Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Manipulering och Published: February 9, 2015 doi: 10.3791/52496
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Zoology, University of Cambridge

Introduction

Xenopus laevis är en allmänt använd, kraftfull modellorganism för att studera utvecklingen 1. Detta beror på Xenopus ägg är ovanligt stora (cirka 1,2 till 1,4 mm, i jämförelse med däggdjurs motsvarigheter är ca 0,1 mm) och riklig. Ägg innehåller matern syntetiserade och lagrade komponenter, som är tillräckligt för att driva embryonal utveckling fram till mitten av blastula övergången (MBT, som inträffar i det skede 8-8,5 med 4,000-8,000 celler). MBT åtföljs av zygotisk genomet aktivering, som sedan producerar embryonala genprodukter som styr vidare utveckling.

Ett flertal studier som syftar till att identifiera matern faktorer som är viktiga för utvecklingen. Många studier lita på injektion av antisensoligonukleotider (oligos) inklusive morfolinogrupper oligonukleotider in befruktade embryon, i vilket fall nedbrytning av moderns proteiner kan observeras vid gastrulastadium 2-4. Alternativt mRNA injiceras befruktade embryos störa genfunktioner eller spåra öden överuttryckta proteiner. Men injektion i embryon de en-cells skede normalt inte påverkar uttrycksnivåer av moderns proteiner vid mycket tidiga embryonala stadier innan MBT.

Heasman och Wylie etablerade värdöverföringsmetod för att övervinna detta problem 5. I deras metod, manuellt defolliculated oocyter injicerade med antisensoligos och överförs till värd honor 6. Proteiner nedregleras före befruktningen så att roller nedregleras proteiner i tidig embryonal utveckling kan undersökas. Denna maternal utarmning metod ledde till identifiering av flera unika utvecklings roller maternal proteiner, som ses över 7.

I denna rapport, vi detalj vår nyutvecklade metod, där mödra utarmning eller överuttryck av mRNA innan befruktningen sker utan manuell defolliculation och värd överföring8. Manuell defolliculation kräver mycket tid och värdöverföring behöver ofta skickliga tekniker och den specifika licens för djurkirurgi, vilket hämmar den frekventa användningen av mödra utarmning metod. Defolliculation och värd överföring ersätts genom enzymatisk defolliculation 9,10 och intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI) 11-13, respektive. ICSI ägg användes ursprungligen för att producera transgena grodor 12. Spermier och embryonala kärnor också transplanteras till in vitro mognat amfibie äggceller 11,14,15. Här visar vi vår steg-för-steg-metoden för att injicera spermier i vitro mognat oocyter som var pre-injicerade med antisensoligos eller mRNA.

Protocol

OBS: Alla experiment med grodor fördes efter krav i det brittiska inrikesministeriet.

