Introduction
Estudios de expresión génica de las neuronas diferenciadas in vitro a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) por nosotros 1 y otros 2,3 indican que las neuronas hiPSC asemejan fetal en lugar de adultos tejido cerebral. En la actualidad, los modelos basados en hiPSC pueden ser más apropiados para el estudio de la predisposición a, en lugar de características tardía de la enfermedad neurológica. Hemos informado anteriormente de que una fracción significativa de la firma genética de las neuronas hiPSC derivado de la esquizofrenia se conserva en las células esquizofrenia hiPSC derivados neurales progenitoras (NPC), indicando que NPC puede ser un tipo de célula útil para estudiar las vías moleculares que contribuyen a la esquizofrenia 1 . Nosotros y otros han informado de la migración aberrante, aumento del estrés oxidativo y las especies reactivas de oxígeno, la sensibilidad a las tensiones ambientales sub-umbral y la función mitocondrial alterada en la esquizofrenia hiPSC NPC 1,4-6, así como una disminución c neuronalonectividad y la función sináptica en las neuronas hiPSC esquizofrenia 5,7-10. Si los factores moleculares que contribuyen a la migración aberrante y / o el estrés oxidativo en la esquizofrenia hiPSC NPCs también subyacen a la conectividad neuronal reducida en las neuronas hiPSC derivado de la esquizofrenia, NPC podrían ser una población neuronal robusta y altamente replicativa con el que estudiar los mecanismos responsables de la enfermedad. Además, porque se puede generar rápidamente un gran número de células y no es necesario esperar semanas o meses para la maduración neuronal, ensayos basados en NPC son adecuados para el estudio de grandes cohortes de pacientes y son más susceptibles de cribado de alto rendimiento. Creemos que hiPSC NPCs puede servir como sustituto de las vías de desarrollo que posiblemente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad, como ya se ha demostrado en los trastornos tan diversos como la esquizofrenia 1 y la enfermedad de Huntington 11.
Para diferenciar los NPCs de hiPSCs, neural inicial enla producción se lleva a cabo por doble SMAD inhibición (0,1 mM y 10 mM LDN193189 SB431542) 12. Por antagonizar BMP y TGF señalización con estas pequeñas moléculas, endodermo y mesodermo especificación está bloqueada, la aceleración de la diferenciación neuronal y que conduce a la formación de rosetas neuronales visibles dentro de una semana de la siembra. Patrón Neural se produce temprano en este proceso, presumiblemente durante el período de formación de rosetas neural e inmediatamente después. A falta de otros indicios, estas células nerviosas primitivas suponen un-cerebro anterior como el destino anterior 13. Inmediatamente después de la formación de rosetas neural, y continua a lo largo de la expansión de la APN, NPCs del cerebro anterior se cultivan con FGF2 8,14. Tienen potencial linaje dual y se pueden diferenciar de las poblaciones neuronales del 70-80% neuronas III-tubulina-positivas y 20-30% de proteína ácida glial fibrilar (GFAP) -positivos astrocitos (Figura 1). La mayoría de las neuronas del cerebro anterior hiPSC son VGLUT1-positivo, Y también lo son presumiblemente glutamatérgica, aunque aproximadamente el 30% de las neuronas son GAD67-positivo (GABAérgicas) 8.
NPC se pasan rutinariamente más de diez veces in vitro, mientras que el mantenimiento de los perfiles de diferenciación consistentes, y sin acumular anomalías del cariotipo. Los grupos han reportado NPCs pases más de 40 veces 15, sin embargo, nos encontramos con que más allá de diez pasajes, NPCs muestran una mayor propensión a la diferenciación de los astrocitos. NPCs bien tolera múltiples congelaciones deshielos y puede ser la transición a crecer como neuroesferas simplemente cultivando en placas no adherentes. NPCs son transducidas eficientemente por vectores virales, lo que permite una rápida evaluación de las consecuencias moleculares y celulares de la perturbación genética, y fácilmente ampliable para producir suficiente material para estudios bioquímicos. Además, porque los vectores virales permiten robusta sobre-expresión y / o desmontables de genes relevantes de la enfermedad, ya sea en el control o paciente derivada neurcélulas de Al, se puede utilizar esta plataforma para probar el efecto de los antecedentes genéticos de estas manipulaciones. Aunque no es adecuado para sináptica o ensayos basados en actividades que requieren las neuronas maduras, NPCs puede ser una alternativa práctica para muchos análisis moleculares o bioquímicos directas de las células neuronales derivadas del paciente.
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Protocol
1. hiPSC Diferenciación de células progenitoras neurales
- Crecer y expandirse hiPSCs en células madre embrionarias humanas (HES) medios de comunicación (Tabla 1) co-cultivadas en un fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) capa alimentadora hasta grandes (pero subconfluentes) colonias están listos para la diferenciación neural a través de un cuerpo embrioide (EB) intermedia (Figura 2). Condiciones de rutina cultura hiPSC están bien descritas en otra parte 16,17; Brevemente, hiPSCs crecer en medios de HES en una capa de alimentación MEF hasta la confluencia, el paso entonces enzimáticamente con colagenasa (1 mg / ml en DMEM) y ampliar aproximadamente 1: 3 cada 7 días.
- Para preparar placas recubiertas de poli-L-ornitina / laminina, placas de capa con 10 g / ml de poli-L-ornitina en agua estéril para superficies de plástico (50 g / ml para las superficies de vidrio) y se incuba a temperatura ambiente durante 3-24 horas. Lavar al menos una vez con agua estéril y luego cubra con 5 g / ml laminina en PBS estéril a temperatura ambiente durante 3-24 horas.
NOTA: Si envuelto en plástico, placas pueden seralmacenada durante hasta seis meses a -20 ºC. - En el Día 1, enzimáticamente levantar hiPSCs subconfluentes (generalmente cultivadas en MEFs, o hiPSCs cultivadas en medios definidos, tales como TeSR 18 en Matrigel) de la placa como grandes colonias utilizando 1 mg / ml de colagenasa IV en DMEM / F12.
NOTA: Después de 1-2 h de incubación a 37 ºC, las colonias se flotando en el plato. - Lave suavemente colonias hiPSC (por decantación, la centrifugación no) 1-2x con DMEM / F12, volver a suspender en 2 ml / pocillo de N2 / media B27 (Tabla 1) y la transferencia a los platos no adherente de 6 pocillos (combinar 3 pozos en 1 -bueno) 19.
NOTA: Durante la noche, las colonias se formarán grupos esféricas flotantes denomina "cuerpos embrionarios" (EBS). Esperar la muerte celular sustancial. - En el día 2, las placas de inclinación y permita EBS se asiente. Retire con cuidado los medios de comunicación y lavar una vez con DMEM / F12 para eliminar los residuos. Alimentar con N2 / B27 medio suplementado con inhibidores de Smad duales (0,1 M LDN193189 y 10M SB431542) 12
- En los días 3-7, neuralization se producirá en el contexto de la inhibición SMAD dual; comprobar que los OC son redondos pero no quística. Alimente EBS cada segundo día con los medios de comunicación N2 / B27 suplementado con 0,1 M LDN193189 y 10M SB431542.
- En los días 7-14, después de chapado de EBS a la poli-L-ornitina / laminina placas recubiertas, comprobar usando un microscopio de campo claro que rosetas neurales comienzan a aparecer dentro de unos pocos días (caracterizado como racimos redondos de células neuroepiteliales con la polaridad-apico basal; la Figura 1). Continuar para alimentar EBS adherentes cada segundo día con los medios de N2 / B27 suplementado con 0,1 M LDN193189, 10M SB431542 y 1 g / ml de laminina.
2. Cosecha de Neural Rosetas
NOTA: Se recomienda que rosetas neuronales pueden cosechar enzimáticamente usando Neural Rosette Selección Reactivo 20 o reactivo de selección similar. Aunque rosetas neuronales pueden ser recogidos manualmente en 6 pocillos de poli-L-ornitina / laminina placa recubierta, thimetodología s lleva una amplia formación de dominar, y, dependiendo de la habilidad del usuario, puede requerir una segunda ronda de recoger en el día 20 para enriquecer aún más para NPCs y agotar tipos de células no neuronales.
