لدراسة الاستعداد ل، بدلا من الميزات في وقت متأخر من، والأمراض العصبية. لقد ذكرت سابقا أن جزءا كبيرا من التوقيع الجيني لفصام الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC يتم حفظها في الفصام الخلايا الاصلية العصبية المشتقة من hiPSC (الشخصيات)، مشيرا إلى أن الشخصيات قد يكون نوع من الخلايا مفيدة لدراسة المسارات الجزيئية المساهمة في الفصام 1 . نحن وغيرنا وأفادت الهجرة الشاذة، وزيادة الإجهاد التأكسدي وأنواع الاكسجين التفاعلية، حساسية للضغوط البيئية عتبة الفرعية وظيفة الميتوكوندريا ضعف في الفصام hiPSC الشخصيات 1،4-6، وكذلك انخفضت العصبية جonnectivity وظيفة متشابك في الخلايا العصبية الفصام hiPSC 5،7-10. إذا كانت العوامل الجزيئية المساهمة في الهجرة الشاذة و / أو الاكسدة في الفصام hiPSC الشخصيات أيضا تكمن وراء اتصال الخلايا العصبية انخفاض في الفصام الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC، يمكن أن تكون الشخصيات السكان العصبي القوي وتنسخي للغاية مع الذي لدراسة الآليات المسؤولة عن المرض. وعلاوة على ذلك، لأن واحدا يمكن أن تولد بسرعة أعداد كبيرة من الخلايا وليس من الضروري الانتظار أسابيع أو أشهر لنضوج الخلايا العصبية، المقايسات مقرها NPC-هي مناسبة لدراسة الأفواج الكبيرة المرضى واكثر سهولة في ارتفاع الفرز الإنتاجية. ونحن نعتقد أن hiPSC الشخصيات يمكن أن تكون بمثابة وكيل لمسارات التنمية المحتمل أن تساهم في التسبب بالمرض، كما سبق أن تظاهروا في اضطرابات متنوعة مثل انفصام الشخصية (1) وهنتنغتون المرض 11.
للتمييز الشخصيات من hiPSCs، العصبية الأولية فيويتم إنجاز الدرفلة الجديد من قبل المزدوج لل Smad تثبيط (0.1MM LDN193189 و 10mm SB431542) 12. عن طريق استعداء BMP و TGF يشير مع هذه الجزيئات الصغيرة، ويتم حظر الأديم الباطن ومواصفات الأديم المتوسط، وتسريع تمايز الخلايا العصبية ويؤدي إلى تشكيل ريدات العصبية واضحة خلال أسبوع واحد من الطلاء. يحدث الزخرفة العصبية في هذه العملية في وقت مبكر، ويفترض خلال فترة تشكيل ريدة العصبي وبعد ذلك مباشرة. في غياب العظة أخرى، تفترض هذه الخلايا العصبية البدائية لمثل الدماغ الأمامي مصير الأمامي 13. مباشرة بعد تشكيل ريدة العصبي، ومستمرة طوال التوسع مجلس الشعب، الشخصيات الدماغ المقدم تستزرع مع FGF2 8،14. لديهم إمكانات النسب المزدوجة، ويمكن أن تكون متباينة للسكان العصبي من 70-80٪ الخلايا العصبية III-تويولين إيجابية و20-30٪ ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) النجمية -positive (الشكل 1). الغالبية العظمى من الخلايا العصبية الدماغ الأمامي hiPSC هي-VGLUT1 إيجابية، وهكذا هي يفترض glutamatergic، على الرغم من أن ما يقرب من 30٪ من الخلايا العصبية هي-GAD67 الموجب (GABAergic) 8.
الشخصيات و passaged بشكل روتيني أكثر من عشر مرات في المختبر، مع الحفاظ على ملامح التمايز متسقة، وبدون تراكم التشوهات النمط النووي. وذكرت جماعات الشخصيات الركض أكثر من 40 مرة 15، ومع ذلك، نجد أن وراء عشر الممرات والشخصيات تظهر زيادة الميل للنجمية التمايز. الشخصيات جيدا يتسامح متعددة تجميد يذوب ويمكن تحويلها لزراعة كما neurospheres ببساطة عن طريق زراعة في لوحات غير ملتصقة. وtransduced الشخصيات بكفاءة عن طريق النواقل الفيروسية، التي تمكن من تقييم سريع للعواقب الجزيئية والخلوية من اضطراب وراثي، وقابلة للتوسيع بسهولة لانتاج مادة كافية للدراسات كيميائية حيوية. وعلاوة على ذلك، لأن ناقلات فيروسية قوية تسمح الإفراط في التعبير و / أو ضربة قاضية للجينات الأمراض ذات الصلة، في أي سيطرة أو المريض المستمدة neurخلايا القاعدة ويمكن للمرء أن استخدام هذه المنصة لاختبار تأثير الخلفية الوراثية على هذه التلاعبات. وإن لم تكن مناسبة لمتشابك أو فحوصات على أساس النشاط التي تتطلب الخلايا العصبية الناضجة، قد الشخصيات يكون بديلا عمليا لكثير من التحليلات الجزيئية أو البيوكيميائية واضحة من الخلايا المشتقة من المريض العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hiPSC التمايز إلى خلايا العصبية السلف
- النمو والتوسع hiPSCs في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HES) وسائل الاعلام (الجدول 1) شارك في تربيتها على الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEF) طبقة المغذية حتى كبيرة (ولكن subconfluent) مستعمرات جاهزة للالتمايز العصبي عن طريق هيئة مضغي الشكل (EB) وسيطة (الشكل 2). ووصف الظروف الروتينية ثقافة hiPSC جيدا في أماكن أخرى 16،17. لفترة وجيزة، وتنمو hiPSCs في وسائل الإعلام HES على طبقة المغذية MEF حتى متموجة، والمرور ثم إنزيمي مع كولاجيناز (1mg / مل في DMEM) وتوسيع ما يقرب من 1: 3 كل 7 أيام.
- لإعداد بولي-L-الأورنيثين / laminin لوحات مغلفة، لوحات معطف مع 10 غرام / مل بولي-L-الأورنيثين في الماء المعقم للأسطح البلاستيك (50 غ / مل للأسطح الزجاج)، واحتضان في RT ل3-24 ساعة. يغسل مرة واحدة على الأقل مع الماء المعقم ثم معطف مع 5G / مل Laminin في برنامج تلفزيوني العقيمة في RT ل3-24 ساعة.
ملاحظة: إذا ملفوفة في البلاستيك، لوحات يمكن أن يكونتخزينها لمدة تصل إلى ستة أشهر عند -20 درجة مئوية. - في يوم 1، ورفع إنزيمي hiPSCs subconfluent (نمت بشكل عام على MEFS، أو hiPSCs نمت في وسائل الاعلام محددة مثل TeSR 18 على Matrigel) من لوحة مستعمرات كبيرة مثل استخدام 1mg / مل كولاجيناز الرابع في DMEM / F12.
ملاحظة: بعد 1-2 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، المستعمرات سيتم يتحرك في الطبق. - غسل بلطف المستعمرات hiPSC (عن طريق تسوية، وليس الطرد المركزي) 1-2x مع DMEM / F12، resuspend في 2ML / بئر N2 / وسائل الإعلام B27 (الجدول 1) ونقل إلى أطباق غير ملتصقة 6 جيدا (الجمع بين 3 آبار في 1 حسنا) (19).
ملاحظة: بين عشية وضحاها، والمستعمرات تشكل العائمة تجمعات كروية وصفته "الهيئات مضغي الشكل" (EBS). نتوقع الموت الخلوي كبير. - في يوم 2، لوحات الميل والسماح لتسوية EBS. إزالة بعناية وسائل الإعلام، ويغسل مرة واحدة مع DMEM / F12 لإزالة الحطام. تغذية مع N2 / B27 وسائل الإعلام تستكمل مع مثبطات لل Smad المزدوجة (0.1M LDN193189 و10M SB431542) 12
- على أيام 3-7، سيحدث neuralization في سياق ثنائي تثبيط لل Smad. تأكد من أن EBS هي مستديرة ولكن ليس الكيسي. تغذية EBS كل يوم الثاني مع وسائل الإعلام N2 / B27 تستكمل مع 0.1M LDN193189 و10M SB431542.
- في أيام 7-14، بعد الطلاء من EBS لبولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحات المغلفة، تحقق باستخدام المجهر brightfield أن ريدات العصبية تبدأ في الظهور في غضون بضعة أيام (وصفها بأنها مجموعات من خلايا عصبية ظهارية مستديرة مع apico القاعدية قطبية. الشكل 1). تواصل تغذية EBS ملتصقة كل يوم الثاني مع N2 / B27 وسائل الإعلام تستكمل مع 0.1M LDN193189، 10M SB431542 و 1 غرام / مل laminin.
2. حصاد العصبية ريدات
ملاحظة: نوصي بأن ريدات العصبية أن تحصد إنزيمي باستخدام العصبية روزيت اختيار الكاشف 20 أو كاشف اختيار مماثل. على الرغم ريدات العصبية يمكن التقاطها يدويا في 6 جيدا بولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحة المغلفة، ثيالصورة منهجية تأخذ تدريبا مكثفا لسيده، وتعتمد على مهارة المستخدم، قد تحتاج إلى الجولة الثانية من قطف في يوم 20 إلى إثراء للالشخصيات وتستنزف أنواع الخلايا غير العصبية.
- لاختيار الأنزيمية من ريدات العصبية في اليوم 14، وسائل الإعلام نضح من EBS الالتزام وإضافة 1 مل من كاشف العصبي اختيار ردة لكل بئر لوحة 6 جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- مع pipetman P1000، وإزالة بلطف الانزيم من كل بئر. إضافة 1 مل من DMEM / F12 لكل بئر لغسل.
- مع P1000، وجمع 1 مل من DMEM / F12 وسرعان ما طرد DMEM / F12 مرة أخرى إلى البئر، وبالتالي فصل وريدات من لوحة. جمع ريدات في أنبوب الصقر.
- الماصة 1 مل أخرى من DMEM / F12 وسرعان ما طرد في نفس البئر لفصل ريدات المتبقية. (لا يسحن. حاول أن لا تفريق المجاميع ردة). جمع ريدات العصبية في نفس أنبوب الصقر.
- كرر الخطوة 2.4 الضرورة. إذا ريدات لا فصل بسهولة، إضافة موإعادة انزيم وتكرار هذه العملية (الخطوات 2،1-2،4)
- تدور الخلايا في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح غسل، وإعادة تعليق ريدات في 2 مل من مجلس الشعب وسائل الإعلام (الجدول 1). نقل الخلايا (1: 1) في بولي-L-الأورنيثين / Laminin المغلفة 6 لوحة جيدا.
- من يوم 15-21، فإن ريدات العصبية التوسع؛ ريدات تغذية كل يوم الثاني مع وسائل الإعلام مجلس الشعب.
- تقييم جودة ريدات العصبية والتأكد من أن خلايا تشبه الخلايا الليفية مسطحة لا تتوسع داخل الثقافة.
ملاحظة: إذا استمرت غير ريدات، ثقافة NPC يمكن في بعض الأحيان إنقاذه من قبل قطف اليدوي، واختيار أفضل فقط من ريدات التقطت في Accutase. فصل 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بيليه، وغسل وصفيحة في وسائل الإعلام مجلس الشعب على 24 جيدا بولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحة المغلفة.
3. التوسع في الخلايا العصبية السلف
ملاحظة: hiPSC الشخصيات يمكن زراعتها على أي Matrigel- أو بولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحات المغلفة. نحن عادة استخدام Matrigeل-لوحات لأنها يمكن أن تكون مستعدة بشكل أسرع وبتكلفة أقل.
- لإعداد لوحات Matrigel المغلفة، وبسرعة ذوبان الجليد و resuspend قسامة المجمدة 1mg من Matrigel في 24 مل الباردة DMEM / F12 وتوزيعها على الفور 2 مل إلى كل بئر من اثنين من لوحات ستة جيدا. احتضان لمدة 1 ساعة على الأقل في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: Matrigel يحتاج فقط إلى أن يستنشق، وليس غسلها، مباشرة قبل الاستعمال. - تغذية الشخصيات كل يوم الثاني على التوالي والحفاظ على كثافة عالية جدا أو أنها سوف تفرق تلقائيا إلى الخلايا العصبية.
ملاحظة: على الرغم من الشخصيات الأكثر رسوخا عادة تقسيم 1: 4 كل أسبوع، الشخصيات مرور منخفضة جدا يمكن تقسيم 1: 2 ونادرا ما مرة واحدة كل أسبوعين. - لتقسيم والإعلام نضح الأولى وإضافة 1 مل دافئ Accutase (1X) لكل بئر من لوحة 6 جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
- بلطف نقل خلايا منفصلة في أنبوب 15 مل تحتوي على DMEM / F12 مع إجهاد أقل قدر ممكن. لا يعاير خلايا بينما في الانزيم. خلايا بيليه بواسطة spinniنانوغرام في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح غسل، واعادة تعليق الشخصيات في ~ 1 مل سائل الإعلام NPC لكل بئر الأصلي من 6 جيدا.
ملاحظة: نتوقع أن بئر متموجة من صحن 6 جيدا ديه مليون 5-10 خلايا. هذا ويمكن التأكد عن طريق عد قسامة 10L من الخلايا باستخدام عدادة الكريات مسبق لإعادة الطلاء. - وبعد اعادة تعليق، الشخصيات إعادة لوحة كما الشخصيات، الخلايا العصبية أو neurospheres. للحفاظ على الشخصيات، لوحة حوالي 1-2000000 خلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا. كفاءة تشكيل neurosphere يمكن أن تختلف بين التجارب وخطوط الخلايا، ولكن يحدث عادة أفضل إذا هي المصنفة بين 200،000 و 1،000،000 خلايا لكل بئر من غير ملتصقة وحة 6 جيدا. إذا حدث التثاقل من neurospheres، والحد من عدد الخلايا المصنف. التفريق إلى الخلايا العصبية، لوحة حوالي 200،000 الخلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا، لتحل محل وسائل الإعلام مجلس الشعب مع وسائل الاعلام الخلية العصبية.
- Immunohistochemically التحقق من صحة كل سطر مجلس الشعب المقررة. مرة واحدة وكانت المواد الخلوية كافية EXPANدائرة التنمية الاقتصادية، الشخصيات التسمية مع الأجسام المضادة للNESTIN وSOX2. كما ينبغي التفريق بين خطوط المصادق عليها مجلس الشعب في الخلايا العصبية لمدة 4-6 أسابيع، وصفت مع الأجسام المضادة للIII-تويولين وMAP2AB.
- إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني في 4C لمدة 10 دقيقة. Permeabilize الشخصيات في RT لمدة 15 دقيقة في 1.0٪ تريتون في برنامج تلفزيوني، ومن ثم منع في 5٪ المصل حمار مع 0.1٪ تريتون في RT لمدة 30 دقيقة.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في 5٪ المصل حمار مع 0.1٪ تريتون، بين عشية وضحاها في 4C.
ملاحظة: نوصي الأجسام المضادة التالية: الماعز المضادة للSox2، 1: 200. Nestin الماوس مكافحة الإنسان، 1: 200. أرنب مكافحة βIII تويولين، 1: 500. الماوس مكافحة βIII تويولين، 1: 500. الماوس المضادة للMAP2AB، 1: 200. (الشكل 2). - بعد غسل مع PBS، واحتضان خلايا الأجسام المضادة الثانوية مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق المناسبة لالماعز، والماوس أو أرنب في 1: 300، في في 5٪ مصل حمار مع 0.1٪ تريتون لمدة 1-2 ساعة على RT. لتصور النوى، وخلايا وصمة عار مع 0.5 ميكروغرام / مل دابي (4 '6-diamidino-2-phenylindole) ثم جبل مع Vectashield.
4. مجلس الشعب تنبيغ
- استخدام spinfection (الطرد المركزي لوحات زراعة الخلايا في وجود الفيروس في 1،000 x ج لمدة 1 ساعة) لزيادة نسبة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل 21. وسائل الإعلام نضح واستبدال overexpression ذات الصلة (أو السيطرة) lentiviruses (أو الفيروسات القهقرية)، titered لتعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) (عادة 1-10)، مخففة في وسائل الإعلام مجلس الشعب. استخدام 1.5 مل حجم لكل بئر من لوحة 6 جيدا (أو حجم تحجيمها بشكل مناسب لأنواع أخرى من لوحات زراعة الأنسجة). تدور في 1،000 x ج و 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في لوحة أجهزة الطرد المركزي.
ملاحظة: من الناحية المثالية، تنبيغ الشخصيات مع lentiviral أو ناقلات فيروسات في غضون 1-2 أيام من تقسيم. سواء باستخدام الفيروسات التجارية أو إعداد المختبر، ويمكن ان يكون من المفيد عيار بشكل مناسب دفعات من الفيروس في وقت مبكر عن طريق التخفيف المتسلسل. (الشكل 3). - للحد من سلالموت lular، استبدال وسائل الإعلام في غضون 8 ساعة من spinfection.
ملاحظة: التكامل الفيروسية والتحوير التعبير يجب أن تكون قابلة للكشف خلال 24 ساعة من قبل مضان مراسل الجين. (إذا كان الفيروس يفتقر مراسل الفلورسنت، وهذا هو أكثر صعوبة لتقييم، ويمكن أفضل ترنسفكأيشن ناجحة يتم التصديق عليها من قبل طخة مناعية، المناعية أو QPCR للمنتجات overexpression.) التعبير كامل قد يستغرق 3-7 أيام؛ قد تكون هناك حاجة spinfections المتكررة بفيروس إضافي لزيادة نسبة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. يمكن أن يحدث spinfections المتكررة يوميا ولكن لا يلزم أن يكون تكرارا لذلك. من الناحية المثالية، إذا كان استخدام مراسل الفلورسنت،> يجب أن يكون المسمى 80٪ من الخلايا.
5. Neurosphere الهجرة الفحص
ملاحظة: Neurospheres شكل عفوي، في أعقاب تفكك الأنزيمية من الشخصيات (بواسطة بطريقة مماثلة لتلك المستخدمة في التوسع مجلس الشعب - خطوات 3،3-3،6)، إذا الخلايا المستزرعة في تعليق في وسائل الإعلام مجلس الشعب.
- لفترة وجيزة، وتنمو فصلد الشخصيات في وسائل الإعلام مجلس الشعب لمدة 48 ساعة في لوحات غير ملتصق من أجل توليد neurospheres. (الشكل 4).
- للهجرة neurosphere، وإعداد لوحات Matrigel جديدة باستخدام وسائل الإعلام NPC الباردة، بدلا من DMEM، في لوحة 96-جيدا، 1-2 ساعة قبل neurosphere قطف. لا نضح Matrigel من الآبار.
- كما نشرت أصلا لالجذعية الجنينية المستمدة من الخلايا neurospheres 22، واختيار يدويا neurospheres مجلس الشعب المستمدة من تحت المجهر، بعد غسل مرة واحدة في وسائل الإعلام للمجلس الوطنى لإزالة الحطام الخلوي. نقل neurosphere واحدة على كل جانب من Matrigel المغلفة لوحة 96-جيدا.
- إضافة 0.5 ملغ إضافي Matrigel، مخففة في وسائل الإعلام NPC البرد، إلى neurospheres في كل لوحة 96-جيدا.
- تركز يدويا في كل neurosphere الفردي في منتصف البئر باستخدام طرف الماصة.
ملاحظة: من المهم أن يلتقط neurospheres مشابهة من حيث الحجم، من أجل الحد من التباين في النتائج. - السماح الهجرة تحدث لمدة 48 ساعة ومن ثم إصلاح خلايا ثإيث 4٪ امتصاص العرق وصمة عار مع علامات المناعى المرجوة.
- إذا الهجرة الشعاعية هي أن تحدد، neurospheres صورة في حياتهم تماما باستخدام الهدف 4X المجهر. استبعاد أي neurospheres الاتصال حافة البئر أو neurosphere الثاني من التحليل.
ملاحظة: في حالة حدوث الهجرة لمدة أطول من 48 ساعة، سوف ينتج عنها من الهجرة شعاعي من المرجح أن تكون كبيرة جدا لصورة باستخدام الهدف 4x و. - قياس متوسط الهجرة من كل neurosphere باستخدام NIH يماغيج البرمجيات (الشكل 5). ويمكن القيام بذلك باستخدام أي من أساليب التحليل هو موضح أدناه:
- الهجرة شعاعي:
- تتبع حافة الخلايا أبعد المهاجرة باستخدام أداة التحديد مرفوعة ثم استخدام مقياس (السيطرة + M) وظيفة لحساب مساحة الشكل الناتج يدويا. قبل قياس مساحة تأكد من أن المساحة محددا في مجموعة القياسات نافذة وجدت تحت علامة التبويب تحليل. استخدامقيمة قياس المنطقة والمعادلة لمساحة الدائرة (A = πr 2) لتحديد دائرة نصف قطرها (الخارجي).
- تتبع حافة neurosphere الأصلي، وقياس وحساب مساحة دائرة نصف قطرها (الداخلي) بنفس الطريقة. حساب مجموع الهجرة شعاعي بالفرق بين أنصاف أقطار الخارجي والداخلي.
- أعظم الهجرة الخلوية:
- قياس المسافة انتقلت من أبعد خلايا خمسة من حافة neurosphere الداخلي باستخدام أداة التحديد القسط الثابت تليها قياس (السيطرة + M) وظيفة.
- الهجرة شعاعي:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن تحديد ريدات العصبية شكليا، وذلك باستخدام المجهر brightfield، من خلال مظهرها المميز في شكل مجموعات جولة من خلايا عصبية ظهارية مع apico القاعدية قطبية (الشكل 1). على الرغم من الشخصيات تستزرع عادة في كثافة الخلايا عالية جدا، وذلك مباشرة بعد الركض، قليلا سوما هرمي الشكل والهيكل Neurite النوعي القطبين مرئيا (الشكل 1D). الشخصيات التحقق من صحة تعبر عن NESTIN وSOX2 في معظم الخلايا، على الرغم III-تويولين تلطيخ هو أيضا واضحة في جميع السكان مجلس الشعب، مشيرا إلى أن بعض نسبة الشخصيات وتبادر باستمرار تمايز الخلايا العصبية داخل الثقافة (الشكل 1F). علامات الخلايا الجذعية العصبية، مثل SOX2 وPAX6، والدماغ الأمامي الأسلاف العصبية، مثل TBR2، يتم التعبير أيضا في اللجان التحضيرية الوطنية، في حين أن علامات الدماغ المتوسط مثل LMX1A وFOXA2 ليست (الشكل 1G-I). وهناك نسبة كبيرة من خلايا تشبه الخلايا الليفية الكبيرة ومسطحة داخل يدل على وجود سكان NPC أن الشخصيات ذات نوعية رديئة تم إنشاء، والتي من غير المرجح أن تسفر عن أعداد كبيرة من الخلايا العصبية التالية تمايز الخلايا العصبية (الشكل 2).
وبعد التنبيغ ناجحة مع lentiviral عالية عيار أو ناقلات فيروسات، يجب أن يكون المسمى أكبر من 80٪ من الخلايا عن طريق مراسل الفلورسنت المدرجة في ناقلات (الشكل 3). الجيل Neurosphere يجب أن تسفر عن سكان neurospheres من حجم متجانسة نسبيا (الشكل 4)، والتي، مع التغذية العادية، يمكن أن تبقى في صحة جيدة في الثقافة لمدة أسبوع تقريبا. يحدث الهجرة Neurosphere بقوة في neurospheres صحي (الشكل 5)، والشخصيات hiPSC الخضوع التمايز السريع أثناء سير neurosphere الهجرة الفحص 1.
الشكل 2. التحقق من صحة خطوط NPC جودة عالية (أعلى اليسار) hiPSC الشخصيات NESTIN صريحة (أحمر) وSOX2 (الخضراء). في معظم الخلايا (نوى ملطخة دابي (الأزرق))، في حين أن جودة منخفضة (في أسفل اليسار) الشخصيات ديك بقع من خلايا SOX2 سلبية وNESTIN سلبية (يمين). الخلايا العصبية القديمة 4 أسابيع متباينة من الشخصيات ذات جودة عالية تعبر عن MAP2AB (الخضراء) وIII تويولين (أحمر) (أعلى اليمين)، ولكن تلك متباينة من الشخصيات ذات جودة منخفضة لا (أسفل اليمين). 100X، ومقياس شريط 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هاء أكبرrsion من هذا الرقم.
الشكل 3. الفيروسية تنبيغ من الشخصيات. Brightfield (أعلى) والفلورسنت GFP (القاع) صور hiPSC الشخصيات قبل (يسار) وبعد spinfection الفيروسي. 100X، ومقياس شريط 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. Neurosphere تشكيل. صور Brightfield من الشخصيات ملتصقة (يسار) وneurospheres شكلت حديثا (يمين). 100X، ومقياس شريط 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض لارنسخة الالماني من هذا الرقم.
الرقم 5. Neurosphere هجرة. AB. الصور Brightfield من neurospheres قبل (A) وبعد (B) 48 ساعة للهجرة في Matrigel. 100X، شريط نطاق 100 ميكرون. CG. التقاط الصور الشاشة مما يدل على منهجية لتحليل الهجرة شعاعي العصبية باستخدام برنامج NIH يماغيج. انقر على 'التحديدات مرفوعة "على شريط الأدوات يماغيج (C). تتبع حافة الخلايا أبعد هاجرت حول neurospheres (D). تأكد من أن المساحة محددا في إطار مجموعة القياسات (E). استخدام وظيفة قياس (السيطرة + M) (F). تتبع حافة neurospheres الأصلي (G) واستخدام وظيفة قياس (على Ctrl + M). ويمكن بعد ذلك القياسات التي يتم تصديرها إلى إكسل لتحليلها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| وسائل الإعلام | مكونات |
| وسائل الإعلام HES | DMEM / F12 (لايف تكنولوجيز # 11330) |
| 20٪ استبدال KO-سيروم (لايف تكنولوجيز # 10828) | |
| 1X Glutamax (الحياة تكنولوجيز # 35050) | |
| 1X NEAA (الحياة تكنولوجيز # 11140) | |
| 1X 2-المركابتويثانول (55MM 1000X) (الحياة تكنولوجيز # 21985-023) | |
| 20ng / مل FGF2 (لايف تكنولوجيز 13256-029) | |
| وسائل الإعلام N2 / B27 | DMEM / F12 (لايف تكنولوجيز # 10565) |
| 1X N2 (الحياة تكنولوجيز # 17502-048) | |
| 1X B27-RA (الحياة تكنولوجيز # 12587-010) | |
| وسائل الإعلام مجلس الشعب | DMEM / F12 (لايف تكنولوجيز # 10565) |
| 1X N2 (الحياة تكنولوجيز # 17502-048) | |
| 1X B27-RA (الحياة تكنولوجيز # 12587-010) | |
| 20 نانوغرام / مل FGF2 (تكنولوجيا الحياة) | |
| 1 ملغ / مل الطبيعية ماوس Laminin (لايف تكنولوجيز # 23017-015) | |
| وسائل الاعلام الخلايا العصبية | DMEM / F12 (لايف تكنولوجيز # 10565) |
| 1X N2 (الحياة تكنولوجيز # 17502-048) | |
| 1X B27-RA (الحياة تكنولوجيز # 12587-010) | |
| 1 ملغ / مل الطبيعية ماوس Laminin (تكنولوجيا الحياة) | |
| 20 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية (Peprotech # 450-02) | |
| 20 نانوغرام / مل GDNF (Peptrotech # 450-10) | |
| 500 ميكروغرام / مل Dibutyryl دوري-AMP (سيغما # D0627) | |
| 200 نانومتر حمض L-الاسكوربيك (سيجما # A0278) |
الجدول 1. وسائل الإعلام وصفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفناها الطرق التي يمكن من خلالها تمييز hiPSCs في اللجان التحضيرية الوطنية، وهو نوع من الخلايا العصبية التي يتم حفظها جزءا كبيرا من التوقيع الجيني للخلايا العصبية hiPSC المشتقة والتي قد تكون بمثابة وكيل لمسارات التنمية المحتمل أن تساهم في التسبب بأمراض 8، 11. بالإضافة إلى ذلك، كما قمنا بالتفصيل، الشخصيات هي السكان العصبي تنسخي بقوة وtransduced بسهولة، والتي نعتقد أنها قد تكون مناسبة للدراسات الجزيئية والكيمياء الحيوية من الاستعداد المرض.
رغم ان لدينا طرق مفصلة للتمييز والثقافة الشخصيات نقوش الدماغ الأمامي، فإنها يمكن أن تتكيف بسهولة لتوليد الشخصيات نمط لمصير الخلايا الأخرى. على سبيل المثال، إذا تم علاجها EBS العائمة لأول مرة مع 0.5 ملغ / مل DKK1، 10 ملي SB431542، 0.5 ملغ / مل رأس وسايكلوبامين 1MM، سيتم إنشاء الشخصيات قرن آمون والتي يمكن توسيعها في وسائل الإعلام مجلس الشعب ومتباينة في وسائل الإعلام العصبية تستكمل مع 20 نانوغرام / مل WNT3A 7 12،23. وبالنظر إلى أن البروتوكولات تمايز الخلايا العصبية المحددة معظم النوع الفرعي المضي قدما عبر NESTIN- وSOX2 الفعل positve سيطة، ونتوقع أن أساليب مماثلة قد تكون قابلة للتكيف لGABAergic- 2،24 وglutamatergic- 3،25،26 فئات معينة من السكان NPC.
هناك العديد من الخطوات الهامة ضمن بروتوكول الجدير بالذكر. أولا، إذا كان الإفراط في التعبير أو هدمت الذاتية التعبير الجيني، فمن الأفضل لاستخدام ناقلات تحكم معربا عن بروتين فلوري من نفس العمود الفقري الفيروسي، كما لاحظنا اختلافات كبيرة في تنوير عندما يتم التعبير عن صحفيين من ناقلات أحجام متغير (بسبب إلى انخفاض كفاءة التعبئة والتغليفمع حجم ناقلات) أو مع المروجين الفرق (بسبب الاختلافات في كفاءة المروج). ثانيا، نحن نوصي استكمال تنبيغ الفيروسية قبل neurosphere تشكيل، كما لاحظنا سوء انتفاذ من ناقلات فيروسية في هيكل neurosphere كثيفة. ثالثا، حيث وصل عدد مرور الزيادات الشخصيات وراء مرور عشر سنوات، ونحن غالبا ما نلاحظ ضعف كبير الهجرة في مقايسة neurosphere. في الواقع، نظرا لنزوع اللجان التحضيرية الوطنية لانتاج نسبة أكبر من الخلايا النجمية مع مرور، من الأهمية بمكان لتتناسب مع مرور خطوط NPC في كل تجربة.
وأخيرا، من المهم النظر في القيود البيولوجية والتقنية من التقنيات وصفها. على الرغم من ظهور الشخصيات لتكون مشابهة شكليا بالعين، فهي السكان غير متجانسة تتألف من خلايا قادرة على توليد كلا glutamatergic والخلايا العصبية GABAergic. بينما نلاحظ متسقة بشكل ملحوظ الدماغ الأمامي الزخرفة خطوط NPC بين الأفراد الذين يستخدمون هذه methoد 1، وهذا هو فقط عند مقارنة التحقق من صحتها تماما خطوط NPC جودة عالية - هناك اختلافات كبيرة بين خطوط نوعية جيدة مجلس الشعب والفقيرة. بالإضافة إلى ذلك، والمحاصيل تنبيغ الفيروسية وراثيا الخلايا غير متجانسة، ولكل منها عبارة عن دمج للناقلات فيروسية في موقع الجيني فريدة؛ وبالتالي، فإن الخلايا الفردية تختلف سواء في الموقع وعدد من المواقع التكامل الجينومية. سوف تغييرات أكثر اتساقا في التعبير الجيني يحدث دائما عندما يتم استهداف التلاعب الجيني إلى الموقع الدقيق ومحددة، سواء كان يحدث بواسطة الإصبع الزنك، TALEN أو الاستراتيجيات القائمة على كريسبر.
hiPSC المستمدة الشخصيات المريض يمكن استخدامها لدراسة كل من الاضطرابات التعبير الجيني العالمية التي تحدث في الأمراض العصبية وكذلك / أو الآثار الجزيئية والخلوية من التلاعب الجينات مرشح أو الرنا الميكروية في سياق إما الخلايا السليمة أو المريضة المستمدة من المريض العصبية. وبهذه الطريقة، فإن العواقب بالتلاعب واحد أو أكثر من مفتاحيمكن وصف أليل خطر (ق) في سياق خلفيات وراثية مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1 mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent |
| Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
| mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
| rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
| mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
| mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
| Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |
References
- Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
- Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
- Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
- Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
- Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
- An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
- Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
- Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
