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Immunology and Infection

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52497
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

Summary

Listeria monocytogenes verursacht fetale Infektionen bei Schwangeren und Meningitis in anfälligen Populationen. Subpopulationen von Bakterien können Herzgewebe besiedeln, was bei Patienten und Labortieren Zufluss zu Myokarditis führt. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie L. monocytogenes Herzzellinvasion in vitro und Herzkolonisation bei infizierten Tieren zu bewerten.

Abstract

Listeria monocytogenes ist ein grampositiver fakultativer intrazellulärer Erreger, der in der Lage ist, schwere invasive Infektionen bei immungeschwächten Patienten, älteren Menschen und Schwangeren zu verursachen. Die häufigsten Manifestationen der Listeriose beim Menschen sind Meningitis, Enzephalitis und fetale Abtreibung. Eine signifikante, aber viel weniger dokumentierte Fortsetzung der invasiven L. monocytogenes Infektion betrifft das Herz. Die Sterblichkeitsrate durch Herzerkrankungen kann trotz Behandlung bis zu 35% betragen, allerdings ist sehr wenig über die Besiedlung von Herzgewebe und deren folgenden Pathologien bekannt. Darüber hinaus hat sich in jüngster Zeit gezeigt, dass Subpopulationen von L. monocytogenes eine verbesserte Fähigkeit haben, in Herzgewebe einzudringen und zu wachsen. Dieses Protokoll beschreibt detailliert In-vitro- und In-vivo-Methoden, die zur Beurteilung des Kardiographenvon L. monocytogenes Isolate verwendet werden können. Methoden werden zur Infektion von H9c2-Ratten-Herzmyoblasten in der Gewebekultur sowie zur Bestimmung der bakteriellen Besiedlung der Herzen infizierter Mäuse vorgestellt. Diese Methoden sind nicht nur nützlich, um Stämme mit dem Potenzial zu identifizieren, Herzgewebe bei infizierten Tieren zu besiedeln, sondern können auch die Identifizierung von bakteriellen Genprodukten erleichtern, die dazu dienen, die Invasion von Herzzellen zu verbessern und/oder Veränderungen in der Herzpathologie voranzutreiben. Diese Methoden sehen auch den direkten Vergleich des Kardiontropismus zwischen mehreren L. monocytogenes Stämmen vor.

Introduction

Listeria monocytogenes ist ein grampositiver intrazellulärer Erreger, der schwere Krankheiten in anfälligen Populationen verursachen kann, einschließlich älterer Menschen, Schwangerer, HIV/AIDS-Patienten und Patienten, die eine Chemotherapie erhalten1. Infektionen in diesen Populationen sind häufig das Ergebnis der Einnahme kontaminierter Lebensmittel, und die meisten Infektionen sind mit großangelegten lebensmittelbedingten Ausbrüchen verbunden2,3. Bei Menschen und anderen Säugetieren ist L. monocytogenes in der Lage, sich über die Epithelgrenze des Dünndarms zu transortieren und anschließend in die Leber transportiert zu werden4,5. Tiermodelle deuten darauf hin, dass aufgenommene Bakterien sich innerhalb der Darmzotten vermehren und durch die Portalvene in die Leber gelangen oder sich über die mesenterischen Lymphknoten in den Blutkreislauf ausbreiten, was zu einer hämatogenen Verbreitung in der Leber und Milz6,7führt. In der Leber und Milz ist das Bakterium in der Lage, sowohl in professionelle Phagozyten als auch in ansässigen parenchymalen Zellen zu vermitteln und stellt schnell Infektionen in diesen Organen her. Mit zunehmender bakterieller Belastung werden zahlreiche Bakterien wieder ins Blut verteilt, wo sie in der Lage sind, empfängliche Gewebe, einschließlich des zentralen Nervensystems und der Plazenta (sofern vorhanden), weiter zu besiedeln. Kolonisierung dieser Standorte schließt die häufigsten Manifestationen der Listeriose beim Menschen, einschließlich Meningitis, Enzephalitis, und fetale Abtreibung2.

Ausgewählte Subpopulationen von L. monocytogenes haben vor kurzem gezeigt, dass eine verbesserte Fähigkeit, in Herzgewebe eindringen und replizieren8. Manifestationen der Herzbeteiligung sind vielfältig und reichen von Endokarditis und Perikarditis bis hin zu fulminanten Myokarditis mit Leitstörungen9-13. Die Gesamtzahl der L. monocytogenes Herzfälle pro Jahr ist gering, kann aber unterschätzt werden, da diese Facette der Infektion im Allgemeinen nicht gut erkannt wird. Die Besiedlung des Herzens durch Krankheitserreger erfordert oft Wirtsveranlagungen wie bereits bestehende Valvularschäden oder künstliche Herzklappen. Es gibt jedoch Isolate von L. monocytogenes, die identifiziert wurden, die für ihre Fähigkeit, die Herzen der infizierten Tiere in Ermangelung von Herzschäden und/oder Anomalien8zu besiedeln bemerkenswert sind.

Hierin werden in vitro und in vivo Methoden zur Beurteilung der bakteriellen Besiedlung von Herzgewebe in infizierten Tieren mit Invasions-Assays in der Gewebekultur sowie lebenden Tierinfektionen beschrieben. Diese Methoden haben sich nicht nur bei der Identifizierung von Stämmen mit dem Potenzial zur Besiedlung von Herzgewebe bei infizierten Tieren als nützlich erwiesen, sondern sollten auch für die Identifizierung von bakteriellen Genprodukten nützlich sein, die dazu dienen, die Invasion von Herzzellen zu verbessern und/oder zu Veränderungen in der Herzpathologie führen. Diese Methoden erleichtern den Vergleich des Kardiographen zwischen mehreren Stämmen. Für die hier beschriebenen Methoden wird L. monocytogenes 10403S als gut untersuchter Vertreter eines nichtkardiotropen Stammes und das klinische Isolat 07PF0776 als repräsentatives Beispiel für einen kardiotropen Stamm verwendet. Diese beiden Stämme wurden ausgewählt, um einen Vergleich für die bakterielle Invasion von Herzzellen in vitro und die Besiedlung von Herzen infizierter Mäuse in vivozu liefern. Das Isolat 07PF0776 ist ein klinisches Isolat, das aus einem interventrikulären Abszess gewonnen wurde, der bei einem HIV+-Patienten eine tödliche Arrhythmie verursachte8. L. Monocytogenes-Isolate können in ihrem Virulenzpotenzial variieren, und angesichts der Neigung für Listerien, Personen mit Immunsuppression zu infizieren und Schwangere, sollten Personen innerhalb dieser Populationen bei der Beurteilung verschiedener klinischer Isolate Vorsicht walten lassen.

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Protocol

1. Lagerungs- und Kulturbedingungen für L. monocytogenes Stämme

  1. Bereiten Sie feste Medien vor, indem Sie Hirn-Herz-Infusionsagar (BHI) autoklavieren und die geschmolzenen Medien in Petriplatten gießen. Lassen Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, dann wieder bei 37 °C.
  2. Mit einer sterilen Schleife eine kleine Probe von L. monocytogenes aus zuvor hergestellten Gefrierbeständen (Bakterien, die in 20% Glycerin in Flüssigmedien von BHI suspendiert sind, bei -80 °C gelagert) oder aus einer Agarplatte, die Kolonien enthält, die zuvor für die Isolierung geschlagen wurden.
  3. Mit aseptischer Technik, streifen Sie die Probe für einzelne Kolonie Isolierung. Achten Sie darauf, die Schleife zwischen Querstreifen zu sterilisieren, um einen übermäßigen Übertrag zu verhindern und die Isolierung einzelner Kolonien des zu bewertenden Stammes zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Platte(n) über Nacht bei 37 °C.
  4. Mit einer sterilen Schleife eine Kolonie des Isolats entfernen und 2 ml BHI-Brühe (ohne Agar) in einem 14 ml Polystyrol-Röhrchen impfen.
  5. Bei Assays und Infektionen die Brühekultur über Nacht statisch (ohne Schütteln) in einem 37 °C-Inkubator bebrüten. Für den Strumpf von kultivierten Isolaten, bebrüten die Brühe Kultur bei 37 °C mit Schütteln bei 180-200 Rpm über Nacht. Kulturen können gelagert werden, indem Glycerin zu einer Endkonzentration von 20% hinzugefügt und versiegelte Rohre auf unbestimmte Zeit bei -80 °C gelagert werden.

2. Lagerungs- und Culturing-Bedingungen von H9c2-Herzmyoblast-ähnlichen Zellen

  1. Kaufen oder erhalten Sie einen gefrorenen Vorrat an H9c2-Zellen sowie Dubelcos Modified Eagle es Medium (DMEM), das hohe Glukose und Pyruvat enthält, Fetales Rinderserum (FBS), L-Glutamin (Glut) und ein Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Gemisch (PSG).  FBS, Glut und PSG sollten bei -20 °C gelagert werden, während DMEM bei 4 °C gelagert werden kann. Es ist hilfreich, FBS vor dem Einfrieren in 50 ml konische Röhrchen zu koalieren.
  2. In einer laminaren Strömungshaube zwei Aliquots von FBS auftauen. Fügen Sie ein Aliquot zu einer 500 ml Flasche DMEM hinzu, so dass eine 10% FBS/DMEM Mischung. Dazu 6 ml Glut hinzufügen und die resultierende Lösung bei 4 °C auffüllen. Diese Lösung kann mit "DMEM ohne Antibiotika" gekennzeichnet werden. (DMEM –Ab)
  3. Zu einer zweiten 500 ml Flasche DMEM die anderen 50 ml Aliquot von FBS hinzufügen. Zu dieser Lösung 6 ml PSG hinzufügen und bei 4 °C lagern. Diese Lösung kann als "DMEM mit Antibiotika" bezeichnet werden. (DMEM +Ab)
  4. In der laminaren Kapuze 10 ml DMEM +Ab entfernen und in einen 25 ml Gewebekulturkolben geben.
  5. Den Kolben in der laminaren Haube lassen, ein gefrorenes Aliquot von H9c2-Zellen aus der Lagerung in flüssigem Stickstoff entfernen und das Rohr schnell in ein 37 °C-Wasserbad legen, bis die Kultur aufgetaut ist.
  6. Sprühen Sie das Rohr mit 70% Ethanol, um zu desinitieren, und kehren Sie dann zur Haube zurück. Arbeiten Sie schnell, um die Zellzeit in konzentriertem DMSO zu minimieren, fügen Sie das volle Aliquot der Zellen zu den 10 ml DMEM +Ab hinzu.  Dadurch wird das DMSO ausreichend verdünnt, um die Zelllebensfähigkeit und -haftung über Nacht zu erreichen.
  7. Legen Sie den Kolben in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C, 5%C02und 95% Luftfeuchtigkeit über Nacht.
  8. Überprüfen Sie am nächsten Morgen die Zellschicht, um die Einhaltung zu gewährleisten. Die Zellen werden bis zu diesem Zeitpunkt wahrscheinlich zwischen 80-100% konfluent sein.
  9. Entfernen Sie in der Gewebekulturhaube die im Kolben enthaltenen Medien mit dem Vakuum, sodass nur die Zellen im Kolben bleiben.
  10. Ca. 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA in die Zellen geben und etwa 3 Sek. sanft schaukeln.
  11. Invertieren Sie den Kolben so, dass die Trypsin-Lösung nicht mehr in Kontakt mit der Monoschicht ist, und entfernen Sie das Trypsin durch Vakuum.
  12. Fügen Sie den Zellen ein zweites 2 ml Aliquot Trypsin hinzu und bewegen Sie den Kolben in ein umgekehrtes Mikroskop. Beobachten Sie die Zellen beim sanften Schaukeln des Kolbens, um sicherzustellen, dass sich die Monoschicht verteilt.
  13. Sobald die Monoschicht dispergiert ist, kehren Sie sofort zur Gewebekulturhaube zurück und fügen Sie 4 ml DMEM +Ab in die Zellsuspension ein.
  14. Entfernen Sie einen 2 ml-Teil der Zellsuspension und fügen Sie ihn einem 50 ml Gewebekulturkolben mit 23 ml DMEM +Ab hinzu. Den Kolben vorsichtig schaukeln und dann in den in Schritt 2.5 aufgeführten Bedingungen in den Inkubator der Gewebekultur geben.
  15. Überprüfen Sie die Zellen täglich, bis sie etwa 80% Zusammenfluss erreichen (ca. 2,0-4,0 x 105 Zellen pro ml). Es ist sehr wichtig, dass Zellen nicht zu konfluent werden, da sie sich in Skelettmuskelmyoröhren differenzieren können, wenn sie über einen längeren Zeitraum von14 an FBS verhungern, und diese Differenzierung kann die bakterielle Invasion verändern.  Überwachen Sie die Zellen sorgfältig und beginnen Sie mit einem neuen Zellrohr, wenn eine Kultur konfluent wird.
  16. Sobald die Zellen 80% Zusammenfluss erreichen, können sie entweder in einen anderen 50 ml Kolben, wie gerade beschrieben, durchgehen oder für den Invasionstest vorbereitet werden.

3. Vorbereitung von H9c2-Zellen für den Invasionstest

  1. Entfernen Sie in der Gewebekulturhaube die Medien aus einem 50 ml Kolben H9c2-Zellen, die 80% Zusammenfluss mit Vakuumaspiration erreicht haben.
  2. 4 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung in die Monoschicht geben und sofort mit Vakuumaspiration entfernen.
  3. Fügen Sie einen weiteren 4 ml Portion von 0,25% Trypsin-EDTA in den Kolben und bewegen Sie den Kolben zu einem invertierten Mikroskop, um die Dispersion der Monoschicht zu beobachten.
  4. Sobald sich die Zellen verteilt haben, kehren Sie zur Haube zurück und fügen Sie 4 ml DMEM –Ab in die Zellen ein. Das Pipettieren der Lösung nach oben und unten sorgt für eine vollständige Entfernung der Zellen vom Boden des Kolbens.
  5. Entfernen Sie nach der Resuspension der Monoschicht die gesamte Suspension und legen Sie sie in ein 50 ml konisches Rohr.
  6. Entfernen Sie einen 20 ul Teil dieser Suspension und zählen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit einem Hämozytometer.
  7. Sobald die Konzentration der Zellen in der Lösung bestimmt ist, stellen Sie die Konzentration auf 2,25 x 104 Zellen/ml ein, indem Sie das entsprechende Volumen der Zelllösung zu frischem DMEM-Ab hinzufügen. Das Gesamtvolumen der angepassten Lösung sollte 25 ml betragen.
  8. Während in der Haube, sterilisieren Glas Abdeckungen, indem sie in 90% Ethanol tauchen und kurz passieren jeden Abdeckungsrutsch durch eine Flamme. Fügen Sie jeden Coverslip direkt nach der Sterilisation in einen einzelnen Brunnen einer 24-Well-Gewebekultur-behandelten Platte ein.
  9. Nachdem alle Brunnen einen individuellen Deckelschlupf haben, verwenden Sie eine 25 ml Pipette, um 1 ml der verdünnten Zelllösung zu jedem der Brunnen in der Platte hinzuzufügen, und schieben Sie jeden Deckelrutsch mit einer sterilen Nadel nach unten.
  10. Überprüfen Sie jeden Brunnen mit einem invertierten Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich ähnliche Mengen an Zellen in jedem Brunnen befinden. Legen Sie die 24 Well-Platte über Nacht bei 37 °C in 5%CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit in den Inkubator der Gewebekultur.
  11. Sehen Sie sich am nächsten Morgen jeden Brunnen an, um sicherzustellen, dass die Abdeckungen vergleichbare Mengen an haftenden Myoblasten haben und dass die Abdeckungen nicht im Brunnen schweben.

4. Vorbereitung von Stämmen von L. monocytogenes für Invasions-Assays

HINWEIS: Alle Laborarbeiten werden gemäß den CDC-Richtlinien für Biosicherheit Level 2 durchgeführt.

  1. Nach der Vorbereitung der 24-Well-Platte für den Test, verwenden Sie eine sterilisierte Schleife, um einzelne Kolonien der Stämme zu entfernen, die auf bakterielle Invasion untersucht werden sollen, und impfen Sie jeweils in einzelne 14 ml-Röhrchen mit 2 ml BHI-Brühe.
  2. Die geimpften Rohre in einen 37 °C-Inkubator auf45° kippen und über Nacht statisch (ohne Schütteln) inkubieren.
  3. Am nächsten Morgen entfernen Sie die Kulturröhre aus dem Inkubator und wirbeln Sie kurz, um eine gleichmäßige Suspension der Bakterien zu gewährleisten.
  4. Messen Sie die optische Dichte der Kultur mit einem Spektralphotometer bei 600 nm Wellenlänge. Achten Sie darauf, das Spektralphotometer mit steriler BHI-Brühe zu nulln, bevor Sie die optische Dichte lesen.
  5. Bei L. monocytogenessteht die optische Dichte in direktem Zusammenhang mit der Konzentration von Bakterien pro ml, so dass eine Dichte von 1.000 = 1,0 x 109 KBE pro ml beträgt.
  6. Berechnen Sie die Kulturmenge, die benötigt wird, um 2,25 x 104 Zellen mit 2,25 x 106 (MOI = 100) zu infizieren.
  7. Entfernen Sie die benötigte Kulturmenge und legen Sie sie in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr.
  8. Drehen Sie die Kultur bei 19.000 x g für 3 min, dann entsorgen Sie den Überstand. Tippen Sie auf das offene Ende des Rohres gegen ein Papiertuch, um überschüssige Medien zu entfernen, die an der Lippe des Rohres kleben.
  9. Setzen Sie die Bakterien in 1 ml sterilem PBS aus, und Wirbel, um eine ausreichende Mischung zu gewährleisten. Dieses Gemisch sollte etwa 2,25 x 106 KBE pro 20 ul (1,125 x 108 KBE/ml) enthalten.

5. Durchführung des Invasions-Assays

  1. Am Tag vor dem Invasionstest bereiten Sie 24-Well-Platten von H9c2-Zellen wie in Abschnitt 3 beschrieben vor und impfen auch sterile BHI-Brühe mit den gewünschten Stämmen von Listerien, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
  2. Bereiten Sie anhand des Protokolls in Abschnitt 4 PBS-resuspendierte Kulturen der Stämme vor, die für die Invasion bewertet werden sollen. Anmerkung: Infektiöser Titer kann an dieser Stelle bewertet werden, indem Verdünnungen jeder Probe auf feste Medien plattiert und Kolonien nach der nächtlichen Inkubation aufgezählt werden.
  3. Mindestens 20 ul der PBS-Bakterienlösung in einzelne Brunnen der 24-Well-Platte eintragen. Beachten Sie, dass für jede Sorte mindestens drei einzelne Bohrungen benötigt werden, um Ergebnisse in Dreifacharbeit zu erhalten, so dass bis zu 8 Stämme im Tandem bewertet werden können.
  4. Nach dem Beladen der Brunnen mit Bakterien, sanft die Platte zu fördern homogene Ausbreitung jeder Probe innerhalb des Brunnens, und legen Sie die 24-Well-Platte wieder in den Inkubator für 45 min Inkubation bei 37 °C und 95% Luftfeuchtigkeit, mit 5%CO2.
  5. Bereiten Sie während dieser Inkubation ein Aliquot von DMEM – Ab (Abschnitt 2) vor, indem Sie einfach 25 ml DMEM –Ab entfernen und in ein 50 ml Falkenrohr (oder gleichwertig) legen.
  6. Dem 25 ml DMEM-Ab aliquot zu einer Konzentration von 15 ug/ml (7,5 ul einer 50 mg/ml Stofflösung) Gentamicin hinzufügen. Legen Sie die DMEM -Ab +Gent-Lösung für die Dauer der 45 min Inkubation in ein 37 °C-Wasserbad.
  7. Aliquot 25 ml PBS in ein 50 ml Falkenrohr und während der 45 min Inkubation in das 37 °C-Wasserbad geben.
  8. Nachdem die 45 min Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die 24-Well-Platte und legen Sie sie in die Haube. Entfernen Sie die Medien, die Bakterien aus jedem Brunnen enthalten, indem Sie Vakuum-Aspiration, GlasPipettenspitzen zwischen verschiedenen Stämmen wechseln.
  9. Fügen Sie ca. 1 ml PBS in jeden Brunnen, um lose-anhaftende Bakterien von der Oberfläche der Zellen zu waschen, dann entfernen Sie die PBS mit Vakuum-Aspiration.
  10. Nach vollständiger Entfernung von PBS 1 ml DMEM –Ab +Gent zu jedem Brunnen hinzufügen. Das Gentamicin wird nur die Bakterien abtöten, die außerhalb der Zellen bleiben, so dass diejenigen, die intrazellulär sind, lebensfähig bleiben.
  11. Legen Sie die 24-Well-Platte wieder in den Inkubator und lassen Sie sie für eine weitere Stunde inkubieren.
  12. Während der stundenlangen Inkubation 14 ml Polypropylen-Röhrchen vorbereiten, indem Sie 1 ml steriles ddH20 zu jeder Tube hinzufügen. Für jeden Deckelschlupf wird ein Rohr benötigt, also bereiten Sie für eine 24-Well-Platte insgesamt 24 Rohre vor.
  13. Nach der stundenlangen Inkubation die 24-Well-Platte aus dem Inkubator entfernen und in die Haube legen, zusammen mit den in Schritt 5.12 vorbereiteten Rohren.
  14. Mit steriler Pinzette jeden Deckelaus dem jeweiligen Brunnen entfernen und sofort in ein einzelnes Rohr legen. Achten Sie darauf, die Pinzette in Ethanol zu tauchen und sie zwischen jedem Deckelzuschlag zu brennen, um eine Kontamination zu verhindern.
  15. Nachdem alle Abdeckungen entfernt und in einzelne Rohre gelegt wurden, entsorgen Sie die 24-Well-Platte.
  16. Kehren Sie für 5-10 Sek. auf die Bank und wirbeln Sie jedes Rohr.
  17. Entfernen Sie einen Teil aus jedem Rohr und legen Sie jede Probe in einen einzelnen Brunnen einer 96-Well-Platte, dann verdünnen Sie jede Probe seriell mit 1:10 Verdünnungen bis zu einer Verdünnung von 1:1.000.
  18. Mit vorgewärmten und trockenen LB-Platten, Spot-Platte jeder der Verdünnungsserie auf die Agarplatten. Eine Mehrkanalpipetten können verwendet werden, um 5-10 l Flecken aus der Verdünnungsserie jeder Probe zu verplatten.
  19. Entfernen Sie außerdem 20 l Proben von jedem unverdünnten Brunnen und erkennen Sie diese Menge direkt auf LB-Agar auf einer separaten Platte aus der Verdünnungsserie. (Dieses größere Volumen kann verwendet werden, um schlecht invasive Stämme aufzuzählen).
  20. Nachdem alle Proben punktiert sind, entsorgen Sie die 14 ml Tuben mit den Decklippen. Die 96-Well-Platte parafilmen und bei Bedarf bei -80 °C in eine Gefrierbox legen.
  21. Lassen Sie die Flecken vollständig trocknen. Dieser Prozess wird stark beschleunigt, indem die Platten in die Haube platziert und die Deckel entfernt werden.
  22. Nachdem die Flecken getrocknet sind, legen Sie die Teller über Nacht in einen 37 °C-Inkubator.
  23. Zählen Sie am nächsten Morgen die Anzahl der Kolonien an jedem Punkt der Verdünnungsreihe, für die Koloniezahlen leicht beurteilt werden können (zwischen etwa 5 und 50 Kolonien) (Abbildung 1), und verwenden Sie die Reihe, um die Anzahl der Bakterien pro Abdeckzettel für jeden bewerteten Stamm zu berechnen.

6. Vorbereitung von Stämmen von L. monocytogenes für Mausinfektionen

  1. In der Nacht vor der Infektion, verwenden Sie eine sterilisierte Schleife, um einzelne Kolonien der gewünschten Stämme zu entfernen und ungeimpfen sie jeweils in einzelne 14 ml-Röhrchen mit 2 ml BHI-Brühe.
  2. Die geimpften Rohre in einen 37 °C-Inkubator auf45° kippen und über Nacht statisch (ohne Schütteln) inkubieren.
  3. Am nächsten Morgen, entfernen Sie die Kulturröhre aus dem Inkubator und Wirbel kurz, um eine gleichmäßige Suspension der Bakterien zu gewährleisten.
  4. Messen Sie die optische Dichte der Kultur mit einem Spektralphotometer bei 600 nm Wellenlänge. Achten Sie darauf, das Spektralphotometer mit steriler BHI-Brühe zu nulln, bevor Sie die optische Dichte lesen. (Bei L. monocytogenessteht die optische Dichte in direktem Zusammenhang mit der Konzentration von Bakterien pro ml, so dass eine Dichte von 1.000 = 1,0 x 109 KBE pro ml)
  5. Berechnen Sie die Menge an Kultur, die benötigt wird, um jedes Tier zu infizieren. Injektionen enthalten in der Regel 200 l PBS mit 10.000 KBE eines einzelnen Stammes, was einer gewünschten Konzentration von 5,00 x 104 KBE/ml entspricht.
  6. Entfernen Sie eine 5 l Aliquot jeder endgültigen Verdünnung und verteilen Sie sie direkt auf LB-Agar.  Über Nacht bei 37 °C inkubieren, um die für die Impfung verwendete Konzentration zu bestätigen.
  7. Injizieren Sie jede KBE-Suspension innerhalb von 1 Stunde nach Verdünnung (siehe unten).

7. Impfung von L. monocytogenes in Mäuse über Schwanzveneninjektion und Beurteilung der bakteriellen Belastung in der Leber, Milz und Herz

Hinweis: Alle Tierarbeiten werden gemäß den CDC-Richtlinien für Biosicherheit Level 2 durchgeführt.  Mäuse werden in der Regel eine Woche im Voraus bestellt und zusammen mit 5 Tieren pro Käfig eingesperrt. Mäuse dürfen sich vier Tage vor der Injektion an die neue Laborumgebung akklimatisieren. Diese Experimente verwendeten 6-8 Wochen alte weibliche Swiss-Webster-Mäuse, die 5 in einem Käfig in einer Barriereumgebung untergebracht waren und eine nicht-eingeschränkte Ernährung fütterten.

  1. Bereiten Sie einen Käfig von Mäusen zu einer Zeit, indem Sie den Deckel und Lebensmittel / Wasserbehälter zu entfernen, und legen Sie den Käfig unter einer Wärmelampe für fünf Minuten. Dieser Prozess ermöglicht es, dass die Schwanzvenen sich ausdimieren, was die Durchführung von Injektionen erleichtert.
  2. Entfernen Sie ein Tier und legen Sie es in ein Geschirr (oder Einnerrohr mit abgeschnittenem Ende), um das Tier während der Injektion zurückzuhalten.
  3. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit einem Alkoholpad und lassen Sie den Alkohol verdampfen. Dies reinigt nicht nur die Stelle, sondern auch die Schwanzvene weiter.
  4. Mit einer 1 ml Spritze, die mit einer 27,5-Spur-Nadel ausgestattet ist, injizieren Sie die Maus vorsichtig mit 200 l der gewünschten Kultur in die Schwanzvene.
  5. Verwenden Sie eine Gaze, um alle Blutungen zu stoppen, die als Folge der Injektion auftreten können, und legen Sie das Tier in einen frischen Käfig.
  6. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Tiere und Stämme. Achten Sie darauf, jeden Käfig der Tiere mit der Belastung zu kennzeichnen, die sie erhalten haben.
  7. Überprüfen Sie die Tiere täglich, entfernen und opfern Sie alle Tiere, die krank zu sein scheinen.  Wenn keine Tiere Krankheitserscheinungen aufweisen, lassen Sie die Infektionen 72 Stunden dauern, bevor Sie alle Tiere opfern.
  8. Um zu opfern, verwenden Sie CO 2-Anästhesie aus einer abgefüllten Quelle, bis alle Atemgase gestoppt haben, dann verwenden Sie Zervix-Dislokation, um sicherzustellen, dass das Tier tot ist.
  9. Nach dem Opfer, bewegen Sie die Tiere auf eine Gewebekultur Haube für die Zerlegung.
  10. Mit einem Sezierblock jedes Bein des Tieres mit großen Nadeln anheften und das Tier mit 70% Ethanol besprühen, bis es gesättigt ist.
  11. Schneiden Sie die Haut des Bauches und Thorax zurück mit einem Y-förmigen Schnitt, der von der vaginalen Öffnung bis zum xiphoiden Prozess erstreckt, und dann bis zur Axilla jedes Arms fortschreiten.
  12. Ziehen Sie die Haut zurück und entfernen Sie die Nadeln von jedem Bein, um die Sezierstelle offen zu halten.
  13. Schneiden Sie sanft durch das Peritoneum, die Entlarvung des Darms, Magen, Leber, und Milz.
  14. Durch erstes Schneiden der Lebervene und koronalen Band an der Oberseite der Leber, beginnen, die Leber zu entfernen. Weitere Bänder, die entfernt werden müssen, befinden sich unter der Leber und verbinden sie mit dem ersten Abschnitt des Dünndarms sowie mit der Muskulatur des Rückens.
  15. Die Leber in 5 ml steriles ddH20 in ein 50 ml Falkenrohr geben.
  16. Als nächstes entfernen Sie die Milz, indem Sie sie isolieren und die Gefäße und Bänder sanft abschneiden. Die Milz wird leichter entfernt als die Leber. Die Milz in ein separates Falkenrohr geben, das 5 ml steriles ddH20 enthält.
  17. Suchen Sie die Membran und schneiden Sie sanft entlang des Brustkorbs, um den Thorax zu visualisieren. Schneiden Sie durch den xiphoiden Prozess und Brustbein auf das Niveau des Halses, um den Thorax zu öffnen, das Herz und die Lunge freisetzen.
  18. Mit Zangen, greifen Sie das Herz sanft an seiner Spitze, und heben Sie es so, dass die Aorta und Lungengefäße in Spannung sind. Schneiden Sie diese Gefäße, um das Herz zu befreien.
  19. Das Herz in ein 50 ml Falkenrohr mit 5 ml sterilem ddH20 geben.
  20. Entsorgen Sie den Mauskadaver, und wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Tier, indem Sie saubere Falcon-Tuben verwenden, die 5 ml sterile ddH20 für jedes entfernte Organ enthalten.
  21. Nachdem alle Organe entfernt wurden, reinigen Sie den Arbeitsplatz und kehren Sie auf die Bank zurück.
  22. Bereiten Sie einen Satz von 5 Röhren für die Reinigung und Sterilisation des Homogenisators für jeden Satz von Organen von fünf Mäusen(d.h. ein 5-Rohr-Set für 5 Lebern, 5 Tuben für 5 Milz und 5 Tuben für 5 Herzen) vor. Vier der Tuben sollten mit 30 ml sterilddH20 gefüllt werden, und eine sollte mit 30 ml 90% EtOH gefüllt werden.
  23. Mit einem TissueMaster (oder einem gleichwertigen Homogenisator) tauchen Sie den Homogenisator (während des Laufens) wie folgt in die in Schritt 7.21 vorbereiteten Rohre, um die Sonde zu reinigen:
  24. Rohr 1 (ddH2O)
    5 Sek. in Tube 2 (ddH2O)
    5 Sek. in Tube 3 (EtOH)
    5 Sek. in Tube 4 (ddH2O)
    5 Sek. in Tube 5 (ddH2O)
  25. Homogenisieren Sie eine Leber mit dem Homogenisator für mindestens 2 min, oder bis keine sichtbaren Teile des Organs übrig bleiben. Verwenden Sie eine Pinzette, um große Trümmer teile teile weisen.
  26. Wiederholen Sie den in Schritt 7.22 beschriebenen Reinigungsvorgang
  27. Wiederholen Sie den Homogenisierungsprozess für die anderen Lebern, stellen Sie sicher, dass die Sonde zwischen jeder Leber mit dem in Schritt 7.22 beschriebenen Verfahren zu waschen.
  28. Nachdem alle Lebern vollständig homogenisiert sind, entsorgen Sie die Waschschläuche (1-5) für die Leber.
  29. Wiederholen Sie den Homogenisierungs-/Reinigungsprozess sowohl für die Milz als auch für die Herzen, und stellen Sie sicher, dass Sie für jede Reihe von Organen einen neuen Satz von Waschrohren verwenden. Wenn die Waschrohre zu irgendeinem Zeitpunkt trüb werden, entsorgen Sie sie und ersetzen Sie sie durch neue Rohre, um die Serie zu beenden.
  30. Nachdem alle Organe homogenisiert sind, einen letzten Reinigungszyklus auf dem Homogenisator machen und gut für die Lagerung trocknen.
  31. Legen Sie ca. 200 l jedes Organs in einen individuellen Brunnen einer 96-Well-Platte.
  32. Führen Sie serielle Verdünnungen an den Organproben durch Verdünnung von 1:10 in einer Reihe bis zu einer Verdünnung von 1:10.000 (Leber und Milz) oder bis zu einer Verdünnung von 1:1.000 (Herz) durch.
  33. Spotplatte der Verdünnungsserie auf vorgewärmten LB-Agar. Entfernen Sie auch 20 ul von jedem unverdünnten Organ und Platte auf separate LB AgarPlatten, um die KBE aus schlecht kolonisierten Organen aufzuzählen.
  34. Entsorgen Sie die Falkenrohre, die die homogenisierten Organe enthalten, und wickeln Sie die 96-Well-Platten, die die Verdünnungsserie enthalten, mit Parafilm und legen Sie sie in eine Gefrierbox bei -80 °C.
  35. Lassen Sie die Flecken trocknen. Dieser Prozess wird beschleunigt, indem die Platten in die Haube platziert und die Deckel entfernt werden.
  36. Nachdem die Flecken getrocknet sind, legen Sie die Teller über Nacht in einen 37 °C-Inkubator.
  37. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien an jedem Ort am nächsten Morgen und verwenden Sie die Verdünnungsreihe, um die Gesamtzahl der Bakterien pro Organ zu berechnen.

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Representative Results

Ausgewählte Isolate von L. monocytogenes zeigen eine verbesserte Invasion von Herzzellen in der Zellkultur und in Mausmodellen der Infektion. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel dafür, wie bakterielle Kolonien nach der Fleckbeschichtung von Suspensionen auf Agarmedien auftreten können. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung von KBE innerhalb einer Probe, ohne eine große Anzahl von Agar-Medienplatten zu verwenden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für einen gewebekulturbasierten Assay, der die Fähigkeit des Stammes 10403S vergleicht, in Herzzellen einzudringen, mit der des Stammes 07PF0776. Mehr als doppelt so viele 07PF0776 bakterielle KBE kann aus infizierten H9c2-Herzzellen nach Derichticin-Behandlung im Vergleich zu Zellen mit 10403S infiziert zurückgewonnen werden. Unterschiede von 2 bis 4-fach werden routinemäßig für kardiotrope Stämme mit diesem Assay beobachtet. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für die Wiederherstellung von Bakterien aus der Leber, Milz, und Herzen von infizierten Mäusen an 3 Tagen nach der Infektion. Die Infektion von Mäusen mit dem kardiotropen Stamm 07PF0776 oder Stamm 10403S führt zu einer vergleichbaren Anzahl von Bakterien, die aus der Leber und Milz infizierter Mäuse gewonnen werden, jedoch sind Mäuse, die mit 07PF0776 infiziert sind, eher nachweisbare Anzahl von Bakterien aus dem Herzen zu erzielen und größere bakterielle Belastungen in diesem Organ aufweisen.

Figure 1
Abbildung 1: Beispiel für die Spot-Beschichtungstechnik zur Bestimmung bakterieller KBE. H9c2-Zellen, die auf Glasabdeckungen angebaut und mit L. monocytogenes infiziert wurden, wurden lysiert und Suspensionen wurden mit 1:10 Verdünnungen bis zu einer Verdünnung von 1:1.000 (linkes Panel) seriell verdünnt. Eine Mehrkanalpipette wurde verwendet, um 10 ul von jedem Brunnen direkt auf eine LB-Agarplatte zu leiten, und die Platte wurde über Nacht bei 37 °C (rechte Platte) inkubiert. Die Anzahl der Bakterien pro Deckslip wird durch Zählen der bakteriellen KBE im Zusammenhang mit der entsprechenden Verdünnung bewertet.

Figure 2
Abbildung 2: L. monocytogenes Stamm 07PF0776 zeigt verbesserte Invasion von Herzzellen in der Gewebekultur. Invasions-Assays wurden in H9c2-Zellen mit einem MOI = 100 durchgeführt. Grafik zeigt die durchschnittliche Anzahl der intrazellulären bakteriellen KBE erholt +/- SE aus Zellen mit 10403S (schwarz) im Vergleich zu den kardiotropen 07PF0776 Stamm (blau) infiziert. ** gibt eine Signifikanz von p <0.01 an.

Figure 3
Abbildung 3: L. monocytogenes Stamm 07PF0776 zeigt verbesserte Invasion des Herzens in Maus-Infektionsmodelle. Die Tiere wurden mit 10.000 KBE über die Schwanzvene geimpft. Infektionen wurden für 72 Stunden fortschreiten gelassen, an dem Punkt, an dem die Tiere geopfert wurden und die Lebern, Milz, und Herzen gesammelt und verarbeitet wurden, um bakterielle KBE pro Organ zu bestimmen. Feste Kreise stellen die KBE dar, die von einzelnen Mäusen erhalten wurde, wobei der Durchschnittswert für alle Tiere innerhalb einer Gruppe durch eine Linie +/- SE angegeben wird. Die Prozentwerte geben die Anzahl der Tiere an, die nachweisbare bakterielle KBE im Herzen enthalten. * gibt eine Signifikanz von p <0.05 an.

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Discussion

L. monocytogenes ist ein weit verbreiteter und gut charakterisierter menschlicher Erreger, der in der Lage ist, eine Reihe verschiedener Krankheitserscheinungen zu verursachen15. Das Bakterium wurde zuvor für seine Fähigkeit beschrieben, über Barrieren, wie die Blut-Hirn-Barriere und Plazenta-fetale Barrieren zu translozieren, um das zentrale Nervensystem zu erreichen und zu besiedeln bzw. Fötus zu entwickeln. Die In-vivo-Fähigkeit des Organismus, diese Gewebe zu besiedeln, wird oft durch eine In-vitro-Fähigkeit ergänzt, in die repräsentativen Zellen in die Kultur einzudringen, aus der die betroffenen Organe besteht. Zum Beispiel wurde die Invasion von Epithelzellen im Aderhautplexus mit der Fähigkeit des Organismus in Verbindung gebracht, das ZNS16zu kolonisieren; und villous trophoblast Explants wurden verwendet, um die mütterlich-fetale Barriere17darzustellen. In diesem Protokoll wurden Methoden beschrieben, die nützlich sind, um die bakterielle Invasion von Herzzellen in der Kultur sowie für den Vergleich der bakteriellen Besiedlung des Herzens für einzelne Isolate relativ zur Besiedlung von Leber und Milz zu bewerten.

Dieses Protokoll enthält eine Reihe von kritischen Schritten, aber zu den kritischsten gehören diejenigen, die die Verwendung der richtigen bakteriellen KBE für entweder die Infektion von Gewebekulturzellen auf Decklippen oder die Infektion von Tieren. Wenn die bakterielle KBE-Zahl zwischen verschiedenen Brunnen und Tieren nicht korrekt kontrolliert wird, können keine direkten Vergleiche zwischen Proben angestellt werden. Es ist wichtig, die Verdünnungsreihen, die zur Erzeugung der Inocula verwendet werden, durch direkte Beschichtung der Endverdünnungen auf Medienplatten zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die bakterielle KBE-Zahl genau geschätzt wurde.

Die in diesen Assays verwendeten H9c2-Zellen stammen aus der unteren Hälfte eines 13-tägigen embryonalen Rattenherzs, das hauptsächlich ventrikuläres Gewebe18enthielt. Die Zellen vermehren sich als mononukleierte Myoblasten und nach Erreichen der Durchblutung in Gewebekulturkolben oder Geschirr beginnen, multinukleierte röhrenförmige Strukturen zu bilden. Die Zellen haben eine Erzeugungszeit von ca. 30 hr18. Serumhunger von H9c2-Zellen wurde mit der Differenzierung der Zellen in Skelettmuskelzellen in Verbindung gebracht, während die Behandlung der Myoblasten mit 10 nM All-Trans-Retinsäure mit myoblastischer Differenzierung in Herzmyozyten14assoziiert wurde. Dieses Protokoll konzentrierte sich auf L. monocytogenes Myoblast Zellinvasion, aber die H9c2-Zelllinie ist eine vielseitige Zelllinie, die verwendet werden könnte, um die Auswirkungen der kontrollierten Zelldifferenzierung auf die bakterielle Invasion zu untersuchen.

Der L. monocytogenes Stamm 07PF0776 wurde ursprünglich von einem HIV-infizierten Patienten isoliert, der aufgrund einer invasiven L. monocytogenes-Infektion des Herzens8einen nicht resusitierbaren asystolischen Arrest hatte. Die anschließende Analyse dieses Stammes in Mausinfektionsmodellen zeigte, dass er eine verbesserte Fähigkeit hatte, auf Herzgewebe zu zielen und einzudringen. Eine begrenzte Analyse weiterer zufälliger Isolate von L. monocytogenes legt nahe, dass Subpopulationen von bakteriellen Isolaten in der Lage sind, die Herzen von Mäusen zu infizieren, wenn keine vorherigen Schäden an Herzgewebe oder Herzklappen vorliegen8. Interessanterweise wurden zwei der am besten charakterisierten L. monocytogenes Stämme, 10403S und EGD, als schlechte Kolonisatoren von Herzzellen und Gewebe gefunden. Die Genomsequenzierung des 07PF0776-Isolats ergab weder das Vorhandensein neuer Pathogenitätsinseln noch beweise einzigartige Gencluster19; dies deutet darauf hin, dass 07PF0776 Herzzellen für die Invasion durch Modifikation seines bestehenden Arsenals von Virulenz-Genprodukten ins Visier nimmt. Vorläufige histochemische Analysen zeigen, dass 07PF0776 Abszesse in infizierten Mausherzen bildet, die dem Abszess ähneln, der beim ursprünglichen infizierten menschlichen Patienten beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt). Ob andere kardiotrope L. monocytogenes Isolate eine ähnliche Herzabszessbildung induzieren, bleibt abzuwarten.

Die hier vorgestellten Assays können leicht modifiziert werden, um die Untersuchung verschiedener Aspekte der Infektion zu erleichtern. Einzelne Abdeckungen können entweder für die Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie fixiert und gebeizt werden, die Inkubationszeiten der Gewebekultur können für die Messung und den Vergleich von Bakterien-intrazellulären Wachstumsraten erhöht werden, Gewebe und Organe können paraffin eingebettet und für eine mikroskopische Untersuchung verarbeitet werden, um die Abszessbildung und die bakterielle Verteilung auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Bei der Bewertung der bakteriellen Invasion von Gewebekulturzellen oder der Besiedlung von Wirtsgeweben gibt es Einschränkungen in Bezug auf die minimale Menge an Bakterien, die jeder Assay erkennen kann. In-vitro-Invasions-Assays haben eine untere Nachweisgrenze von ca. 300 KBE pro Deckslip. Die Anpassung des Wasservolumens, das zum Wirbeln der Abdeckungen verwendet wird, kann den Nachweis einer geringen Anzahl von Bakterien verbessern, wobei sich die Zelllysevolumina von bis zu 500 l als nützlich erweisen, um schlecht invasive Stämme zu erkennen. Coverlips können kurz in steriles Wasser getaucht werden, um überschüssiges Gentamicin vor der Lyse von Wirtszellen in kleineren Mengen zu entfernen. Volumenstufen bis zu 5 ml oder mehr können verwendet werden, um hochinvasive Stämme richtig aufzuzählen. Bei den Tieren können Organhomogenate in Volumen von 5 ml oder 10 ml ddH20 erzeugt werden, wobei geringere Volumina nützlich sind, um niedrigere Bakterienkonzentrationen zu erkennen, und höhere Volumina, um stark besiedelte Organe besser aufzuzählen. Der minimale Erfassungsbereich für infizierte Organe beträgt ca. 100 KBE. Wenn Organe konsequent auf hohem Niveau kolonisiert werden, sollten Sie ein größeres Volumen wasser (10 ml) verwenden und mehr Verdünnungen innerhalb der 96-Well-Platte durchführen.

Die beschriebenen Methoden können auf Organe und Gewebe außerhalb des Herzens angewendet werden. Invasion Assays und Maus-Infektionen wie diese wurden verwendet, um die Besiedlung in einer Vielzahl von Standorten zu bewerten, einschließlich der Plazenta, Gehirn, Gallenblase, Leber, und Darm. Änderungen der oben beschriebenen Protokolle können auch vorgenommen werden, um hyperinvasive und/oder hypervirulente Stämme aufzunehmen, und die Substitution von Herzzellen durch andere Zelltypen kann durchgeführt werden, um Invasions-Phänotypen an Stellen außerhalb des Herz-Kreislauf-Systems zu bewerten. Da verschiedene Zelltypen die Anfälligkeit für die Invasion von L. monocytogenes verändert haben, können Anpassungsparameter wie MOI und Inkubationszeiten erforderlich sein, um daten von den Assays genau wiederherzustellen.

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Disclosures

Die Autoren berichten von keinen konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des öffentlichen Gesundheitsdienstes AI41816 und AI099339 (N.E.F.) sowie durch F31AI094886-01 (P.D.M.) von NIAID unterstützt. Die Inhalte liegen allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht unbedingt die offizielle Meinung der Finanzierungsquellen dar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco BHI Broth Base 237200 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2 kg of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12 mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14 ml Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75 cm2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

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References

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Tags

Infektion Ausgabe 99 Bakterielle Pathogenese intrazellulärer Erreger Gewebetropismus bakterielle Invasion Herzinfektion Listeriose
Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit <em>Listeria monocytogenes</em>
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McMullen, P. D., Freitag, N. E.… More

McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

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