- Para la selección enzimática de rosetas neuronales en el día 14, los medios de aspirado de EBS adheridas y añadir 1 ml de reactivo neuronal selección roseta por pozo de una placa de 6 pocillos. Se incuba a 37 ºC durante 1 hora.
- Con un Pipetman P1000, retire con cuidado la enzima de cada pocillo. Añadir 1 ml de DMEM / F12 por pocillo de lavar.
- Con un P1000, recoger los 1 ml de DMEM / F12 y rápidamente expulsar al DMEM / F12 de nuevo en el pozo, separando así los rosetones de la placa. Recoge las rosetas en un tubo Falcon.
- Pipetear otro 1 ml de DMEM / F12 y expulsar rápidamente en el mismo pozo para separar restantes rosetas. (No se tritura. Trate de no romper los agregados de roseta). Recoge las rosetas neuronales en mismo tubo Falcon.
- Repita el paso 2.4, según sea necesario. Si rosetas no se desprenden fácilmente, añadir more enzima y repetir el proceso (pasos 2.1 a 2.4)
- Girar las células a 300 xg durante 3 min. Aspirar el lavado, y volver a suspender rosetas en 2 ml de medio de NPC (Tabla 1). La transferencia de células (1: 1) en una poli-L-ornitina / laminina recubiertas 6 placa de pocillos.
- De 15 a 21 días, las rosetas neuronales ampliarán; rosetas de alimentación cada segundo día con los medios de comunicación de la APN.
- Evaluar la calidad de las rosetas neuronales y asegurarse de que las células de tipo fibroblasto planos no están expandiendo dentro de la cultura.
NOTA: Si no rosetas persisten, la cultura de la APN a veces puede ser salvado por picking manual, seleccionando sólo los mejores de los rosetones recogido en Accutase. Disociar 15 min a 37 ºC. Pellet, lavar y placa en los medios de comunicación de la APN en 24 pocillos placa recubierta de poli-L-ornitina / laminina.
3. Ampliación de células progenitoras neurales
NOTA: hiPSC PNJ se puede cultivar en cualquier Matrigel- o poli-L-ornitina / laminina placas recubiertas. Utilizamos típicamente Matrigel-placas, ya que se pueden preparar con mayor rapidez y menor coste.
- Para preparar placas Matrigel recubiertos, descongelar y volver a suspender rápidamente una alícuota de 1 mg de Matrigel congelado en 24 ml de frío DMEM / F12 y distribuir inmediatamente 2 ml a cada pocillo de dos placas de seis pocillos. Incubar durante al menos 1 hora a 37 ºC.
NOTA: Matrigel sólo necesita ser aspirado, no se lava, inmediatamente antes del uso. - Alimente NPCs cada dos días y mantener a muy alta densidad o que de forma espontánea se diferenciarán a las neuronas.
NOTA: NPCs Aunque más establecidos suelen dividieron 1: 4 cada semana, NPCs muy bajos de paso se pueden dividir 1: 2 con tan poca frecuencia como una vez cada dos semanas. - Para dividir, primeros medios de aspirado y añadir 1 ml cálido Accutase (1X) por pocillo de placa de 6 pocillos. Se incuba a 37 ºC durante 10-15 minutos.
- Transferir suavemente las células desprendidas en un tubo de 15 ml que contenía DMEM / F12 con la menor tensión mecánica posible. No valorar las células, mientras que en la enzima. Células de pellets por spinning a 1000 xg durante 5 min.
- Aspirar el lavado, y volver a suspender NPCs en ~ 1 ml NPC medios por pozo original de 6 pocillos.
NOTA: Esperar que un pozo confluente de una placa de 6 pocillos tiene 5-10 millones de células; esto puede ser confirmado contando una alícuota de 10 l de células utilizando un hematocitómetro antes de volver a chapado. - Después de la resuspensión, NPCs re-placa como NPCs, neuronas o neuroesferas. Para mantener NPCs, placa aproximadamente 1-2 millones de células por pocillo de una placa de 6 pocillos. La eficacia de la formación neurosphere puede variar entre los experimentos y las líneas celulares, pero en general se produce mejor si entre 200.000 y 1.000.000 células se sembraron por pocillo de una placa de 6 pocillos no adherente; si se produce aglutinación de las neuroesferas, reducir el número de células sembradas. Para diferenciar a neuronas, placa de aproximadamente 200.000 células por pocillo de una placa de 6 pocillos, en sustitución de los medios de comunicación de la APN con los medios de comunicación neurona.
- Inmunohistoquímicamente validar cada línea NPC establecido. Una vez que el material celular suficiente ha sido expanded, NPCs etiquetas con anticuerpos para Nestin y Sox2. Líneas Validado NPC también deben diferenciarse en neuronas durante 4-6 semanas, y se marcaron con anticuerpos para III-tubulina y MAP2AB.
- Fijar las células en paraformaldehído al 4% en PBS a 4ºC durante 10 min. Permeabilizar NPCs a TA durante 15 min en 1,0% de Triton en PBS, y luego bloquear en 5% de suero de burro con 0,1% Triton a TA durante 30 min.
- Incubar con el anticuerpo primario en 5% de suero de burro con 0,1% de Triton, durante la noche a 4ºC.
NOTA: Se recomienda los siguientes anticuerpos: cabra anti-Sox2, 1: 200; Nestin de ratón anti-humano, 1: 200; de conejo anti-βIII-tubulina, 1: 500; ratón anti-βIII-tubulina, 1: 500; ratón anti-MAP2AB, 1: 200. (Figura 2). - Después de un lavado con PBS, se incuban las células anticuerpos secundarios con el anticuerpo secundario conjugado apropiado cabra, ratón o conejo a 1: 300, en en 5% de suero de burro con 0,1% Triton durante 1-2 horas a TA. Para visualizar los núcleos, células de tinción con 0,5 g / ml DAPI (4 ', Montaje de 6-diamidino-2-fenilindol) y luego con Vectashield.
4. NPC Transducción
- Utilice spinfection (centrifugación de placas de cultivo celular en presencia de virus a 1.000 xg durante 1 hr) para aumentar el porcentaje de células transfectadas 21. Aspirar los medios de comunicación y reemplazarla por la sobreexpresión relevante (o control) lentivirus (o retrovirus), tituladas a la multiplicidad deseado de infección (MOI) (típicamente 1-10), diluido en los medios de comunicación de la APN. Use 1,5 ml de volumen por pocillo de una placa de 6 pocillos (o un volumen escala apropiada para otros tipos de placas de cultivo tisular). Giran a 1000 xg y 37 ºC durante 1 hora en una centrífuga de placas.
NOTA: Idealmente, la transducción de NPCs con lentiviral o vectores retrovirales dentro de 1-2 días de separación. Si el uso de virus comerciales o preparado en el laboratorio, puede ser útil para titular apropiadamente lotes de virus de antemano por dilución en serie. (Figura 3). - Para reducir celmuerte lular, sustitución de los medios dentro de 8 horas de spinfection.
NOTA: la integración viral y la expresión transgénica deberían ser detectables dentro de las 24 horas por fluorescencia gen reportero. (Si el virus carece de un indicador fluorescente, esto es más difícil de evaluar; transfección exitosa mejor puede ser validada por inmunotransferencia, inmunohistoquímica o qPCR para los productos de sobreexpresión.) Expresión completa puede tardar de 3-7 días; spinfections repetidos con virus adicional puede ser necesaria para aumentar el porcentaje de células transfectadas. Spinfections recurrentes pueden ocurrir a diario, pero no tienen que ser tan frecuentes. Idealmente, si se utiliza un indicador fluorescente,> 80% de las células deben ser etiquetados.
5. Neurosphere ensayo de migración
NOTA: neuroesferas forma espontáneamente, tras la disociación enzimática de NPC (por una manera idéntica a la utilizada en la expansión NPC - los pasos 3.3 a 3.6), si las células se cultivan en suspensión en medios NPC.
- Brevemente, se disocian crecerNPCs d en los medios de comunicación de la APN para 48 horas en placas adherentes a fin de generar neuroesferas. (Figura 4).
- Para la migración neurosphere, preparar placas Matrigel frescas usando los medios de comunicación de la APN frío, en lugar de DMEM, en una placa de 96 pocillos, 1-2 horas antes de la neurosphere picking. No aspirar Matrigel de los pozos.
- Como se publicó originalmente para neuroesferas derivadas de células madre embrionarias de 22, recoger manualmente neuroesferas derivadas de NPC con un microscopio, después de lavar una vez en los medios de comunicación de la APN para eliminar restos celulares. Transferir una neuroesfera a cada pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta con Matrigel.
- Añadir un 0,5 mg adicionales Matrigel, diluido en medios NPC frías, a las neuroesferas en cada placa de 96 pocillos.
- Centrar manualmente cada neurosphere individuo en el centro del pozo utilizando una punta de pipeta.
NOTA: Es importante escoger neurosferas de tamaño similar, con el fin de reducir la variabilidad en los resultados. - Permita que la migración se produzca durante 48 horas y luego fijar las células wITH paraformaldehído al 4% y tinción con marcadores inmunohistoquímicos deseados.
- Si la migración radial se determinará, neurosferas fotografía en su totalidad utilizando un objetivo 4x microscopio. Excluir las neuroesferas en contacto con el borde del pozo o una segunda neurosphere del análisis.
NOTA: Si la migración se produce durante más de 48 horas, la migración radial resultante probablemente será demasiado grande para la imagen con un objetivo 4x. - Medir la migración promedio de cada neurosphere utilizando el software NIH ImageJ (Figura 5). Esto se puede hacer utilizando cualquiera de los métodos de análisis descritos a continuación:
- Migración radial:
- Trazar manualmente el borde de las células más lejanos migrar utilizando la herramienta de selección a mano alzada a continuación, utilizar la función (Ctrl + M) Medida para calcular el área de la forma resultante. Antes de medir el área, asegúrese de que la zona está marcada en la ventana Set Medidas encontrado en la ficha Analizar. Utilice lavalor de la medición de área y la ecuación para el área de un círculo (A = πr 2) para determinar el radio (exterior).
- Trazar el borde de la neurosphere original, medir el área y calcular el radio (interior) de la misma manera. Calcular la migración radial total como la diferencia entre los radios exterior e interior.
- Greatest migración celular:
- Medir la distancia recorrida de las cinco células más alejadas del borde de la neuroesfera interior con la función de selección de línea recta, seguido por la función (Ctrl + M) Medida.
- Migración radial:
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Representative Results
Rosetas neuronales pueden ser identificadas morfológicamente, utilizando un microscopio de campo claro, por su aspecto característico como racimos redondos de células neuroepiteliales con la polaridad-apico basal (Figura 1). Aunque NPCs son típicamente cultivaron a muy alta densidad celular, inmediatamente después de los pases, ligeramente soma de forma piramidal y la estructura de neuritas bipolar es visible (Figura 1D). NPCs validados expresan nestina y Sox2 en la mayoría de las células, aunque la tinción III-tubulina es también visible en todas las poblaciones de la APN, lo que indica que una proporción de los NPCs están constantemente iniciando la diferenciación neuronal dentro de la cultura (Figura 1F). Los marcadores de las células madre neurales, tales como SOX2 y PAX6, y progenitores neuronales del cerebro anterior, tales como TBR2, se expresan también en NPC, mientras que los marcadores del cerebro medio, como LMX1A y FOXA2 no son (Figura 1G-I). Una proporción significativa de células similares a fibroblastos grandes y planas dentro una población NPC indica que NPCs de mala calidad se han generado, que son poco probable para producir un gran número de neuronas después de la diferenciación neuronal (Figura 2).
Después de la transducción exitosa con un lentiviral alto título o vector retroviral, mayor que 80% de las células debe ser etiquetado por el reportero fluorescente incluido en el vector (Figura 3). Generación Neurosphere debe producir una población de neuroesferas de tamaño relativamente homogénea (Figura 4), que, con la alimentación regular, pueden permanecer sano en cultivo durante aproximadamente una semana. La migración Neurosphere se produce robustamente en neuroesferas sanos (Figura 5), y NPC hiPSC experimentan diferenciación rápida durante el curso de un ensayo de migración neurosphere 1.
Figura 2. Validación de la APN Lines. La alta calidad (arriba a la izquierda) hiPSC NPCs Nestin expreso (rojo) y Sox2 (verde). en la mayoría de las células (núcleos teñidos con DAPI (azul)), mientras que la baja calidad de los NPCs (abajo izquierda) tienen parches de células Sox2-negativas y Nestin negativo (derecha). Neuronas 4 semanas de edad diferenciados de los NPCs de alta calidad expresan MAP2AB (verde) y III-tubulina (rojo) (arriba a la derecha), pero los que diferenciarse de los NPCs de baja calidad no lo hacen (abajo a la derecha). 100x, barra de escala 100 micras. Haga clic aquí para ver una grande versión de esta figura.
Figura 3. La transducción viral de NPCs. Brightfield (arriba) y fluorescente GFP (abajo) imágenes de hiPSC NPCs antes (izquierda) y después spinfection viral. 100x, barra de escala 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Neurosphere Formación. Imágenes de campo claro NPCs adherentes (izquierda) y neuroesferas recién formadas (derecha). 100x, barra de escala 100 micras. Haga clic aquí para ver una larger versión de esta figura.
Figura 5. Neurosphere Migración. AB. Imágenes de campo claro neurosferas antes (A) y después (B) de 48 horas de la migración en Matrigel. 100x, barra de escala 100 micras. CG. Capturar imágenes de pantalla que demuestran la metodología para el análisis de la migración neuronal radial utilizando el software NIH ImageJ. Haz clic en "selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas ImageJ (C). Trazar el borde más alejado de las células migradas alrededor de las neuroesferas (D). Asegúrese de que la zona está marcada en la ventana Set Mediciones (E). Utilice la función de Medida (Ctrl + M) (F). Trace el borde de las neuroesferas originales (G) y utilizar la función de Medida (Ctrl + M). Las mediciones se pueden exportar a Excel para el análisis. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medios de comunicación | Componentes |
| Medios de HES | DMEM / F12 (Life Technologies # 11330) |
| 20% de reemplazo KO-suero (Life Technologies # 10828) | |
| 1x Glutamax (Life Technologies # 35050) | |
| 1x NEAA (Life Technologies # 11140) | |
| 1x 2-mercaptoetanol (1000x 55mm) (Life Technologies # 21985-023) | |
| 20 ng / ml FGF2 (Life Technologies 13256-029) | |
| Medios N2 / B27 | DMEM / F12 (Life Technologies # 10565) |
| 1x N2 (Life Technologies # 17502-048) | |
| 1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010) | |
| Los medios de comunicación de la APN | DMEM / F12 (Life Technologies # 10565) |
| 1x N2 (Life Technologies # 17502-048) | |
| 1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010) | |
| 20 ng FGF2 / ml (Life Technologies) | |
| 1 mg / ml Natural ratón laminina (Life Technologies # 23017-015) | |
| Medios Neuron | DMEM / F12 (Life Technologies # 10565) |
| 1x N2 (Life Technologies # 17502-048) | |
| 1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010) | |
| 1 mg / ml Natural ratón laminina (Life Technologies) | |
| 20 ng / ml BDNF (Peprotech # 450-02) | |
| 20 ng / ml de GDNF (Peptrotech # 450-10) | |
| 500 g / ml dibutiril AMP cíclico (Sigma # D0627) | |
| 200 nM de ácido L-ascórbico (Sigma # A0278) |
Tabla 1. Medios recetas.
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Discussion
Hemos descrito los métodos por los que pueda diferenciar hiPSCs en NPCs, un tipo de célula neuronal en la que se conserva una parte importante de la firma genética de neuronas derivadas de hiPSC y que pueden servir como un sustituto de las vías de desarrollo que posiblemente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad 8, 11. Además, como hemos detallado, NPCs son una población neuronal robusta replicativa y fácilmente transducidas, que creemos que puede ser adecuado para los estudios moleculares y bioquímicos de la predisposición a la enfermedad.
Aunque tenemos métodos detallados para diferenciar y cultura NPCs del cerebro anterior con dibujos, que pueden ser fácilmente adaptados para generar NPCs con dibujos a otros destinos de células. Por ejemplo, si EBS flotantes son tratados primero con 0,5 mg / ml DKK1, mM SB431542 10, 0,5 mg / ml de Noggin y ciclopamina 1 mM, se generarán NPCs del hipocampo que se puede ampliar en los medios de comunicación de la APN y se diferenciarán en medios neuronales suplementado con 20 ng / ml Wnt3a 7 12,23. Dado que los protocolos de diferenciación neuronales específicos más subtipo proceden a través de un NESTIN- y Sox2 positve intermedia, que predicen que los métodos similares pueden ser adaptables para GABAergic- 2,24 y glutamatergic- 3,25,26 poblaciones específicas de la APN.
Hay varios pasos críticos dentro del protocolo digno de mención. En primer lugar, si sobre-expresión o derribar expresión de genes endógenos, lo mejor es utilizar un vector de control que expresa una proteína fluorescente de la misma columna vertebral viral, como hemos observado diferencias sustanciales en la fluorescencia cuando los reporteros se expresan a partir de vectores de tamaños variables (debido a la eficiencia de envases disminuidocon el tamaño de vector) o con los promotores de diferencia (debido a las diferencias en la eficiencia de promotor). En segundo lugar, se recomienda completar la transducción viral antes de neuroesfera formación, como hemos observado pobres penetrancia de vectores virales en la estructura neuroesfera denso. En tercer lugar, ya que el número de pases de los NPCs aumenta más allá de pasaje diez, a menudo observamos migración deteriorado sustancialmente en el ensayo neuroesfera. De hecho, dada la propensión de los NPC para dar un mayor porcentaje de los astrocitos con el paso, es crucial para que coincida con el paso de las líneas de NPC en cada experimento.
Por último, es importante tener en cuenta las limitaciones biológicas y técnicas de las técnicas descritas. Aunque CPN parecen ser morfológicamente similares por el ojo, que son una población heterogénea compuesta de células capaces de generar tanto neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas. Mientras se observa el patrón prosencéfalo notablemente consistente de líneas NPC entre los individuos usando esta method 1, esto es sólo cuando se comparan las líneas de la APN de alta calidad totalmente validados - existen diferencias sustanciales entre buenos y malos líneas NPC calidad. Además, los rendimientos de transducción de células virales genéticamente heterogéneos, cada uno con una integración del vector viral en una localización genómica única; Por lo tanto, las células individuales pueden variar tanto en la ubicación y el número de sitios de integración genómicos. Más cambios consistentes en la expresión génica se producirán siempre cuando la manipulación genética está dirigido a una ubicación precisa y definida, tanto si se produce por el dedo de zinc, TALEN o estrategias basadas en la CRISPR.
HiPSC derivado NPC pacientes se pueden usar para estudiar tanto las perturbaciones de expresión génica globales que se producen en la enfermedad neurológica y / o también los efectos moleculares y celulares de la manipulación de genes candidatos o microRNAs en el contexto de cualquiera de las células neuronales sanas o enfermas derivados del paciente. De esta forma, las consecuencias de la manipulación de uno o más clavealelo (s) de riesgo puede ser caracterizada en el contexto de diversos orígenes genéticos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1 mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent |
| Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
| mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
| rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
| mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
| mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
| Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |
References
- Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
- Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
- Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
- Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
- Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
- An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
- Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
- Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