1. Beredning av Xenopus laevis oocyter

  1. Ungefär en vecka innan äggcellen samlingen, injicera kvinnliga grodor med 150 U Gravida Mare Serum gonadotropin (PMSG) för pre-priming genom att 1 ml steril spruta med en 27 G nål. Injektion sker subkutant i rygg lymfan sac.
    OBS: Det är optimalt att använda grodor som inte lägger ägg under en längre tid (åtminstone mer än hälften år), eller som aldrig har lagt ägg innan.
  2. Store förprimad grodor i en vattentank inställd på 18 ° C i ljuset kontrollerad rummet (07:00 till 07:00: på, från 07:00 till 07:00: off).
  3. På dagen för äggcellen samling, förbereda 1 liter 1x Modifierade Barth lösning (MBS) från 10x MBS lager genom att späda med dubbeldestillerat vatten (DDH 2 O), och lägg penicillin och streptomycin vid slutlig koncentration av 10 ug / mlvarje (MBS + PS). 10x MBS lager består av 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 24 mM NaHCO 3, 8,2 mM MgSO 4 .7H 2 O, 3,3 mM Ca (NO 3) 2 .4H 2 O, 4,1 mM CaCl2 .6H 2 O, 100 mM HEPES, pH 7,5.
  4. Bedöva en förprimad groda genom subkutan injektion av 120 mg (i 400 | il) av Tricaine metansulfonat (MS222). Håll den injicerade groda i en liten tank med vatten.
  5. Efter 10 minuter, kontrollera sövd grodan genom att vrida den över sedan framgångsrikt sövda grodor inte svarar på detta. Om anestesi är ofullständig, tillsätt is i tanken och vänta på en annan 10 minuter.
  6. Plocka upp grodan från den lilla tanken och plats i rygg VILA på en fuktig torka.
  7. Använda pincett och en liten kirurgisk sax, nyp ihop huden och gör ett litet snitt (2 cm) i den nedre delen av buken, i sidled med mittlinjen. Gör en annan snitt vid den andra sidan.
  8. Efter kapning huden, lyft muskellagret with pincett och göra snittet i muskellagret.
  9. Observera äggstocken efter muskellagret klipps och dra äggstocken ut från snitt använder pincett.
  10. Överföring extraherade äggstock till en 50 ml tub med MBS-lösning.
    OBS: Försök att samla så mycket äggstock som möjligt från båda snitt.
  11. Slakta kvinnliga grodan genom avblodning, följt av frysning för senare lämpligt bortskaffande.
  12. Skölj extraherade äggstocken några gånger med MBS + PS tills blodet tvättas bort. Sedan överför äggstocken till en 9 cm petriskål med MBS + PS
    OBS: Kontrollera kvaliteten på oocyter under ett dissektionsmikroskop vid denna punkt. Om oocyter är tydligen dålig kvalitet, såsom oocyter med ojämn pigmentering i djur hälften (Figur 1A), inte bearbeta ytterligare och istället få en ny äggstock. Helst bör oocyter ha lika pigmentedjurhalvklot och vara ungefär lika stora.
  13. Reta äggstocken i små bitar(1-2 cm 2) och samla 5 ml ägg i en ny 50 ml tub.
  14. Skölj 5 ml av trasiga äggstocken några gånger med MBS + PS och lägga MBS + PS till 15 ml.
  15. Lägg 7 enheter av enzymet för defolliculation till äggstocken suspensionen (se Material Lista).
    OBS: Lös frystorkad enzym med 10 ml DDH 2 O (28 enheter / ml). Placera flaskan i 30 minuter på is med enstaka försiktigt snurra. Alikvot 250 | il och förvara vid -80 ° C fram till användning.
  16. Inkubera äggstocken pjäs med enzymet under 1 timme med försiktig skakning på skak (hastighet vid 15 varv / min, vilket motsvarar cirka 0,014 xg).
    OBS: För nästan fullständigt avlägsnande av follikelceller, 2 tim till 2 tim 15 min inkubation med enzymet behövs normalt. Längre inkubation behövs för äggcellen kärnöverföring experiment 16.
  17. Efter 1 timme inkubation, plocka upp ett litet antal behandlade oocyter (10-20 ägg) och överför till en 6 cm petriskål med MBS + PS Kontrollera ExTent av defolliculation under ett dissekera mikroskop. Om oocyter är separerade från varandra och åtminstone delvis defolliculated (Figur 1B), omedelbart gå vidare till nästa stopp reaktionen (steg 18). Om oocyter fortfarande tungt omgivna av follikelceller, inkubera för en extra 15 min vid max.
  18. Lägg rikligt med MBS + PS för att stoppa reaktionen och kassera supernatanten. Upprepa tvätt för 10 gånger.
    OBS: Lägg MBS + PS genom att hälla på väggen av en 50 ml tub, men inte direkt till äggceller. Efter suspension i MBS + PS, små omogna oocyter tenderar att flyta på toppen av tvättbuffert och kasta sådana små flytande ägg.
  19. Efter tvättar, överför till en 9 cm petriskål med MBS + PS
    Anmärkning Från detta steg framåt, hålla oocyter vid 16-18 ° C så mycket som möjligt. Detta kan göras genom att hålla oocyter innehållande skålen på en temperaturstyrd skede.
  20. Välj scen VI oocyter enligt Dumont klassificeringför efterföljande användning och överföring till en ny 9 cm petriskål med MBS + PS Oocyte överföring kan göras med hjälp av en glaspipett med en lämplig spets storlek (större än äggcellen storlek).
    OBS: Bra kvalitet oocyter bör ha ett jämnt pigmenterad djur halvklotet med tydlig kontrast mellan djuret halvklotet och växthalvklotet, och vara ungefär lika stora (Figur 1C). Stage VI oocyter representerar fullvuxen oocyter som kan bemöta progesteron (äggcell diameter är ca 1,2-1,4 mm).

2. Injektion av antisensoligonukleotider eller mRNA i oocyter

OBS: Alla steg i detta avsnitt bör göras på 16-18 ° C på ett mikroskop scenen utrustad med temperaturstyrd cirkulerande vatten eller på en plastlåda fylld med is.

  1. Överför 200-300 utvalda oocyter i en ny 9 cm petriskål fylld med MBS + PS, i vilken mikroinjektion kommer att utföras.
    OBS: I each skick, 200-300 ägg som normalt används. Totalt är cirka 1.000 oocyter som används i ett experiment.
  2. För framställning injektion av antisensoligos eller mRNA, mata metallkolven en microinjector.
  3. Fyll ett glas kapillär med mineralolja med hjälp spruta och sätt in glaskapillär fylld med olja till metall kolv microinjector.
    OBS: Ett glas kapillär dras av mikropipett avdragare. Dessa nålar hålls i en låda utan att skada tips.
  4. Skär nålspetsen med hjälp av små kirurgiska saxar under ett mikroskop genom att sikta som diametern spets liten för injektion som möjligt.
    OBS: nålspets kan slipas med hjälp av en mikro smedja eller mikropipett beveler. För att fasa av nålen i en vinkel på 25 ° förbättrar kapaciteten att penetrera oocyt väggen.
  5. Placera en liten remsa av Parafilm på scenen av en dissekera mikroskop och fördela en 3 l droppe av antisens oligo eller mRNA-lösning.
  6. Flytta tip av injektionsnålen in i den lilla droppen av lösning och fyll nålen med den lösning som skall injiceras.
    OBS: Om spetsen av injektionsnålen är för liten, bör luftbubblor visas vid spetsen av metallkolven. Gör sedan ett större tips på injektionsnålen tills detta inte händer.
  7. Märk injektionsnålen ungefär 0,5 mm bort från spetsen. Detta märke används som en indikator på injektionsdjupet.
  8. För in spetsen på nålen i en äggcell längs ekvatorial gränsen genom att sikta till mittpunkten av äggcellen (under germinal vesikel) samtidigt som du försiktigt håller motsatta sidan av äggcellen insprutningspunkten med pincett för att förhindra oönskad äggcellen rörelse under injektion .
    OBS: Hitta område utan follikelceller (Figur 1B) och stick in nålen från den platsen eftersom även en fin nål inte ofta kan penetrera ett lager av follikelceller.
  9. Eject 4,6 ng / 4,6 nl eller 9.2 ng / 9,2 nl av AntisENSE oligos, eller en lämplig volym av mRNA (250 pg till 13,8 ng) med hjälp av fotpedalen. Uppgifter om antisens oligo framställning beskrivs i 7.
  10. Överför de injicerade oocyter i en 6 cm petriskål fylld med MBS + PS kompletterad med 0,1% BSA (Oocyte inkubationsmedium; sterilisera lösningen med användning av en 0,45 ^ m porstorlek filter).
  11. Inkubera oocyterna vid 16 ° C eller 18 ° C under 1-2 dagar.
    NOT: injicerade oocyter kan utsättas för in vitro-mognads flera timmar efter injektion, i vilket fall injektion av 4,6 ng antisensoligos är att föredra. En generell regel är att ju kortare Inkubationstiden är, desto bättre den efterföljande embryonal utveckling.

3. In vitro Mognad (IVM) av oocyter

  1. På kvällen den oocytmognad experimentet, hämta progesteron stamlösning (30 mM i etanol) från -80 ° C frys och lös fällningar på rummet temperatur med enstaka vortex.
    OBS: progesteron lager lämnas normalt vid rumstemperatur under 30 min till 1 h.
  2. Tillsätt 5 ìl av progesteron lager i 50 ml MBS + PS (Mognad medium; den slutliga koncentrationen av progesteron vid 3 M) och skaka på shaker i 30 min för att distribuera progesteron i lösningen lika.
  3. Förbered agaros belagda 6 cm rätter för in vitro mognadsbehandling.
    1. Lägg 1 g agaros till 50 ml 1x MBS utan magnesium och kalcium.
    2. Lös agaros genom uppvärmning i mikrovågsugn.
    3. Häll en liten volym av agaroslösningen till 6 cm skålar att täcka botten av rätter.
    4. Vänta minst 30 minuter tills stel.
    OBS: Agarose beläggning förhindrar vidhäftning av äggceller till rätter. En gång in vitro mognat oocyter är tätt knutna till rätter, är det mest troligt att oocyter kommer att aktiveras av stimuli som de får under avskildhet från dishes.
  4. Häll 5-8 ml Mognad medel till agaros belagda rätter och överföra 200-300 ägg i vardera 6 cm skålar.
    OBS: Försök att överföra oocyter med en minimal mängd av äggcellen inkubationsmedium.
  5. Inkubera under 16 h vid 16 ° C.
    OBS: Till exempel starta behandlingen vid 05:00 och avslutas vid 09:00 på nästa dag.

4. intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI)

  1. Fryst sperma mäldberedningen
    OBS: Följande spermier förberedelser bör göras innan oocytmognad experimentet, och frysta spermier lagren hålls vid -80 ° C för ICSI.
    1. Samla testiklarna från en manlig groda genom att följa stegen 1,4-1,11, förutom att dra fett och testiklar ut från snitt använder pincett och ta bort testiklarna från fettet.
    2. Tvätta testiklar i 1x Marc Modified Ringers (MMR, 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,4).
    3. Ta bort fett end blodkärl genom att rulla tvättade testiklar på en ren mjukpapper och sedan genom att ta bort kvarvarande blodkärl med hjälp av pincett.
    4. Placera varje testikel i en 3,5 cm petriskål med 1 ml 1x MMR.
    5. Skär longitudinellt med fina saxar, och riva i små bitar med pincett tills inga stora bitar kvar.
    6. Pipettera upp och ner med hjälp av 1 ml plastspets vars ände är styckat och last 1 ml av den krossade testikeln lösningen i en glashomogenisator.
    7. Homogenisera dem med 2-3 slag och häll sedan lösningen på en 50 | im porfilter fäst till toppen av en 15 ml centrifugrör. Låt lösningen gå genom filtret.
    8. Upprepa steg 4.1.7 genom återsuspendering resterande cut testikeln i 1 ml 1x MMR. Slutligen, tvätta homogeniseraren ett par gånger med 1x MMR och passera den genom filtret.
    9. Upprepa steg 4.1.5 till 4.1.8 för andra testikeln och pool två testiklar i en 15 ml centrifugrör.
    10. Snurra cellerna vid 800 xg vid 46; C under 20 min.
    11. Kasta bort supernatanten och suspendera pelleterade cellerna i 2 ml 1x MMR. Sedan överför till ett nytt rör.
      OBS: Se till att inga synliga blodkroppar är närvarande.
    12. Förbered ett steg gradient i en 14 ml ultraklara centrifugrör. Bottenskikt: 4 ml 30% iodixanol. Andra bottenskikt: 1 ml 20% iodixanol. Tredje bottenskikt: 5 ml 12% iodixanol. Ytskikt: testiklar celler i 2 ml 1x MMR. Överlägg gradienterna mycket försiktigt med en 1 ml pipettspets (overlay långsamt att inte störa den undre fasen).
      OBS: Bara ett lager av 30% iodixanol bör också arbeta för endast isolera spermier.
    13. Spin i SW40 rotor med hjälp ultracentrifugen vid 10000 xg vid 4 ° C i 15 min (retardation utan avbrott).
    14. Ta försiktigt bort röret från ultracentrifugen. Bekräfta ett gränssnitt mellan varje skikt av gradienten och pelleten vid botten.
    15. Samla spermierna fraktionen från pelleten.
    16. Resuspendera spermier pelLåt i 1x MMR för att skölja iodixanol. Centrifugera vid 800 xg vid 4 ° C under 20 minuter.
      OBS: Om en hel del spermier fortfarande kvar i suspensionen efter spinn, re-spin supernatanten vid 3220 xg vid 4 ° C i 20 minuter och sammanställa pellet spermier.
    17. Kasta bort supernatanten och återsuspendera spermier pelleten i 1 ml 1X Nuclear Preparation Buffer (NPB; 250 mM sackaros, 0,5 mM spermidin-trihydroklorid, 0,2 mM spermin tetrahydroklorid, 1 mM EDTA, 15 mM HEPES, pH 7,7) 13. Sedan överföra till ett Eppendorf-rör.
    18. Lägg 50 il 10 mg / ml Digitonin lösning i 1x NPB (Resuspendera Digitonin pulver i DMSO vid 50 mg / ml och frysa alikvoter vid -80 ° C. Före användning, späd 50 mg / ml alikvot till 10 mg / ml med 1x NPB. Oanvänd 10 mg / ml Digitonin kan frysas och förvaras vid -20 ° C och återanvändas) till en ml av spermielösningen.
    19. Inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
    20. Kontrollera en permeabilization ränta med DAPI färgning (0,3 mikrogram / ml DAPI som final koncentration). Om mindre än 95% av cellerna permeabilized, inkubera lite längre.
      OBS: Ibland om alltför många spermier inkuberas samtidigt (speciellt när spermier samlas in från flera testiklar), är det svårt att permeabilisera, i vilket fall det kan vara nödvändigt att lägga till ytterligare en liten mängd Digitonin; till exempel om 20% av spermierna inte permeabiliseras, är en ytterligare 20 ^ il av Digitonin sattes.
    21. Stoppa permeabilisering genom tillsats 10% BSA till 3% slutkoncentration.
    22. Snurra cellerna vid 4 ° C.
      OBS: Försök så lite centrifuge hastighet som möjligt genom att starta med 100 xg under 5 minuter. Om inte tillräcklig, öka hastigheten och / eller tid.
    23. Tvätta cellerna med 0,3% BSA i 1x NPB och centrifugera vid samma hastighet som i steg 4.1.22. Under tiden förbereder Sperm Storage Buffer (SSB, 2 ml 2x NPB, 120 pl 10% BSA, 1,2 ml autoklaverad Glycerol, 680 pl H2O).
    24. Lägg 500 l av SSB till spermierpellet. Pipette flera gånger upp och ner för att resuspendera med en skuren spets i syfte att inte skada cellerna.
    25. Tillåt att ekvilibrera över natten vid 4 ° C.
    26. Pipet cellerna upp och ner flera gånger med en cut spets.
    27. Späd ett par mikroliter 10 gånger i 1x MMR eller i 1x PBS att räkna cellerna med hjälp hemocytometer.
    28. Freeze som alikvoter vid 30.000 spermier / l (eller högre) direkt vid -80 ° C och förvara vid -80 ° C i en enda användning portioner.
  2. ICSI till in vitro mognat oocyter
    OBS: Alla processer som involverar oocyter bör göras på 16-18 ° C.
    1. Förbered en glaspipett för överföring mognat ägg.
      OBS: glaspipett måste vara tillräckligt bred för att rymma äggceller utan att klämma.
    2. Sexton timmar efter att ha flyttat äggceller till progesteroninnehållande medium, mognat överföring äggceller till en 6 cm agaros belagda skål fylld med MBS + PS för tvätt.
      OBS: Viktigt matured oocyter måste behandlas extremt noggrant. Grov behandling av oocyter kan framkalla spontan aktivering innan spermieinjektion.
    3. Räkna mognat ägg genom att bekräfta förekomsten av vita fläckar, vilket innebär germinal vesikelnedbrytning (Figur 2). Om mognadsgraden är lägre än 80%, är det osannolikt att erhålla tillräckligt antal överlevande embryon för vidare analyser.
      OBS: Kvar follikelcellerna skalas av efter oocytmognad (Figur 2).
    4. Överför oocyter från MBS tvätt till en ny agaros belagd 6 cm skål fylld med injektions medium (Förbered 500 ml: 30 g Ficoll (6%), 20 ml av 10x MMR och 500 pl 1,000x PS lager).
    5. Inkubera i minst 30 minuter innan ICSI.
    6. Ställ in microinjector enligt steg 2,2-2,4.
      OBS: munstycksstorlek av injektionsnålen hålls så liten som möjligt genom att följa förfarandet beskrivet i steg 2.6. Diameternav nålen är 20-40 pm. Att fasa nålspetsen som beskrivs i steg 2.4 kan tillåta effektiv injektion.
    7. Fetch spermierna alikvot och späd spermiesuspensionen i Sperm spädningsbuffert (SDB; 250 mM sackaros, 75 mM KCl, 0,5 mM spermidin, 0,2 mM spermin, 200 pM HEPES pH 7,5).
      OBS: Utspädning kan varieras beroende på en nål storlek och så vidare. Späd 120 tider på 30.000 spermier / ul lager som en initial försök och justera ytterligare om det behövs.
    8. Placera en liten remsa av Parafilm på scenen av ett dissektionsmikroskop. Blanda spermieinjektion lösning genom pipettering och fördela några pl droppe av sperma lösningen.
    9. Suck den utspädda sperman suspensionen i nålen, injicera 4,6 nl i 10 på varandra följande droppar innehållande 0,3 pg / ml DAPI på ett objektglas, och snabbt räkna antalet spermier levereras per injektion på en fluorescerande mikroskop.
      OBS: Sikta 1-2 spermier per injektion. Om det behövs, späd spermieinjektion lösningen meroch kontrollera antalet spermier per injektion igen förrän att uppnå en önskad koncentration.
    10. Mata ut provinjektionslösningen och fyller en ny spermieinjektionslösning med en lämplig koncentration.
    11. Injicera 4,6 nl av spermier lösningen till 100 mognat ägg.
      OBS: Det är viktigt att kontinuerligt injicera lösningen. Först bestämmer den tid som krävs för utstötning av 4,6 nl (normalt 1-2 sek). Upprepa följande process; injicera i en äggcell, vänta några sekunder, ta bort en nål och mock-injektion i injektionslösning, vänta några sekunder, injicera i en äggcell. Denna kontinuerlig insprutning förhindrar också blockering av nålspetsen. Alternativt kan metoden som använder en pump användas 13.
    12. Efter ca 100 injektioner, mata ut kvarvarande spermier lösningen och åter fylla spermielösningen (använd samma lösning spermier, men pipett upp och ner innan dispense).
      OBS: Om nålen inte suga spermier lösning väl, skär spetsen på behovetle. Om detta inte förbättrar situationen, utarbeta en ny nål.
    13. Upprepa injektionen processen tills alla ägg injiceras.
      OBS: Om äggcellen kvaliteten är bra och injektionen är klar läggs sammandragning av injicerade oocyter ses inom 20 minuter efter injektionen tiden.
    14. Flytta de injicerade rätterna till 16 ° C eller 18   ° C inkubator.
    15. 4-5 h efter injektionen, kontrollera klyvningshastigheten för ICSI-embryon.
      OBS: Cleavage fåror av dessa embryon får inte vara så tydlig som den hos normala befruktade embryon. Vissa embryon visar också onormala klyftor, som kan orsakas av flera injektion spermier.
    16. Överför klyvs embryon inklusive onormalt klyvda embryon till inkubationsmedium (Förbered 500 ml: 20 g Ficoll (4%), 5 ml av 10x MMR och 500 pl av 1,000x PS lager).
    17. Inkubera embryon antingen i 16   ° C eller 18 ° C inkubator över natt.
    18. Nästa morgon, överföring embryos till 0,1 x MMR och räkna överlevande embryon.
    19. I genomsnitt kan cirka 10% av sperma-injicerade oocyter utvecklas till simbasyngelstadiet (figur 3A).

Representative Results

Embryonala utveckling ICSI embryon med hjälp av in vitro mognat oocyter undersöktes (figur 3A). Mognadsnivåer GV oocyter till MII scenen är rörlig och till stor del beror på äggcellen kvaliteten. I goda försök, nästan 100% av GV oocyter svarar på progesteron och visar tecken på oocytmognad slutligen bli ägg på MII scenen. Samtliga mognade oocyter utsattes för ICSI och omkring 25% av injicerade ägg klyvda (Figur 3A, n = 13 för kontroll scrambled oligo-injicerade oocyter och n = 7 för inga oligo-injicerade oocyter). Cirka 60% eller 80% av kluvna embryon, som framställts av kontroll oligo-injicerade oocyter eller icke-injicerade äggcellen, respektive, nådde blastula / gastrulastadium. Bland blastula / gastrula embryon, ungefär hälften av embryon i oligo-injicerade proverna var av god kvalitet (nästan inga tecken på onormal klyvning och apoptos), medan 82% av blastula / gastrula embryon var av god kvalitet i non-injicerade prover (Figur 3a). Slutligen 41% och 11% av kluvna embryon i oligo-injicerade prover nådde muskelsvar och simning grodyngel stegen, respektive, medan 60% och 29% av kluvna embryon i icke-injicerade prover gjorde (Figur 3A). Dessa ICSI embryon är blandningen av normala och onormala embryon (Figur 3B). Några av dem genomgår metamorfos och utveckla mogna grodor 8. Dessa resultat tyder på att injektion av antisens-oligonukleotider till GV-oocyter, följt av IVM och ICSI, tillåter effektiv tidig embryonal utveckling. Även injektion av antisensoligos sig minskar embryonal utveckling, är vi fortfarande möjlighet att få tillräckligt med embryon för många experimentsyfte såsom kontroll utvecklingssatser, RT-PCR, western blot och så vidare.

Figur 1
Fig ure 1: Typiska exempel på Xenopus laevis oocyter av god kvalitet eller dålig kvalitet för in vitro mognad experiment. (A) Ett exempel på dålig kvalitet oocyter. Till exempel är oocyter visar fläckvis pigmente inte används för efterföljande experiment. Varje Xenopus laevis äggcellen är ungefär 1,2-1,4 mm i diameter. (B) En delvis defolliculated äggcellen. Den högra halvan av äggcellen är täckt av follikelceller, som kan skönjas genom närvaron av blodkärl. En pil visar ett område utan follikelceller och i vilken injektionsnålen injiceras. (C) Ett exempel på god kvalitet oocyter, som är lika stora och visar jämt pigmentedjurhalvklot med tydlig kontrast mellan djuret halvklotet och växthalvklotet.

2496 / 52496fig2highres.jpg "/>
Figur 2:. Xenopus laevis oocyter före och efter mognad Efter oocytmognad, tydliga vita fläckar visas högst upp i djurhalvklot och follikelcellerna skalas av. Varje Xenopus laevis äggcellen är ungefär 1 mm i diameter.

Figur 3
Figur 3: Utveckling av ICSI embryon, som framställts av in vitro mognat oocyter. (A) Utveckling av ICSI embryon till varje steg sammanfattas. Oocyter injicerades med kontroll scrambled antisensoligonukleotider (kontroll oligo injektion) eller utan injektion (non injektion), följt av IVM och ICSI. Motsvarande antalet embryon i varje steg visas ovanför staplarna. Medelvärde ± SEM visas. N = 4-13 oberoende experiment / olika females. (B) Exempel på överlevande ICSI embryon. Dessa tailbud scen embryon producerades i ett experiment, där cirka 200 oocyter användes som utgångsmaterial.

Discussion

Vi här i detalj en ny metod för att utarma matern faktorer eller att överuttrycker exogena faktorer innan befruktningen. Detta system kräver två microinjections, men istället hoppar operationen av grodor, som används i den mottagande överföringsmetod 7,17. Det är optimalt att ta bort grodan kirurgi steg när det gäller djuromsorg. Dessutom behöver vi inte ta hänsyn till kvaliteten på värd kvinnliga grodor för överföringsexperiment, vilket innebär att vi kan bli av med en biologisk faktor som påverkar framgången av experiment. Därför i detta system av kvaliteten på ägg som erhållits från PMSG-primade grodor är en viktig biologisk faktor som är avgörande för framgångsrika experiment. Kvaliteten på oocyter kan bedömas efter insamling av äggstockar eller efter defolliculation. Om något onormalt observeras vid dessa stadier, är det optimalt att samla annan äggstock från en ny groda. En annan punkt när du kan kontrollera äggcellen kvalitet är efter oocytmognad. Om mindre än 80% av progesterone-behandlade oocyter visar tecken på mognad, kanske du inte kunna få det tillräckligt antal embryon för ytterligare analyser. Användningen av enzymatisk defolliculation istället för manuell defolliculation är också en annan fördel med att använda detta system för att minska arbete som krävs för defolliculation. Det är emellertid fortfarande möjligt att manuell defolliculation kan ge en bättre utveckling än den enzymatiska behandlingen.

Såsom visas i fig 3, nästan 10% av in vitro-mognade oocyter kan nå simning yngelstadiet. Dessa uppgifter samlas in från 13 oberoende experiment inklusive de som rapporterats i åtta och nya injektionsexperiment. Värdöverföringsmetod behöver 75-150 ägg i varje behandling för att erhålla meningsfulla uppgifter sedan 30-60% av de överförda oocyter kan nå neurula stadiet 17. Vår metod börjar normalt med 200-300 ägg i varje försöksgrupp sedan ca 40-60% av kluvna embryon kan nåmuskelsvar skede. Dessa data tyder på att båda metoderna stödjer en rimlig utvecklingstakt. Hittills har vi fått 10 levande grodor från kontroll mRNA-injicerade och kontroll antisens oligo-injicerade oocyter som använder denna teknik, vilket tyder på att detta tillvägagångssätt stödjer utveckling genom metamorfos.

Vår äggcellen manipulation-ICSI-metoden ger en möjlighet att testa rollen av moderns faktorer under mycket tidig embryonal utveckling, strax efter befruktningen. Dessutom kan överuttryck av kromatin modifierande faktorer innan befruktningen gör det möjligt att omforma mödra kromatin innan befruktning för att förstå moderns kromatin stater som är nödvändiga för utveckling. Denna strategi kan också fungera bra med aktuella genen redigeringssystem såsom transkription aktivator liknande effektor nukleas (Talen) 18,19 och CRISPR / CAS9 20,21 eftersom dessa kan uttryckas med innan befruktningen. Därför har vår nya strategi en potential som skall användas för många tillämpningar i framtiden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)  MSD Animal Health Vm 01708/4309 PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222) Sigma A5040 For anesthesia
Liberase TM Research Grade Roche 05 401 127 001 For oocyte defolliculation. Store at -20 °C.
Drummond Nanoject Drummond Scientific Company 3-000-205/206 For microinjection
glass capillary  Alpha laboratories 7” Drummond #3-000-203-G/XL For microinjection
Micropipette Puller  SUTTER Instrument Model D-97 For microinjection
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-500 For in vitro maturation and ICSI
14 ml ultra-clear centrifuge tube  Beckman Coulter United Kingdom Ltd 344060 For sperm purification
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol) Sigma D1556 For sperm purification
Digitonin Sigma D141 Cell permeabilization reagent
Shaker Hybaid  HB-SHK-1 For oocyte defolliculation
Dissecting microscope (Stereo zoom microscope) ZEISS Semi SV6 For oocyte collection and microinjection
50 μm pore filter CellTrics 04-0042-2317 For sperm purification
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100XP For sperm purification
50 ml centrifuge tube Cellstar Greiner Bio-One 227261 or 210261 Oocyte collection and defolliculation reaction
15 ml centrifuge tube FALCON 352097 For sperm purification
90 mm Petri dish  Thermo Scientific 101VR20/C
Easy-Grip Cell Culture Dish, 60 x 15 mm FALCON 353004
Easy-Grip Cell Culture Dish, 35 x 15 mm FALCON 351008

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).
  2. Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).
  3. Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos. Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).
  4. Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus. Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).
  5. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).
  6. Heasman, J., et al. Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos. Cell. 79 (5), 791-803 (1994).
  7. Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes. Methods. 51 (1), 75-81 (2010).
  8. Miyamoto, K., et al. Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development. Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).
  9. Halley-Stott, R. P., et al. Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming. Methods. 51 (1), 56-65 (2010).
  10. Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter. Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).
  11. Amaya, E., Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).
  12. Kroll, K. L., Amaya, E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).
  13. Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection. Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).
  14. Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis. Cell. 4 (3), 269-274 (1975).
  15. Smith, L. D., Ecker, R. E. Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens. Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).
  16. Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes. Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).
  17. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis). Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Sakane, Y., et al. Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases. Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).
  20. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  21. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).

Tags

Utvecklingsbiologi , oocytmognad intracytoplasmatisk spermieinjektion embryonal utveckling moderns faktorer maternal utarmning mikromanipulation gen störning
Manipulering och<em&gt; In Vitro</em&gt; Mognad av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oocyter, följt av intracytoplasmatisk spermieinjektion, att studera embryonal utveckling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miyamoto, K., Simpson, D., Gurdon,… More

Miyamoto, K., Simpson, D., Gurdon, J. B. Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development. J. Vis. Exp. (96), e52496, doi:10.3791/52496 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter