Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Beoordeling van bacteriële invasie van hartcellen in cultuur en hartkolonisatie bij geïnfecteerde muizen met listeria monocytogenes

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52497

Summary

Listeria monocytogenes veroorzaakt foetale infecties bij zwangere vrouwen en meningitis bij gevoelige populaties. Subpopulaties van bacteriën kunnen hartweefsel koloniseren, waardoor myocarditis ontstaat bij patiënten en proefdieren. Hier presenteren we een protocol dat beschrijft hoe L. monocytogenes cardiale celinvasie in vitro en cardiale kolonisatie bij geïnfecteerde dieren te beoordelen.

Abstract

Listeria monocytogenes is een grampositieve facultatieve intracellulaire ziekteverwekker die ernstige invasieve infecties kan veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten, ouderen en zwangere vrouwen. De meest voorkomende manifestaties van listeriose bij mensen zijn meningitis, encefalitis en foetale abortus. Een significant maar veel minder gedocumenteerd vervolg op invasieve L. monocytogenes infectie betreft het hart. Het sterftecijfer door hartaandoeningen kan oplopen tot 35% ondanks de behandeling, maar er is zeer weinig bekend over L. monocytogenes kolonisatie van hartweefsel en de daaruit voortvloeiende pathologieën. Bovendien is onlangs duidelijk geworden dat subpopulaties van L. monocytogenes een verbeterd vermogen hebben om binnen te dringen en te groeien in hartweefsel. Dit protocol beschrijft in detail in vitro en in vivo methoden die kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van cardiotropisme van L. monocytogenes isolaten. Methoden worden gepresenteerd voor de infectie van H9c2-hartstilstandstheoblasten bij ratten in weefselkweek en voor de bepaling van bacteriële kolonisatie van de harten van geïnfecteerde muizen. Deze methoden zijn niet alleen nuttig voor het identificeren van stammen met het potentieel om hartweefsel bij geïnfecteerde dieren te koloniseren, maar kunnen ook de identificatie van bacteriële genproducten vergemakkelijken die dienen om hartcelinvasie te verbeteren en / of veranderingen in hartpathologie te stimuleren. Deze methoden voorzien ook in de directe vergelijking van cardiotropisme tussen meerdere L. monocytogenes stammen.

Introduction

Listeria monocytogenes is een grampositieve intracellulaire ziekteverwekker die ernstige ziekten kan veroorzaken bij gevoelige populaties, waaronder ouderen, zwangere vrouwen, mensen met HIV/AIDS en personen die chemotherapiekrijgen 1. Infectie in deze populaties is vaak het gevolg van het innemen van besmette voedingsmiddelen, en de meeste infecties worden geassocieerd met grootschalige door voedsel overgedragen uitbraken2,3. Bij mensen en andere zoogdieren is L. monocytogenes in staat om zich over de epitheelrand van de dunne darm te verplaatsen en vervolgens naar de lever te worden getransporteerd4,5. Diermodellen suggereren dat ingeslikte bacteriën zich repliceren in de intestinale villi en via de poortader naar de lever gaan of zich via de mesenterische lymfeklieren in de bloedstroom verspreiden, wat leidt tot hematogene verspreiding naar de lever en milt6,7. In de lever en milt is de bacterie in staat om de opname in zowel professionele fagocyten als inwonende parenchymale cellen te bemiddelen en stelt snel infecties in deze organen vast. Naarmate de bacteriële belasting toeneemt, worden tal van bacteriën teruggespreid in het bloed, waar ze in staat zijn om gevoelige weefsels verder te koloniseren, waaronder het centrale zenuwstelsel en de placenta (indien aanwezig). Kolonisatie van deze sites sluit de meest voorkomende manifestaties van listeriose bij mensen uit, waaronder meningitis, encefalitis en foetale abortus2.

Van geselecteerde subpopulaties van L. monocytogenes is onlangs aangetoond dat ze een verbeterd vermogen hebben om binnen te dringen en zich te repliceren in hartweefsel8. Manifestaties van hartbetrokkenheid zijn gevarieerd en variëren van endocarditis en pericarditis tot fulminante myocarditis compleet met geleidingsafwijkingen9-13. Het totale aantal L. monocytogenes cardiale gevallen per jaar is laag, maar kan onder schatting zijn omdat dit facet van infectie niet algemeen goed wordt herkend. Kolonisatie van het hart door ziekteverwekkers vereist vaak gastheerpredisposities zoals reeds bestaande valvulaire schade of kunstmatige hartkleppen. Er zijn echter isolaten van L. monocytogenes geïdentificeerd die opmerkelijk zijn vanwege hun vermogen om de harten van geïnfecteerde dieren te koloniseren bij afwezigheid van hartschade en/of afwijkingen8.

Hierin worden in vitro en in vivo methoden beschreven voor het beoordelen van bacteriële kolonisatie van hartweefsel bij geïnfecteerde dieren met behulp van invasietesten in weefselkweek en levende dierinfecties. Deze methoden zijn niet alleen nuttig gebleken voor het identificeren van stammen met het potentieel om hartweefsel bij geïnfecteerde dieren te koloniseren, maar moeten ook nuttig zijn voor de identificatie van bacteriële genproducten die dienen om hartcelinvasie te verbeteren en / of te resulteren in veranderingen in hartpathologie. Deze methoden vergemakkelijken de vergelijking van cardiotropisme tussen meerdere stammen. Voor de hier beschreven methoden wordt L. monocytogenes 10403S gebruikt als een goed bestudeerde vertegenwoordiger van een niet-cardiotrope stam en wordt het klinische isolaat 07PF0776 gebruikt als een representatief voorbeeld van een cardiotrope stam. Deze twee stammen werden gekozen om een vergelijking te bieden voor bacteriële invasie van hartcellen in vitro en kolonisatie van harten van geïnfecteerde muizen in vivo. Het isolaat 07PF0776 is een klinisch isolaat dat is hersteld van een interventratriculair abces dat een fatale aritmie veroorzaakte bij een HIV+ patiënt8. L. monocytogenes isolaten kunnen variëren in hun virulentiepotentieel, en gezien de neiging voor Listeria om personen met immunosuppressie en zwangere vrouwen te infecteren, moeten personen binnen deze populaties voorzichtig zijn bij het beoordelen van verschillende klinische isolaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opslag- en kweekomstandigheden voor L. monocytogenes-stammen

  1. Bereid vaste media voor door de agar (BHI) van de hersen-hartinfusie te autoclaafen en de gesmolten media in petriplaten te gieten. Laat de platen 's nachts drogen bij kamertemperatuur en 's nachts weer bij 37 °C.
  2. Verkrijg met behulp van een steriele lus een klein monster L. monocytogenes uit eerder gemaakte vriesvoorraden (bacteriën gesuspendeerd in 20% glycerol in BHI-vloeibare media, opgeslagen bij -80 °C) of uit een agarplaat met kolonies die eerder voor isolatie waren geslagen.
  3. Gebruik aseptische techniek, streep het monster voor isolatie van één kolonie. Zorg ervoor dat u de lus tussen dwarsstrepen steriliseert om overmatige overdracht te voorkomen en ervoor te zorgen dat individuele kolonies van de stam worden beoordeeld. Incubeer de plaat(en) 's nachts bij 37 °C.
  4. Verwijder met behulp van een steriele lus één kolonie van het isolaat en enk 2 ml BHI-bouillon (zonder agar) in een polystyreenbuis van 14 ml.
  5. Voor assays en infecties, incubeer de bouilloncultuur statisch (zonder schudden) 's nachts in een incubator van 37 °C. Voor het opslaan van gekweekte isolaten, incubeer de bouilloncultuur bij 37 °C met schudden bij 180-200 tpm 's nachts. Culturen kunnen worden opgeslagen door glycerol toe te voegen aan een eindconcentratie van 20% en verzegelde buizen voor onbepaalde tijd op te slaan bij -80 °C.

2. Opslag en cultivering voorwaarden van H9c2 cardiale myoblast-achtige cellen

  1. Koop of verkrijg een bevroren voorraad H9c2-cellen, evenals Dubelco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met hoge glucose en pyruvaat, Foetale Runderserum (FBS), L-glutamine (Glut) en een Penicilline-Streptomycine-Glutamine mengsel (PSG).  FBS, Glut en PSG moeten worden opgeslagen bij -20 °C, terwijl DMEM kan worden bewaard bij 4 °C. Het is nuttig om FBS in 50 ml conische buizen te doen voordat het invriest.
  2. Ontdooi in een laminaire stromingskap twee aliquots FBS. Voeg één aliquot toe aan een fles DMEM van 500 ml, waardoor een 10% FBS/DMEM-mengsel wordt. Voeg hier 6 ml glut aan toe en vul de resulterende oplossing aan bij 4 °C. Deze oplossing kan worden gelabeld als "DMEM zonder antibiotica." (DMEM –Ab)
  3. Voeg aan een tweede fles DMEM van 500 ml de andere 50 ml aliquot FBS toe. Voeg aan deze oplossing 6 ml PSG toe en bouillon bij 4 °C. Deze oplossing kan worden gelabeld als "DMEM met antibiotica." (DMEM +Ab)
  4. Verwijder in de laminaire kap 10 ml DMEM +Ab en plaats deze in een weefselkweekkolf van 25 ml.
  5. Laat de kolf in de lamineerkap, verwijder een bevroren aliquot H9c2-cellen uit de opslag in vloeibare stikstof en plaats de buis snel in een waterbad van 37 °C totdat de cultuur is ontdooid.
  6. Besproei de buis met 70% ethanol om te ontsmetten en keer dan terug naar de kap. Werk snel om de celtijd in geconcentreerde DMSO te minimaliseren, voeg de volledige hoeveelheid cellen toe aan de 10 ml DMEM +Ab.  Dit verdunt de DMSO voldoende voor de levensvatbaarheid en therapietrouw van de nachtcel.
  7. Plaats de kolf 's nachts in een weefselkweek-incubator bij 37 °C, 5% C02en 95% vochtigheid.
  8. Controleer de volgende ochtend de cellaag om de hechting te garanderen. Cellen zullen waarschijnlijk tussen 80-100% samenvloeien tegen deze tijd.
  9. Verwijder in de weefselkweekkap de media in de kolf met behulp van het vacuüm, waarbij alleen de cellen in de kolf achterblijven.
  10. Voeg ongeveer 2 ml 0,25% Trypsine-EDTA toe aan de cellen en schommel zachtjes gedurende ongeveer 3 seconden.
  11. Keer de kolf zodanig om dat de trypsineoplossing niet meer in contact komt met de monolaag en verwijder de trypsine vacuüm.
  12. Voeg een tweede 2 ml aliquot trypsine toe aan de cellen en verplaats de kolf naar een omgekeerde microscoop. Observeer de cellen terwijl u voorzichtig met de kolf schommelt om ervoor te zorgen dat de monolaag zich verspreidt.
  13. Zodra de monolaag is gedispergeerd, keert u onmiddellijk terug naar de weefselkweekkap en voegt u 4 ml DMEM +Ab toe aan de celsuspensie.
  14. Verwijder een deel van de celsuspensie van 2 ml en voeg deze toe aan een weefselkweekkolf van 50 ml met 23 ml DMEM +Ab. Wieg de kolf voorzichtig en plaats deze vervolgens in de weefselkweek-incubator in de in stap 2.5 vermelde omstandigheden.
  15. Controleer de cellen dagelijks tot ze ongeveer 80% samenvloeiing bereiken (ongeveer 2,0-4,0 x 105 cellen per ml). Het is erg belangrijk dat cellen niet te samenvloeien, omdat ze kunnen differentiëren in skeletspier myotubes wanneer ze langdurig verhongeren van FBS14 en deze differentiatie kan bacteriële invasie veranderen.  Bewaak de cellen zorgvuldig en begin met een nieuwe buis cellen als een kweek samenvloeit.
  16. Zodra de cellen 80% samenvloeiing bereiken, kunnen ze ofwel in een andere kolf van 50 ml worden gepasseerd zoals zojuist beschreven, of worden voorbereid op invasietest.

3. H9c2-cellen voorbereiden op invasietest

  1. Verwijder in de weefselkweekkap de media uit een kolf van 50 ml H9c2-cellen die 80% samenvloeiing hebben bereikt met behulp van vacuümaspiratie.
  2. Voeg 4 ml 0,25% Trypsine-EDTA-oplossing toe aan de monolaag en verwijder onmiddellijk met vacuümaspiratie.
  3. Voeg nog eens 4 ml portie 0,25% Trypsine-EDTA toe aan de kolf en verplaats de kolf naar een omgekeerde microscoop om de dispersie van de monolaag te observeren.
  4. Zodra de cellen zich hebben verspreid, keert u terug naar de kap en voegt u 4 ml DMEM –Ab toe aan de cellen. Door de oplossing op en neer te pipetten, worden cellen volledig uit de bodem van de kolf verwijderd.
  5. Verwijder na resuspensie van de monolaag alle suspensie en plaats deze in een conische buis van 50 ml.
  6. Verwijder een 20 ul gedeelte van deze suspensie en tel het aantal cellen per milliliter met behulp van een hemocytometer.
  7. Zodra de concentratie cellen in de oplossing is bepaald, past u de concentratie aan op 2,25 x 104 cellen/ml door het juiste volume celoplossing toe te voegen aan verse DMEM –Ab. Het totale volume van de aangepaste oplossing moet 25 ml bedragen.
  8. Steriliseer in de kap glazen afdeklips door ze in 90% ethanol te dompelen en elke afdeklip kort door een vlam te laten gaan. Voeg elke deklip toe aan een individuele put van een 24-well weefselkweek behandelde plaat direct nadat deze is gesteriliseerd.
  9. Nadat alle putten een individuele afdeklip hebben, gebruikt u een pipet van 25 ml om 1 ml van de verdunde celoplossing toe te voegen aan elk van de putten in de plaat en duwt u elke afdeklip naar beneden met een steriele naald.
  10. Controleer elke put met behulp van een omgekeerde microscoop om ervoor te zorgen dat er vergelijkbare hoeveelheden cellen in elke put zitten. Plaats de 24 putplaat 's nachts in de weefselkweek-incubator bij 37 °C in 5% CO2 en 95% vochtigheid.
  11. Bekijk de volgende ochtend elke put om ervoor te zorgen dat de coverslips vergelijkbare hoeveelheden aanhechtings myoblasten hebben en dat de coverslips niet in de put drijven.

4. Het voorbereiden van stammen van L. monocytogenes voor invasietesten

OPMERKING: Alle laboratoriumwerkzaamheden worden uitgevoerd volgens de RICHTLIJNEN van CDC Biosafety Level 2.

  1. Gebruik na het bereiden van de 24-putplaat voor assay een gesteriliseerde lus om enkele kolonies van de stammen te verwijderen die moeten worden onderzocht op bacteriële invasie en inenten elk in individuele buizen van 14 ml met 2 ml BHI-bouillon.
  2. Plaats de ingeënte buizen in een incubator van 37 °C gekanteld op 45° en incubeer 's nachts statisch (zonder te schudden).
  3. Verwijder de volgende ochtend de kweekbuis kort uit de incubator en vortex om een uniforme suspensie van de bacteriën te garanderen.
  4. Meet de optische dichtheid van de cultuur met behulp van een spectrofotometer met een golflengte van 600 nm. Zorg ervoor dat u de spectrofotometer nult met steriele BHI-bouillon voordat u de optische dichtheid leest.
  5. Voor L. monocytogenesis de optische dichtheid direct gerelateerd aan de concentratie bacteriën per ml, zodat een dichtheid van 1.000 = 1,0 x 109 KVE per ml.
  6. Bereken de hoeveelheid cultuur die nodig is om 2,25 x 104 cellen te infecteren met 2,25 x 106 (MOI = 100).
  7. Verwijder de benodigde hoeveelheid kweek en plaats deze in een centrifugebuis van 1,5 ml.
  8. Draai de cultuur gedurende 3 minuten op 19.000 x g en gooi het supernatant weg. Tik op het open uiteinde van de buis tegen een keukenpapier om overtollige media te verwijderen die aan de lip van de buis zijn geplakt.
  9. Resuspend de bacteriën in 1 ml steriel PBS, en vortex om voldoende mengen te garanderen. Dit mengsel moet ongeveer 2,25 x 106 KVE per 20 ul (1,125 x 108 KVE/ml) bevatten.

5. Het uitvoeren van de Invasion Assay

  1. Bereid de dag voor de invasietest 24-putplaten van H9c2-cellen voor zoals beschreven in rubriek 3, en en inent ook steriele BHI-bouillon met de gewenste stam(en) Listeria zoals beschreven in rubriek 4.
  2. Bereid met behulp van het protocol in sectie 4 PBS-geresuspendeerde culturen van de stammen voor die moeten worden beoordeeld op invasie. Opmerking: Infectieuze titer kan op dit punt worden beoordeeld door verdunningen van elk monster op vaste media te plateren en kolonies na nachtelijke incubatie op te sommen.
  3. Laad ten minste 20 ul van de PBS-bacterieoplossing in individuele putten van de 24-putplaat. Merk op dat er ten minste drie afzonderlijke putten nodig zijn voor elke stam om resultaten in drievoud te verkrijgen, zodat maximaal 8 stammen samen kunnen worden beoordeeld.
  4. Na het laden van de putten met bacteriën, schommel de plaat voorzichtig om homogene verspreiding van elk monster in de put aan te moedigen en plaats de 24-putplaat terug in de incubator gedurende 45 minuten incubatie bij 37 °C en 95% vochtigheid, met 5% CO2.
  5. Bereid tijdens deze incubatie een aliquot DMEM – Ab (sectie 2) door simpelweg 25 ml DMEM –Ab te verwijderen en in een valkbuis van 50 ml (of gelijkwaardig) te plaatsen.
  6. Voeg gentamicine toe aan de 25 ml DMEM –Ab aliquot tot een concentratie van 15 ug/ml (7,5 ul van een 50 mg/ml stamoplossing). Plaats de DMEM –Ab +Gent oplossing in een waterbad van 37 °C gedurende de incubatietijd van 45 minuten.
  7. Aliquot 25 ml PBS in een valkbuis van 50 ml en plaats in het waterbad van 37 °C tijdens de incubatie van 45 minuten.
  8. Nadat de incubatie van 45 minuten is voltooid, verwijdert u de 24-putplaat en plaatst u deze in de kap. Verwijder de media die bacteriën bevatten uit elke put door vacuüm aspiratie, het veranderen van glazen pipet tips tussen verschillende stammen.
  9. Voeg ongeveer 1 ml PBS toe aan elke put om losjes hechtende bacteriën van het oppervlak van de cellen te wassen en verwijder vervolgens de PBS met vacuümaspiratie.
  10. Voeg na volledige verwijdering van PBS 1 ml DMEM –Ab +Gent toe aan elke put. De gentamicine zal alleen die bacteriën doden die buiten de cellen blijven, dus degenen die intracellulair zijn, blijven levensvatbaar.
  11. Plaats de 24-putplaat terug in de incubator en laat nog een uur incuberen.
  12. Bereid gedurende de incubatie van een uur 14 ml polypropyleenbuizen door 1 ml steriele ddH2 0aan elke buis toe te voegen. Voor elke afdeklip is één buis nodig, dus voor één 24-put plaat, bereid 24 buizen in totaal.
  13. Verwijder na de incubatie van een uur de 24-putplaat uit de incubator en plaats deze in de kap, samen met de buizen die zijn voorbereid in stap 5.12.
  14. Verwijder met een steriel pincet elke afdeklip uit de betreffende put en plaats deze onmiddellijk in een afzonderlijke buis. Zorg ervoor dat u het pincet in ethanol dompelt en tussen elke afdeklip vlamt om besmetting te voorkomen.
  15. Nadat alle afdeklips zijn verwijderd en in afzonderlijke buizen zijn geplaatst, gooit u de 24-putplaat weg.
  16. Keer terug naar de bank en draai elke buis gedurende 5-10 sec.
  17. Verwijder een gedeelte uit elke buis en plaats elk monster in een afzonderlijke put van een plaat met 96 putten en verdun elk monster vervolgens serieel met 1:10 verdunningen tot een verdunning van 1:1.000.
  18. Gebruik voorverwarmde en droge LB-platen en spot elk van de verdunningsreeksen op de agarplaten. Een meerkanaals pipet kan worden gebruikt om 5-10 μl vlekken uit de verdunningsreeks van elk monster te borderen.
  19. Verwijder ook 20 μl monsters uit elke onverdunde put en spot deze hoeveelheid rechtstreeks op LB agar op een aparte plaat uit de verdunningsreeks. (Dit grotere volume kan worden gebruikt om slecht invasieve stammen op te sommen).
  20. Nadat alle monsters zijn gevlekt, gooit u de 14 ml buizen met de afdeklipjes weg. Parafilm de 96-put plaat en plaats deze in een diepvriesdoos op -80 °C om te spatten, indien nodig.
  21. Laat de vlekken volledig drogen. Dit proces wordt sterk versneld door de platen in de kap te plaatsen en de deksels te verwijderen.
  22. Nadat de vlekken zijn opgedroogd, plaatst u de platen 's nachts in een incubator van 37 °C.
  23. Tel de volgende ochtend het aantal kolonies op elke plek van de verdunningsreeks waarvoor kolonieaantallen gemakkelijk kunnen worden beoordeeld (tussen ongeveer 5 en 50 kolonies) (figuur 1), en gebruik de reeks om het aantal bacteriën per deklip voor elke beoordeelde stam te berekenen.

6. Stammen van L. monocytogenes voorbereiden op muizeninfecties

  1. Gebruik de avond voor infectie een gesteriliseerde lus om enkele kolonies van de gewenste stammen te verwijderen en inenten in individuele buizen van 14 ml met 2 ml BHI-bouillon.
  2. Plaats de ingeënte buizen in een incubator van 37 °C gekanteld op 45° en incubeer 's nachts statisch (zonder te schudden).
  3. Verwijder de volgende ochtend de kweekbuis kort uit de incubator en vortex om een uniforme suspensie van de bacteriën te garanderen.
  4. Meet de optische dichtheid van de cultuur met behulp van een spectrofotometer met een golflengte van 600 nm. Zorg ervoor dat u de spectrofotometer nult met steriele BHI-bouillon voordat u de optische dichtheid leest. (Voor L. monocytogenesis de optische dichtheid direct gerelateerd aan de concentratie bacteriën per ml, zodanig dat een dichtheid van 1.000 = 1,0 x 109 KVE per ml)
  5. Bereken de hoeveelheid cultuur die nodig is om elk dier te infecteren. Injecties bevatten doorgaans 200 μl PBS met 10.000 KVE van een individuele stam, wat zich vertaalt in een gewenste concentratie van 5,00 x 104 KVE/ml.
  6. Verwijder een aliquot van 5 μl van elke uiteindelijke verdunning en verdeel deze rechtstreeks over LB-agar.  Incubeer 's nachts bij 37 °C om de concentratie te bevestigen die wordt gebruikt voor inenting.
  7. Injecteer elke CFU-suspensie binnen 1 uur na het verdunnen (zie hieronder).

7. Het enten van L. monocytogenes in Muizen via Staartaderinjectie en het beoordelen van Bacteriële Last binnen de Lever, Milt, en Hart

Opmerking: Alle dierwerkzaamheden worden uitgevoerd in overeenstemming met de RICHTLIJNEN van CDC Biosafety Level 2.  Muizen worden meestal een week van tevoren besteld en samen met 5 dieren per kooi gekooid. Muizen mogen vier dagen voor injectie wennen aan de nieuwe laboratoriumomgeving. Deze experimenten gebruikten 6-8 weken oude vrouwelijke Swiss-Webster muizen die 5 in een kooi in een barrièreomgeving werden gehuisvest en een niet-beperkt dieet kregen.

  1. Bereid één kooi muizen tegelijk door het deksel en de voedsel- / waterbakken te verwijderen en de kooi vijf minuten onder een hittelamp te plaatsen. Dit proces zorgt ervoor dat de staartaders verwijden, waardoor injecties gemakkelijker uit te voeren zijn.
  2. Verwijder één dier en plaats het in een harnas (of valkbuis met het uiteinde afgesneden) om het dier tijdens de injectie vast te houden.
  3. Reinig de injectieplaats met een alcoholkussen en laat de alcohol verdampen. Dit reinigt niet alleen de site, maar verwijdt ook de staartader verder.
  4. Injecteer de muis met een spuit van 1 ml met een naald van 27,5 gauge voorzichtig met 200 μl van de gewenste cultuur in de staartader.
  5. Gebruik een gaas om eventuele bloedingen als gevolg van de injectie te stoppen en plaats het dier in een verse kooi.
  6. Herhaal dit proces voor de resterende dieren en stammen. Zorg ervoor dat u elke kooi met dieren labelt met de stam die ze hebben ontvangen.
  7. Controleer dagelijks de dieren en verwijder en offer alle dieren op die ziek lijken te zijn.  Als geen dieren tekenen van ziekte vertonen, laat de infecties dan 72 uur duren voordat u alle dieren opoffert.
  8. Om op te offeren, gebruik CO2-anesthesie uit een gebottelde bron totdat alle ademhalingen zijn gestopt en gebruik vervolgens cervicale dislocatie om ervoor te zorgen dat het dier dood is.
  9. Na het offeren, verplaats de dieren naar een weefselkweekkap voor dissectie.
  10. Gebruik een dissectieblok, speld elk been van het dier met grote meternaalden en besproei het dier met 70% ethanol totdat het verzadigd is.
  11. Snijd de huid van de buik en thorax terug met behulp van een Y-vormige incisie die zich uitstrekt van de vaginale opening tot het xiphoid-proces, en vervolgens doorgaat tot aan de oksel van elke arm.
  12. Trek de huid terug en verwijder de naalden van elk been om de dissectie open te houden.
  13. Snijd voorzichtig door het buikvlies en stel de darmen, maag, lever en milt bloot.
  14. Door eerst de leverader en het coronale ligament aan de bovenkant van de lever te snijden, begint u de lever te verwijderen. Extra ligamenten die moeten worden verwijderd, bevinden zich onder de lever en verbinden deze met het eerste deel van de dunne darm, evenals met het spierstelsel van de rug.
  15. Plaats de lever in 5 ml steriele ddH20 in een valkbuis van 50 ml.
  16. Verwijder vervolgens de milt door deze te isoleren en snijd de vasculatuur en ligamenten voorzichtig weg. De milt zal gemakkelijker worden verwijderd dan de lever. Plaats de milt in een aparte valkbuis met 5 ml steriele ddH20.
  17. Plaats het membraan en snijd voorzichtig langs de ribbenkast om de thorax te visualiseren. Snijd door het xiphoid proces en borstbeen tot het niveau van de nek om de thorax te openen, waardoor het hart en de longen bloot komen te staan.
  18. Pak met een tang het hart voorzichtig bij de top en til het zo op dat de aorta en longvaten in spanning staan. Snijd deze vaten om het hart te bevrijden.
  19. Plaats het hart in een valkbuis van 50 ml met 5 ml steriele ddH20.
  20. Gooi het karkas van de muis weg en herhaal dit proces voor elk dier, met behulp van schone valkbuizen met 5 ml steriele ddH20 voor elk verwijderd orgaan.
  21. Nadat alle organen zijn verwijderd, reinigt u het werkstation en keert u terug naar de bank.
  22. Bereid een set van 5 buizen voor voor het reinigen en steriliseren van de homogenisator voor elke set organen van vijf muizen(d.w.z. een set van 5 buizen voor 5 levers, 5 buizen voor 5 milt en 5 buizen voor 5 harten). Vier van elk van de tubes moeten worden gevuld met 30 ml steriele ddH20 en één moet worden gevuld met 30 ml 90% EtOH.
  23. Dompel met behulp van een TissueMaster (of gelijkwaardige homogenisator) de homogenisator (tijdens het hardlopen) in de buizen die in stap 7.21 zijn voorbereid om de sonde schoon te maken:
  24. Buis 1 (ddH2O)
    5 sec in buis 2 (ddH2O)
    5 sec in Tube 3 (EtOH)
    5 sec in buis 4 (ddH2O)
    5 sec in buis 5 (ddH2O)
  25. Homogeniseer één lever met behulp van de homogenisator gedurende ten minste 2 minuten, of totdat er geen zichtbare delen van het orgaan overblijven. Gebruik een pincet om groot vuil van de sonde te verwijderen.
  26. Herhaal het reinigingsproces beschreven in stap 7.22
  27. Herhaal het homogenisatieproces voor de andere levers en zorg ervoor dat u de sonde tussen elke lever wast met behulp van het proces dat in stap 7.22 wordt beschreven.
  28. Nadat alle levers volledig gehomogeniseerd zijn, gooi je de wasbuizen (1-5) weg voor de lever.
  29. Herhaal het homogeniseren/reinigen proces ook voor zowel de milt als de harten, zorg ervoor dat u een nieuwe set wasbuizen gebruikt voor elke reeks organen. Als de wasbuizen op enig moment troebel worden, gooi ze dan weg en vervang ze door nieuwe buizen om de serie af te maken.
  30. Nadat alle organen zijn gehomogeniseerd, doet u nog een laatste reinigingscyclus op de homogenisator en droogt u deze goed af voor opslag.
  31. Plaats ongeveer 200 μl van elk orgaan in een afzonderlijke put van een plaat met 96 putten.
  32. Voer seriële verdunningen uit op de orgaanmonsters door 1:10 in een reeks te verdunnen tot een verdunning van 1:10.000 (lever en milt) of tot een verdunning van 1:1.000 (hart).
  33. Spotplaat de verdunningsreeks op voorverwarmde LB-agar. Verwijder ook 20 ul van elk onverdund orgaan en plaat op afzonderlijke LB agar platen om de CFU op te sommen van slecht gekoloniseerde organen.
  34. Gooi de valkbuizen met de gehomogeniseerde organen weg en wikkel de 96-putplaten met de verdunningsreeks in met parafilm en plaats deze in een diepvriesdoos bij -80 °C.
  35. Laat de vlekken drogen. Dit proces wordt versnellen door de platen in de kap te plaatsen en de deksels te verwijderen.
  36. Nadat de vlekken zijn opgedroogd, plaatst u de platen 's nachts in een incubator van 37 °C.
  37. Tel de volgende ochtend het aantal kolonies op elke plek en gebruik de verdunningsreeks om het totale aantal bacteriën per orgaan te berekenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Geselecteerde isolaten van L. monocytogenes vertonen een verbeterde invasie van hartcellen in celkweek en in muismodellen van infectie. Figuur 1 toont een voorbeeld van hoe bacteriële kolonies kunnen verschijnen na het spotten van suspensies op agarmedia. Deze methode maakt een nauwkeurige beoordeling van CFUs in een monster mogelijk zonder grote aantallen agar-mediaplaten te gebruiken. Figuur 2 toont een voorbeeld van een weefselkweek-gebaseerde test waarbij het vermogen van stam 10403S om hartcellen binnen te dringen wordt vergeleken met die van stam 07PF0776. Meer dan twee keer zoveel 07PF0776 bacteriële CFU kan worden hersteld van geïnfecteerde H9c2 hartcellen na gentamicine behandeling in vergelijking met cellen geïnfecteerd met 10403S. Verschillen van 2 tot 4-voudig worden routinematig waargenomen voor cardiotrope stammen met behulp van deze test. Figuur 3 toont een voorbeeld van het herstel van bacteriën uit de levers, milt en harten van geïnfecteerde muizen na 3 dagen na infectie. De infectie van muizen met de cardiotrope stam 07PF0776 of stam 10403S resulteert in vergelijkbare aantallen bacteriën die zijn teruggevonden uit de levers en milt van geïnfecteerde muizen, maar muizen die besmet zijn met 07PF0776 hebben meer kans om detecteerbare aantallen bacteriën uit het hart op te leveren en grotere bacteriële lasten in dit orgaan te vertonen.

Figure 1
Figuur 1: Voorbeeld van spotplating techniek voor het bepalen van bacteriële CFUs. H9c2-cellen gekweekt op glazen afdeklips en geïnfecteerd met L. monocytogenes werden gelyseerd en suspensus werden serieel verdund met 1:10 verdunningen tot een verdunning van 1:1.000 (linkerpaneel). Een meerkanaals pipet werd gebruikt om 10 ul van elke put rechtstreeks op een LB-agarplaat te pipetten, en de plaat werd 's nachts geïncubeerd bij 37 °C (rechterpaneel). Het aantal bacteriën per deklip wordt beoordeeld door bacteriële KVE te tellen die geassocieerd is met de juiste verdunning.

Figure 2
Figuur 2: L. monocytogenes stam 07PF0776 vertoont een verbeterde invasie van hartcellen in weefselkweek. Invasietesten werden uitgevoerd in H9c2-cellen met behulp van een MOI = 100. Grafiek toont de gemiddelde aantallen intracellulaire bacteriële CFUs die +/- SE zijn teruggevonden uit cellen die besmet zijn met 10403S (zwart) versus de cardiotrope 07PF0776 stam (blauw). ** geeft een betekenis van p <0,01 aan.

Figure 3
Figuur 3: L. monocytogenes stam 07PF0776 vertoont verbeterde invasie van het hart in muis infectie modellen. Dieren werden ingeënt met 10.000 KVE via de staartader. Infecties mochten 72 uur vorderen, waarna de dieren werden geofferd en de levers, milt en harten werden verzameld en verwerkt om bacteriële KVE per orgaan te bepalen. Vaste cirkels vertegenwoordigen de CFU verkregen van individuele muizen, met de gemiddelde waarde voor alle dieren binnen een groep aangegeven door een lijn +/- SE. De procentuele waarden geven het aantal dieren aan dat detecteerbare bacteriële KVE in het hart bevat. * geeft een betekenis van p <0,05 aan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L. monocytogenes is een wijdverspreide en goed gekarakteriseerde menselijke ziekteverwekker, die in staat is om een aantal verschillende ziektemanifestaties te veroorzaken15. De bacterie is eerder beschreven voor zijn vermogen om over barrières, zoals de bloed -hersenbarrière en placenta-foetale barrières, om respectievelijk het centrale zenuwstelsel te bereiken en te koloniseren en foetus te ontwikkelen. Het in vivo vermogen van het organisme om deze weefsels te koloniseren wordt vaak aangevuld met een in vitro vermogen om de representatieve cellen binnen te dringen in de cultuur die deel uitmaken van de beoogde organen. Invasie van epitheelcellen in de choroïdplexus is bijvoorbeeld geassocieerd met het vermogen van het organisme om het CZS te koloniseren16; en villous trofoblast explants zijn gebruikt om de maternale-foetale barrière te vertegenwoordigen17. In dit protocol zijn methoden beschreven die nuttig zijn voor het beoordelen van bacteriële invasie van hartcellen in cultuur en voor vergelijking van bacteriële kolonisatie van het hart voor individuele isolaten ten opzichte van kolonisatie van de lever en milt.

Dit protocol bevat een aantal kritieke stappen, maar een van de meest kritieke zijn die waarbij de juiste bacteriële KVE wordt gebruikt voor de infectie van weefselkweekcellen die op coverslips zijn gekweekt of de infectie van dieren. Als het bacteriële KVE-nummer niet correct wordt gecontroleerd tussen verschillende putten en dieren, kunnen geen directe vergelijkingen tussen monsters worden gemaakt. Het is belangrijk om de verdunningsreeksen die worden gebruikt om de inocula te genereren, dubbel te controleren door de uiteindelijke verdunningen op mediaplaten te beplaten om te garanderen dat het bacteriële KVE-nummer nauwkeurig is geschat.

De H9c2-cellen die bij deze test worden gebruikt, zijn afgeleid van de onderste helft van een embryonaal rattenhart van 13 dagen, dat voornamelijk ventriculair weefselomvatte 18. De cellen vermeerderen zich als mononucleaire myoblasten en bij het bereiken van confluency in weefselkweek kolven of schotels beginnen multinucleated tubulaire structuren te vormen. De cellen hebben een generatietijd van ongeveer 30 uur18. Serumuithongering van H9c2-cellen is geassocieerd met differentiatie van de cellen in skeletspiercellen, terwijl behandeling van de myoblasten met 10 nM all-trans retinoïnezuur is geassocieerd met myoblastdifferentiatie in cardiale myocyten14. Dit protocol was gericht op L. monocytogenes myoblastcelinvasie, maar de H9c2-cellijn is een veelzijdige cellijn die kan worden gebruikt om de effecten van gecontroleerde celdifferentiatie op bacteriële invasie te onderzoeken.

De L. monocytogenes stam 07PF0776 was oorspronkelijk geïsoleerd van een hiv-geïnfecteerde patiënt die een niet-resusitatable asystolische arrestatie had als gevolg van een invasieve L. monocytogenes infectie van het hart8. Latere analyse van deze stam in muisinfectiemodellen gaf aan dat het een verbeterde capaciteit had om hartweefsel te targeten en binnen te dringen. Een beperkte analyse van aanvullende willekeurige isolaten van L. monocytogenes suggereert dat subpopulaties van bacteriële isolaten in staat zijn om de harten van muizen te infecteren bij afwezigheid van eerdere schade aan hartweefsel of hartkleppen8. Interessant is dat twee van de best gekarakteriseerde L. monocytogenes stammen, 10403S en EGD, slechte kolonisten van hartcellen en weefsel bleken te zijn. Genoomsequencing van het 07PF0776-isolaat heeft de aanwezigheid van nieuwe pathogeniteitseilanden niet aan het licht brengen of bewijs geleverd van unieke genclusters19; dit suggereert dat 07PF0776 richt hartcellen voor invasie door wijziging van haar bestaande arsenaal van virulentie gen producten. Voorlopige histochemische analyse geeft aan dat 07PF0776 abcessen vormt in geïnfecteerde muizenharten die lijken op het abces dat is waargenomen bij de oorspronkelijke geïnfecteerde menselijke patiënt (gegevens niet getoond). Of andere cardiotrope L. monocytogenes isolaten vergelijkbare hartabcesvorming veroorzaken, moet nog worden bepaald.

De hier gepresenteerde onderzoeken kunnen eenvoudig worden aangepast om het onderzoek van verschillende aspecten van infectie te vergemakkelijken. Individuele coverslips kunnen worden bevestigd en gekleurd voor licht- of fluorescentiegebaseerde microscopie, de incubatietijden van weefselkweek kunnen worden verhoogd voor het meten en vergelijken van intracellulaire groeisnelheden van bacteriën, weefsels en organen kunnen paraffine worden ingebed en verwerkt voor microscopisch onderzoek om abcesvorming en bacteriële distributie op cellulair niveau te onderzoeken. Bij het beoordelen van niveaus van bacteriële invasie van weefselkweekcellen of kolonisatie van gastheerweefsels, zijn er beperkingen in termen van de minimale hoeveelheid bacteriën die elke test kan detecteren. In vitro invasietesten hebben een ondergrens van detectie van ongeveer 300 KVE per deklip. Het aanpassen van het volume water dat wordt gebruikt om de deklips te vortexen, kan de detectie van lage aantallen bacteriën verbeteren, waarbij cellysisvolumes tot 500 μl nuttig blijken te zijn om slecht invasieve stammen te detecteren. Coverslips kunnen kort in steriel water worden gedompeld om overtollige gentamicine te verwijderen voordat gastheercellen in kleinere hoeveelheden worden gelyseeerd. Volumeniveaus tot 5 ml of meer kunnen worden gebruikt om zeer invasieve stammen correct op te sommen. Bij de dieren kunnen orgaanhomogenaten worden gegenereerd in volumes van 5 ml of 10 ml ddH20, waarbij lagere volumes nuttig zijn om lagere niveaus van bacteriën te detecteren en hogere volumes om zwaar gekoloniseerde organen beter op te sommen. Het minimale detectiebereik voor geïnfecteerde organen is ongeveer 100 KVE. Als organen consequent op hoge niveaus worden gekoloniseerd, overweeg dan om een groter volume water (10 ml) te gebruiken en meer verdunningen uit te voeren binnen de 96-putplaat.

De beschreven methoden kunnen worden toegepast op organen en weefsels buiten het hart. Invasietesten en muisinfecties zoals deze zijn gebruikt om kolonisatie te beoordelen op een groot aantal locaties, waaronder de placenta, hersenen, galblaas, lever en darm. Wijzigingen in de hierboven beschreven protocollen kunnen ook worden aangebracht om hyperinvasieve en/of hypervirulente stammen op te vangen, en vervanging van hartcellen door andere celtypen kan worden gedaan om invasiefenotypen op plaatsen buiten het cardiovasculaire systeem te beoordelen. Aangezien verschillende celtypen de gevoeligheid voor L. monocytogenes invasie hebben veranderd, kan het nodig zijn parameters zoals MOI en incubatietijden aan te passen om gegevens van de assays nauwkeurig te herstellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs melden geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Public Health Service AI41816 en AI099339 (N.E.F.) en door F31AI094886-01 (P.D.M.) van NIAID. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de financieringsbronnen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco BHI Broth Base 237200 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2 kg of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12 mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14 ml Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75 cm2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
  2. Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
  3. Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
  4. Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
  5. Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
  6. Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
  7. Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
  8. Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
  9. Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
  10. Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
  11. Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
  12. Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
  13. McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
  14. Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
  15. Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
  16. Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  17. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
  18. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
  19. McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).

Tags

Infectie Bacteriële pathogenese intracellulaire pathogene weefseltropisme bacteriële invasie hartinfectie listeriose
Beoordeling van bacteriële invasie van hartcellen in cultuur en hartkolonisatie bij geïnfecteerde muizen met <em>listeria monocytogenes</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McMullen, P. D., Freitag, N. E.More

McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter