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Immunology and Infection

Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52497
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

Summary

La listeria monocytogenes causa infezioni fetali nelle donne in gravidanza e meningite nelle popolazioni sensibili. Le sottopopolazioni di batteri possono colonizzare il tessuto cardiaco, causando miocardite in pazienti e animali da laboratorio. Qui presentiamo un protocollo che descrive come valutare l'invasione delle cellule cardiache di L. monocytogenes in vitro e la colonizzazione cardiaca negli animali infetti.

Abstract

Listeria monocytogenes è un agente patogeno intracellulare facultativo Gram-positivo in grado di causare gravi infezioni invasive in pazienti immunocompro compromessi, anziani e donne in gravidanza. Le manifestazioni più comuni di listeriosi negli esseri umani includono meningite, encefalite e aborto fetale. Una sequela significativa ma molto meno documentata dell'infezione invasiva di L. monocytogenes coinvolge il cuore. Il tasso di mortalità per malattia cardiaca può essere fino al 35% nonostante il trattamento, tuttavia si sa molto poco per quanto riguarda la colonizzazione L. monocytogenes del tessuto cardiaco e le sue patologie risultanti. Inoltre, è recentemente diventato evidente che le sottopopolazioni di L. monocytogenes hanno una maggiore capacità di invadere e crescere all'interno del tessuto cardiaco. Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il cardiotropismo degli isolati L. monocytogenes. Sono presentati metodi per l'infezione dei mioblasti cardiaci del ratto H9c2 nella coltura tissutale e per la determinazione della colonizzazione batterica dei cuori dei topi infetti. Questi metodi sono utili non solo per identificare i ceppi con il potenziale di colonizzare il tessuto cardiaco negli animali infetti, ma possono anche facilitare l'identificazione di prodotti genetici batterici che servono a migliorare l'invasione delle cellule cardiache e / o guidare cambiamenti nella patologia cardiaca. Questi metodi prevedono anche il confronto diretto del cardiotropismo tra più ceppi di L. monocytogenes.

Introduction

La Listeria monocytogenes è un agente patogeno intracellulare gram-positivo in grado di causare gravi malattie nelle popolazioni sensibili, tra cui anziani, donne incinte, persone con HIV / AIDS e persone che ricevono la chemioterapia1. L'infezione in queste popolazioni è spesso il risultato dell'ingestione di prodotti alimentari contaminati e la maggior parte delle infezioni sono associate a focolai di origine alimentare su largascala 2,3. Nell'uomo e in altri mammiferi, L. monocytogenes è in grado di trasporre attraverso il confine epiteliale dell'intestino tenue, per poi essere trasportato al fegato4,5. I modelli animali suggeriscono che i batteri ingeriti si replicano all'interno dei villi intestinali e transitano al fegato attraverso la vena portale o si diffondono attraverso i linfonodi mesenterici nel flusso sanguigno, portando alla diffusione ematogena al fegato e alla milza6,7. Nel fegato e nella milza, il batterio è in grado di mediare l'assorbimento sia nei fagociti professionisti che nelle cellule parenchimali residenti e stabilisce rapidamente infezioni all'interno di questi organi. Con l'aumentare della carica batterica, numerosi batteri vengono dispersi nel sangue, dove sono in grado di colonizzare ulteriormente i tessuti sensibili tra cui il sistema nervoso centrale e la placenta (dove presente). La colonizzazione di questi siti preclude le manifestazioni più comuni di listeriosi negli esseri umani, tra cui meningite, encefalite e aborto fetale2.

Alcune sottopopolazioni di L. monocitogene hanno recentemente dimostrato di avere una maggiore capacità di invadere e replicare all'interno del tessuto cardiaco8. Le manifestazioni di coinvolgimento cardiaco sono varie e vanno dall'endocardite e pericardite, alla miocardite fulminante completa di anomalie di conduzione9-13. Il numero complessivo di casi cardiaci L. monocytogenes all'anno è basso, ma può essere sottovalutato in quanto questo aspetto dell'infezione non è generalmente ben riconosciuto. La colonizzazione del cuore da parte di agenti patogeni richiede spesso predisposizioni ospiti come danni valvulari preesiste o valvole cardiache artificiali. Esistono, tuttavia, isolati di L. monocytogenes che sono stati identificati che si notano per la loro capacità di colonizzare il cuore degli animali infetti in assenza di danni cardiaci e/o anomalie8.

Nel presente documento sono descritti metodi in vitro e in vivo per valutare la colonizzazione batterica del tessuto cardiaco all'interno di animali infetti utilizzando test di invasione nella coltura tissutale e infezioni animali vive. Questi metodi si sono dimostrati utili non solo per identificare ceppi con il potenziale di colonizzare il tessuto cardiaco negli animali infetti, ma dovrebbero anche essere utili per l'identificazione di prodotti genetici batterici che servono a migliorare l'invasione delle cellule cardiache e / o provocare cambiamenti nella patologia cardiaca. Questi metodi facilitano il confronto del cardiotropismo tra più ceppi. Per i metodi qui descritti, L. monocytogenes 10403S è usato come rappresentante ben studiato di un ceppo non cardiotropico e l'isolato clinico 07PF0776 è usato come esempio rappresentativo di un ceppo cardiotropico. Questi due ceppi sono stati scelti per fornire un confronto per l'invasione batterica di cellule cardiache in vitro e la colonizzazione dei cuori dei topi infetti in vivo. L'isolato 07PF0776 è un isolato clinico recuperato da un ascesso interventricolare che ha causato un'aritmia fatale in un paziente HIV+8. L. gli isolati monocitogeni possono variare nel loro potenziale di virulenza e, data la propensione della Listeria a infettare le persone con immunosoppressione e le donne incinte, le persone all'interno di queste popolazioni dovrebbero prestare attenzione nel valutare diversi isolati clinici.

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Protocol

1. Condizioni di conservazione e coltura per i ceppi di L. monocitogeni

  1. Preparare i supporti solidi autoclavando l'agar per infusione cervello-cuore (BHI) e versando il supporto fuso nelle piastre di Petri. Lasciare asciugare le piastre durante la notte a temperatura ambiente, quindi pernottare di nuovo a 37 °C.
  2. Utilizzando un ciclo sterile, ottenere un piccolo campione di L. monocitogenes da scorte congelatori precedentemente realizzate (batteri sospesi al 20% di glicerolo in mezzi liquidi BHI, conservati a -80 °C) o da una piastra di agar contenente colonie precedentemente colpite per l'isolamento.
  3. Usando la tecnica aseptica, striare il campione per l'isolamento di una singola colonia. Assicurarsi di sterilizzare il ciclo tra striature trasversali per evitare un riporto in eccesso e garantire l'isolamento delle singole colonie del ceppo in fase di valutazione. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
  4. Utilizzando un anello sterile, rimuovere una colonia dell'isolato e inoculare 2 ml di brodo BHI (senza agar) in un tubo di polistirolo da 14 ml.
  5. Per saggi e infezioni, incubare la coltura del brodo in modo statico (senza tremare) durante la notte in un'incubatrice a 37 °C. Per lo stoccaggio di isolati coltivati, incubare la coltura di brodo a 37 °C con scuotimento a 180-200 giri/min durante la notte. Le colture possono essere rifornite aggiungendo glicerolo a una concentrazione finale del 20% e immagazzinando tubi sigillati a -80 °C indefinitamente.

2. Condizioni di conservazione e ristrutturazione delle cellule simili a mioblasti cardiaci H9c2

  1. Acquistare o ottenere uno stock congelato di cellule H9c2, nonché il mezzo dell'aquila modificata (DMEM) di Dubelco contenente alto glucosio e piruvato, siero bovino fetale (FBS), L-glutammina (Glut) e una miscela Penicillina-Streptomicina-glutammina (PSG).  FBS, Glut e PSG devono essere stoccati a -20 °C, mentre DMEM può essere conservato a 4 °C. È utile aliquotare FBS in tubi conici da 50 ml prima del congelamento.
  2. In una cappa di flusso laminare, scongelare due aliquote di FBS. Aggiungere un'aliquota a una bottiglia da 500 ml di DMEM, facendo una miscela FBS/DMEM al 10%. A questo, aggiungere 6 ml di Glut e stoccare la soluzione risultante a 4 °C. Questa soluzione può essere etichettata come "DMEM senza antibiotici". (DMEM –Ab)
  3. Ad una seconda bottiglia da 500 ml di DMEM, aggiungere l'altra aliquota da 50 ml di FBS. A questa soluzione aggiungere 6 ml di PSG e magazzino a 4 °C. Questa soluzione può essere etichettata come "DMEM con antibiotici". (DMEM +Ab)
  4. Mentre si è nella cappa laminare, rimuovere 10 ml di DMEM +Ab e mettere in un pallone da coltura tissutale da 25 ml.
  5. Lasciando il pallone nella cappa laminare, rimuovere un'aliquota congelata di cellule H9c2 dallo stoccaggio in azoto liquido e posizionare rapidamente il tubo in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando la coltura non si è scongelata.
  6. Spruzzare il tubo con il 70% di etanolo per sanificare, quindi tornare al cofano. Lavorando rapidamente per ridurre al minimo il tempo cellulare in DMSO concentrato, aggiungere l'aliquota completa delle cellule ai 10 ml di DMEM +Ab.  Ciò diluisce il DMSO in modo sufficiente per la vitalità e l'aderenza delle cellule durante la notte.
  7. Posizionare il pallone in un incubatore di coltura tissutale a 37 °C, 5% C02e 95% di umidità durante la notte.
  8. La mattina seguente, controllare lo strato cellulare per garantire l'aderenza. Le cellule saranno probabilmente tra l'80 e il 100% confluenti entro questo periodo.
  9. Nel cappuccio di coltura tissutale, rimuovere il supporto contenuto all'interno del pallone usando il vuoto, lasciando solo le cellule all'interno del pallone.
  10. Aggiungere circa 2 ml dello 0,25% di tripsiderina-EDTA alle cellule e dondolare delicatamente per circa 3 secondi.
  11. Invertire il pallone in modo che la soluzione di tripina non sia più a contatto con il monostrato e rimuovere la tripina sottovuoto.
  12. Aggiungere una seconda aliquota di 2 ml di tripina alle cellule e spostare il pallone su un microscopio invertito. Osservare le cellule mentre si dondola delicatamente il pallone per assicurarsi che il monostrato si disperdi.
  13. Una volta disperso il monostrato, tornare immediatamente alla cappa di coltura tissutale e aggiungere 4 ml di DMEM +Ab alla sospensione cellulare.
  14. Rimuovere una porzione da 2 ml della sospensione cellulare e aggiungerla a un pallone da coltura tissutale da 50 ml contenente 23 ml di DMEM +Ab.
  15. Controllare le cellule ogni giorno fino a raggiungere circa l'80% di confluenza (circa 2,0-4,0 x 105 cellule per ml). È molto importante che le cellule non diventino troppo confluenti, in quanto possono differenziarsi in miotubi muscolari scheletrici quando muoiono di fame di FBS per periodi prolungatidi tempo 14 e questa differenziazione può alterare l'invasione batterica.  Monitorare attentamente le cellule e iniziare con un nuovo tubo di cellule se una coltura diventa confluente.
  16. Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, possono essere traleate in un altro pallone da 50 ml come appena descritto, o preparate per il test di invasione.

3. Preparazione di cellule H9c2 per il test di invasione

  1. Nella cappa di coltura tissutale, rimuovere il supporto da un pallone da 50 ml di cellule H9c2 che hanno raggiunto l'80% di confluenza utilizzando l'aspirazione sottovuoto.
  2. Aggiungere 4 ml di soluzione 0,25% trypsina-EDTA al monostrato e rimuovere immediatamente utilizzando l'aspirazione sottovuoto.
  3. Aggiungere un'altra porzione da 4 ml dello 0,25% di Tripside-EDTA al pallone e spostare il pallone su un microscopio invertito per osservare la dispersione del monostrato.
  4. Una volta che le cellule si sono disperse, tornare al cofano e aggiungere 4 ml di DMEM -Ab alle cellule. Pipeggiare la soluzione su e giù garantisce la completa rimozione delle cellule dal fondo del pallone.
  5. Dopo la sospensione del monostrato, rimuovere tutta la sospensione e posizionarla in un tubo conico da 50 ml.
  6. Rimuovere una porzione di 20 ul di questa sospensione e contare il numero di cellule per millilitro usando un emocitometro.
  7. Una volta determinata la concentrazione di cellule nella soluzione, regolare la concentrazione a 2,25 x 10 4 cellule/ml aggiungendo il volume appropriato disoluzione cellulare al DMEM -Ab fresco. Il volume totale della soluzione regolata deve essere di 25 ml.
  8. Mentre sei nel cappuccio, sterilizza le copertine di vetro immergerle in etanolo al 90% e passare brevemente ogni coverlip attraverso una fiamma. Aggiungere ogni coverlip a un singolo pozzo di una piastra trattata con coltura tissutale a 24 porsi direttamente dopo la sterilizzazione.
  9. Dopo che tutti i pozzi hanno un copripazzo individuale, utilizzare una pipetta da 25 ml per aggiungere 1 ml della soluzione cellulare diluita a ciascuno dei pozzali nella piastra e spingere ogni coverlip verso il basso con un ago sterile.
  10. Controllare ogni pozzo utilizzando un microscopio invertito per assicurarsi che quantità simili di cellule si trovano in ogni pozzo. Mettere la piastra del pozzo 24 nell'incubatrice di coltura tissutale durante la notte a 37 °C in 5% CO2 e 95% di umidità.
  11. La mattina seguente, guarda ogni bene per assicurarti che le copertine abbiano quantità comparabili di mioblasti aderenti e che i copriparsi non galleggiano nel pozzo.

4. Preparazione di ceppi di L. monocytogenes per i test di invasione

NOTA: Tutti i lavori di laboratorio vengono eseguiti in conformità con le linee guida CDC Biosafety Level 2.

  1. Dopo aver preparato la piastra da 24 potte per il dosaggio, utilizzare un anello sterilizzato per rimuovere singole colonie dei ceppi da esaminare per l'invasione batterica e inoculare ciascuno in singoli tubi da 14 ml contenenti 2 ml di brodo BHI.
  2. Posizionare i tubi inoculati in un incubatore a 37 °C inclinato a 45° e incubare staticamente (senza tremare) durante la notte.
  3. La mattina seguente, rimuovere brevemente il tubo di coltura dall'incubatore e dal vortice per garantire una sospensione uniforme dei batteri.
  4. Misurare la densità ottica della coltura usando uno spettrofotometro a lunghezza d'onda di 600 nm. Assicurarsi di azzerare lo spettrofotometro utilizzando brodo BHI sterile prima di leggere la densità ottica.
  5. Per L. monocytogenes, la densità ottica è direttamente correlata alla concentrazione di batteri per ml, in modo tale che una densità di 1.000 = 1,0 x 109 CFU per ml.
  6. Calcolare la quantità di coltura necessaria per infettare 2,25 x 104 celle con 2,25 x 106 (MOI = 100).
  7. Rimuovere la quantità di coltura necessaria e posizionarla in un tubo di centrifuga da 1,5 ml.
  8. Ruotare la coltura a 19.000 x g per 3 minuti, quindi scartare il supernatante. Toccare l'estremità aperta del tubo contro un tovagliolo di carta per rimuovere i mezzi in eccesso attaccati al labbro del tubo.
  9. Rimorsi i batteri in 1 ml di PBS sterile e vortice per garantire una miscelazione sufficiente. Questa miscela deve contenere circa 2,25 x 106 CFU per 20 ul (1,125 x 108 CFU/ml).

5. Eseguire il saggio di invasione

  1. Il giorno prima del saggio di invasione, preparare piastre a 24 pozza di cellule H9c2 come descritto nella sezione 3 e inoculare anche brodo BHI sterile con il ceppo o i ceppo desiderati di Listeria come descritto nella sezione 4.
  2. Utilizzando il protocollo della sezione 4, preparare colture risosopendate da PBS dei ceppi da valutare per l'invasione. Nota: Il titer infettivo può essere valutato a questo punto placcando le diluizioni di ogni campione su supporti solidi ed enumerando le colonie dopo l'incubazione notturna.
  3. Caricare almeno 20 ul della soluzione pbs-batterica in singoli pozzi della piastra da 24 pozzi. Si noti che sono necessari almeno tre pozzi individuali per ogni ceppo al fine di ottenere risultati in triplice copia, quindi è possibile valutare fino a 8 ceppi in tandem.
  4. Dopo aver caricato i pozzi con batteri, scuotere delicatamente la piastra per incoraggiare la diffusione omogenea di ogni campione all'interno del pozzo e riposizionare la piastra di 24 pozzi nell'incubatrice per 45 minuti di incubazione a 37 °C e 95% di umidità, con il 5% di CO2.
  5. Durante questa incubazione, preparare un'aliquota di DMEM – Ab (Sezione 2) semplicemente rimuovendo 25 ml di DMEM –Ab e posizionandolo in un tubo di falco da 50 ml (o equivalente).
  6. Aggiungere la gentamicina all'aliquota DMEM-Ab da 25 ml ad una concentrazione di 15 ug/ml (7,5 ul di una soluzione di 50 mg/ml). Posizionare la soluzione DMEM –Ab +Gent in un bagno d'acqua a 37 °C per tutta la durata dell'incubazione di 45 minuti.
  7. Aliquota 25 ml di PBS in un tubo di falco da 50 ml e mettere nel bagno d'acqua a 37 °C durante l'incubazione di 45 minuti.
  8. Al termine dell'incubazione di 45 minuti, rimuovere la piastra da 24 pozzi e posizionarla nel cappuccio. Rimuovere il supporto contenente batteri da ogni pozzo mediante aspirazione sottovuoto, cambiando le punte delle pipetta di vetro tra diversi ceppi.
  9. Aggiungere circa 1 ml di PBS ad ogni pozzo per lavare i batteri liberamente aderenti dalla superficie delle cellule, quindi rimuovere il PBS utilizzando l'aspirazione sottovuoto.
  10. Dopo la rimozione completa di PBS, aggiungere 1 ml di DMEM –Ab +Gent ad ogni pozzo. La gentamicina ucciderà solo quei batteri che rimangono al di fuori delle cellule, quindi quelli che sono intracellulari rimarranno vitali.
  11. Riposizionare la piastra di 24 pozzi nell'incubatrice e lasciare incubare per un'ora aggiuntiva.
  12. Durante l'incubazione di un'ora, preparare 14 ml di tubi in polipropilene aggiungendo 1 ml di ddHsterile 20 a ciascun tubo. Sarà necessario un tubo per ogni coverlip, quindi per una piastra da 24 pozzi, preparare 24 tubi in totale.
  13. Dopo l'incubazione di un'ora, rimuovere la piastra di 24 pozzi dall'incubatrice e posizionarla nella cappa, insieme ai tubi preparati nel passaggio 5.12.
  14. Utilizzando pinzette sterili, rimuovere ogni coverlip dal rispettivo pozzo e posizionarlo immediatamente in un singolo tubo. Assicurati di immergere le pinzette in etanolo e di fiammarle tra ogni coverlip per prevenire la contaminazione.
  15. Dopo che tutti i copripasta sono stati rimossi e collocati in singoli tubi, scartare la piastra da 24 pozzi.
  16. Tornare in panchina e vortice ogni tubo per 5-10 secondi.
  17. Rimuovere una porzione da ogni tubo e posizionare ogni campione in un singolo pozzo di una piastra da 96 potte, quindi diluire serialmente ogni campione utilizzando diluizioni 1:10 fino a una diluizione 1:1.000.
  18. Utilizzando piastre LB prebelliche e asciutte, piastrine a punti ciascuna della serie di diluizione sulle piastre di agar. Una pipetta multicanale può essere utilizzata per placcare punti da 5-10 μl dalla serie di diluizione di ciascun campione.
  19. Rimuovere anche campioni da 20 μl da ogni pozzo non diluito e individuare questa quantità direttamente sull'agar LB su una piastra separata dalla serie di diluizione. (Questo volume maggiore può essere utilizzato per enumerare ceppi scarsamente invasivi).
  20. Dopo che tutti i campioni sono stati placcati a punti, scartare i tubi da 14 ml contenenti le coverlips. Parafilmare la piastra da 96 poggia e posizionare in una scatola congelatore a -80 °C per la piastra, se necessario.
  21. Lasciare asciugare completamente le macchie. Questo processo si affretta notevolmente posizionando le piastre nel cofano e rimuovendo i coperchi.
  22. Dopo che le macchie si sono asciugate, posizionare i piatti in un'incubatrice a 37 °C durante la notte.
  23. La mattina seguente, contare il numero di colonie in ogni punto della serie di diluizione per le quali è possibile valutare facilmente i numeri delle colonie (tra circa 5 e 50 colonie) (Figura 1) e utilizzare la serie per calcolare il numero di batteri per coverslip per ogni ceppo valutato.

6. Preparazione di ceppi di L. monocitogeni per infezioni da topo

  1. La sera prima dell'infezione, utilizzare un anello sterilizzato per rimuovere singole colonie dei ceppi desiderati e inocularle in singoli tubi da 14 ml contenenti 2 ml di brodo BHI.
  2. Posizionare i tubi inoculati in un incubatore a 37 °C inclinato a 45° e incubare staticamente (senza tremare) durante la notte.
  3. La mattina seguente, rimuovere brevemente il tubo di coltura dall'incubatore e dal vortice per garantire una sospensione uniforme dei batteri.
  4. Misurare la densità ottica della coltura usando uno spettrofotometro a lunghezza d'onda di 600 nm. Assicurarsi di azzerare lo spettrofotometro utilizzando brodo BHI sterile prima di leggere la densità ottica. (Per L. monocytogenes, la densità ottica è direttamente correlata alla concentrazione di batteri per ml, in modo tale che una densità di 1.000 = 1,0 x 109 CFU per ml)
  5. Calcola la quantità di coltura necessaria per infettare ogni animale. Le iniezioni contengono tipicamente 200 μl di PBS con 10.000 CFU di un singolo ceppo, che si traduce in una concentrazione desiderata di 5,00 x 104 CFU/ml.
  6. Rimuovere un'aliquota di 5 μl di ogni diluizione finale e stenderla direttamente sull'agar LB.  Incubare durante la notte a 37 °C per confermare la concentrazione utilizzata per l'inoculazione.
  7. Iniettare ogni sospensione CFU entro 1 ora dalla diluizione (vedi sotto).

7. Inoculazione di L. monocitogeni nei topi tramite iniezione di vene della coda e valutazione del carico batterico all'interno del fegato, della milza e del cuore

Nota: Tutto il lavoro sugli animali viene eseguito in conformità con le linee guida CDC Biosafety Level 2.  I topi vengono in genere ordinati con una settimana di anticipo e in gabbia insieme a 5 animali per gabbia. I topi possono acclimatarsi al nuovo ambiente di laboratorio per quattro giorni prima dell'iniezione. Questi esperimenti hanno utilizzato topi swiss-webster di 6-8 settimane che sono stati ospitati 5 in una gabbia in un ambiente barriera e hanno alimentato una dieta non limitata.

  1. Preparare una gabbia di topi alla volta rimuovendo il coperchio e i bidoni cibo /acqua e posizionando la gabbia sotto una lampada termica per cinque minuti. Questo processo consente alle vene della coda di dilatarsi, rendendo le iniezioni più facili da eseguire.
  2. Rimuovere un animale e posizionare in un'imbracatura (o in un tubo di falco con l'estremità tagliata) per trattenere l'animale durante l'iniezione.
  3. Pulire il sito di iniezione utilizzando un tampone alcolico e lasciare evaporare l'alcol. Questo non solo pulisce il sito, ma dilata ulteriormente la vena della coda.
  4. Utilizzando una siringa da 1 ml dotata di un ago calibro 27,5, iniettare delicatamente il topo con 200 μl della coltura desiderata nella vena della coda.
  5. Utilizzare una garza per fermare qualsiasi sanguinamento che può verificarsi a seguito dell'iniezione e posizionare l'animale in una gabbia fresca.
  6. Ripeti questo processo per gli animali e i ceppi rimanenti. Assicurati di etichettare ogni gabbia di animali con il ceppo che hanno ricevuto.
  7. Controllare quotidianamente gli animali, rimuovendo e sacrificando tutti gli animali che sembrano essere malati.  Se nessun animale mostra segni di malattia, consentire alle infezioni di procedere per 72 ore prima di sacrificare tutti gli animali.
  8. Per sacrificare,utilizzare l'anestesia di CO 2 da una fonte in bottiglia fino a quando tutte le respirazioni non si sono fermate, quindi utilizzare la lussazione cervicale per garantire che l'animale sia morto.
  9. Dopo il sacrificio, spostare gli animali in una cappa di coltura tissutale per la dissezione.
  10. Usando un blocco di dissezione, pin ogni gamba dell'animale con aghi di grosso calibro e spruzzare l'animale con il 70% di etanolo fino a quando non è saturo.
  11. Tagliare la pelle dell'addome e del torace con un'incisione a forma di Y che si estende dall'apertura vaginale fino al processo xifoide, progredendo quindi fino all'ascella di ogni braccio.
  12. Tirare indietro la pelle e rimuovere gli aghi da ogni gamba per tenere aperta la dissezione.
  13. Tagliare delicatamente attraverso il peritoneo, esponendo l'intestino, lo stomaco, il fegato e la milza.
  14. Tagliando prima la vena epatica e il legamento coronale nella parte superiore del fegato, inizia a rimuovere il fegato. Ulteriori legamenti da rimuovere si trovano sotto il fegato, collegandolo alla prima sezione dell'intestino tenue, così come alla muscolatura della schiena.
  15. Mettere il fegato in 5 ml di ddHsterile 20 in un tubo di falco da 50 ml.
  16. Quindi, rimuovere la milza isolarla e tagliare delicatamente la vascuola e i legamenti. La milza verrà rimossa più facilmente del fegato. Mettere la milza in un tubo di falco separato contenente 5 ml di ddHsterile 20.
  17. Individuare il diaframma e tagliare delicatamente lungo la gabbia toracica per visualizzare il torace. Tagliare il processo xifoide e lo sterno al livello del collo per aprire il torace, esponendo il cuore e i polmoni.
  18. Usando le forcep, afferrare delicatamente il cuore per il suo apice e sollevarlo in modo tale che l'aorta e i vasi polmonari siano in tensione. Taglia questi vasi per liberare il cuore.
  19. Mettere il cuore in un tubo di falco da 50 ml contenente 5 ml di ddHsterile 20.
  20. Scartare la carcassa del topo e ripetere questo processo per ogni animale, utilizzando tubi di falco puliti contenenti 5 ml di ddHsterile 20 per ogni organo rimosso.
  21. Dopo che tutti gli organi sono stati rimossi, pulire il posto di lavoro e tornare in panchina.
  22. Preparare un set di 5 tubi da utilizzare per la pulizia e la sterilizzazione dell'omogeneizzatore per ogni set di organi di cinquetopi (cioè un set di 5 tubi per 5 fegati, 5 tubi per 5 milza e 5 tubi per 5 cuori). Quattro di ciascuno dei tubi devono essere riempiti con 30 ml di ddHsterile 20 e uno deve essere riempito con 30 ml 90% EtOH.
  23. Utilizzando un TissueMaster (o omogeneizzatore equivalente), immergere l'omogeneizzatore (durante la corsa) nei tubi preparati nel passaggio 7.21 come segue per pulire la sonda:
  24. Tubo 1 (ddH2O)
    5 sec nel tubo 2 (ddH2O)
    5 secondi nel tubo 3 (EtOH)
    5 sec nel tubo 4 (ddH2O)
    5 sec nel tubo 5 (ddH2O)
  25. Omogeneizzare un fegato usando l'omogeneizzatore per almeno 2 minuti o fino a quando non rimangono porzioni visibili di organo. Utilizzare una pinzetta per rimuovere eventuali detriti di grandi dimensioni dalla sonda.
  26. Ripetere il processo di pulizia descritto al passaggio 7.22
  27. Ripetere il processo di omogeneizzazione per gli altri fegati, assicurandosi di lavare la sonda tra ogni fegato utilizzando il processo descritto nella fase 7.22.
  28. Dopo che tutti i fegati sono completamente omogeneizzati, scartare i tubi di lavaggio (1-5) per il fegato.
  29. Ripetere il processo di omogeneizzazione/pulizia sia per la milza che per il cuore, assicurandosi di utilizzare un nuovo set di tubi di lavaggio per ogni serie di organi. Se in qualsiasi momento i tubi di lavaggio diventano torbidi, scartarli e sostituirli con nuovi tubi per completare la serie.
  30. Dopo che tutti gli organi sono stati omogeneizzati, fare un ultimo ciclo di pulizia sull'omogeneizzatore e asciugarlo bene per la conservazione.
  31. Posizionare circa 200 μl di ogni organo in un pozzo individuale di una piastra di 96 po '.
  32. Eseguire diluizioni seriali sui campioni d'organo diluendo 1:10 in una serie fino a una diluizione 1:10.000 (fegato e milza) o fino a una diluizione 1:1.000 (cuore).
  33. Immacolata la serie di diluizioni sull'agar LB prerifapidto. Rimuovere anche 20 ul di ogni organo e piastra non diluiti su piastre di agar LB separate al fine di enumerare il CFU da organi scarsamente colonizzati.
  34. Scartare i tubi del falco contenenti gli organi omogeneizzati e avvolgere le piastre a 96 potte contenenti la serie di diluizione con parafilm e posizionare in una scatola congelatore a -80 °C.
  35. Lasciare asciugare le macchie. Questo processo viene velocizzato posizionando le piastre nel cofano e rimuovendo i coperchi.
  36. Dopo che le macchie si sono asciugate, posizionare i piatti in un'incubatrice a 37 °C durante la notte.
  37. Contare il numero di colonie in ogni punto la mattina seguente e utilizzare la serie di diluizione per calcolare il numero totale di batteri per organo.

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Representative Results

Isolati selezionati di L. monocytogenes mostrano una maggiore invasione delle cellule cardiache nella coltura cellulare e nei modelli di infezione dei topi. La figura 1 mostra un esempio di come le colonie batteriche possano apparire a seguito della placcatura spot delle sospensioni sui mezzi agar. Questo metodo consente una valutazione accurata dei CFC all'interno di un campione senza utilizzare un gran numero di piastre di supporto agar. La figura 2 mostra un esempio di saggio basato sulla coltura tissutale che confronta la capacità del ceppo 10403S di invadere le cellule cardiache con quella del ceppo 07PF0776. Più del doppio del CFU batterico 07PF0776 può essere recuperato da cellule cardiache H9c2 infette a seguito del trattamento con gentamicina rispetto alle cellule infettate da 10403S. Differenze da 2 a 4 volte sono regolarmente osservate per i ceppi cardiotropici usando questo saggio. La figura 3 mostra un esempio del recupero di batteri dal fegato, dalle milza e dal cuore dei topi infetti a 3 giorni dopo l'infezione. L'infezione dei topi con il ceppo cardiotropico 07PF0776 o ceppo 10403S si traduce in un numero comparabile di batteri recuperati dal fegato e milza di topi infetti, tuttavia i topi infettati da 07PF0776 hanno maggiori probabilità di produrre un numero rilevabile di batteri dal cuore e di mostrare maggiori fardelli batterici in questo organo.

Figure 1
Figura 1: Esempio di tecnica di placcatura spot per la determinazione dei CFC batterici. Le cellule H9c2 coltivate su coverlips di vetro e infettate da L. monocitogenes sono state lisci e le sospensioni sono state diluite in serie usando diluizioni 1:10 fino a una diluizione 1:1,000 (pannello sinistro). Una pipetta multicanale è stata utilizzata per convogliare 10 ul da ogni pozzo direttamente su una piastra di agar LB e la piastra è stata incubata durante la notte a 37 °C (pannello destro). Il numero di batteri per coverslip viene valutato contando la CFU batterica associata all'appropriata diluizione.

Figure 2
Figura 2: Il ceppo L. monocytogenes 07PF0776 presenta una maggiore invasione delle cellule cardiache nella coltura tissutale. I test di invasione sono stati eseguiti in cellule H9c2 usando un MOI = 100. Il grafico mostra il numero medio di CFC batterici intracellulari recuperati +/- SE da cellule infettate da 10403S (nero) rispetto al ceppo cardiotropico 07PF0776 (blu). ** indica un significato di p <0,01.

Figure 3
Figura 3: Il ceppo L. monocytogenes 07PF0776 mostra una maggiore invasione del cuore nei modelli di infezione del topo. L'animale è stato inoculato con 10.000 CFU attraverso la vena della coda. Le infezioni sono state autorizzate a progredire per 72 ore, a quel punto gli animali sono stati sacrificati e i fegati, le milza e i cuori sono stati raccolti e elaborati per determinare la CFU batterica per organo. I cerchi solidi rappresentano la CFU ottenuta da singoli topi, con il valore medio per tutti gli animali all'interno di un gruppo indicato da una linea +/- SE. I valori percentuali indicano il numero di animali contenenti CFU batterico rilevabile all'interno del cuore. * indica un significato di p <0,05.

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Discussion

L. monocytogenes è un agente patogeno umano diffuso e ben caratterizzato, in grado di causare una serie di diverse manifestazioni di malattia15. Il batterio è stato precedentemente descritto per la sua capacità di trasporre attraverso barriere, come la barriera ematico-encefalica e le barriere placentare-fetali, al fine di raggiungere e colonizzare il sistema nervoso centrale e sviluppare il feto, rispettivamente. La capacità in vivo dell'organismo di colonizzare questi tessuti è spesso completata da una capacità in vitro di invadere le cellule rappresentative in coltura che compongono gli organi presi di mira. Ad esempio, l'invasione delle cellule epiteliali nel plesso coroideo è stata associata alla capacità dell'organismo di colonizzare il SNC16; e le espianto villose di troblasti sono state utilizzate per rappresentare la barrieramaterno-fetale 17. In questo protocollo, sono stati descritti metodi utili per valutare l'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e per il confronto della colonizzazione batterica del cuore per singoli isolati relativi alla colonizzazione del fegato e della milza.

Questo protocollo contiene una serie di passaggi critici, ma tra i più critici ci sono quelli che coinvolgono l'uso della CFU batterica corretta per l'infezione delle cellule di coltura tissutale coltivate su coverlips o l'infezione degli animali. Se il numero cfu batterico non è controllato correttamente tra pozzi e animali diversi, non è possibile effettuare confronti diretti tra campioni. È importante ricontrollare la serie di diluizione utilizzata per generare l'inocula mediante placcatura diretta delle diluizioni finali sulle piastre dei supporti al fine di garantire che il numero di CFU batterico sia stato accuratamente stimato.

Le cellule H9c2 utilizzate in questi saggi derivano dalla metà inferiore di un cuore di ratto embrionale di 13 giorni che includeva principalmente tessuto ventricolare18. Le cellule si propagano come mioblasti mononucleati e una volta raggiunta la confluenza nei contenitori o nei piatti di coltura tissutale iniziano a formare strutture tubolari multinucleate. Le cellule hanno un tempo di generazione di circa 30 ore18. La fame siere delle cellule H9c2 è stata associata alla differenziazione delle cellule in cellule muscolari scheletriche, mentre il trattamento dei mioblasti con acido retinoico completamentetrans da 10 nM è stato associato alla differenziazione del mioblasto in miociti cardiaci14. Questo protocollo era incentrato sull'invasione delle cellule di mioblasto di L. monocytogenes, tuttavia la linea cellulare H9c2 è una linea cellulare versatile che potrebbe essere utilizzata per studiare gli effetti della differenziazione cellulare controllata sull'invasione batterica.

Il ceppo L. monocytogenes 07PF0776 era originariamente isolato da un paziente infettato da HIV che aveva un arresto asintolico non riutilizzabile a causa di un'infezione invasiva di L. monocytogenes del cuore8. Successive analisi di questo ceppo nei modelli di infezione del topo hanno indicato che aveva una maggiore capacità di colpire e invadere il tessuto cardiaco. Un'analisi limitata di ulteriori isolati casuali di L. monocytogenes suggerisce che le sotto-popolazioni di isolati batterici sono in grado di infettare il cuore dei topi in assenza di danni precedenti al tessuto cardiaco o alle valvolecardiache 8. È interessante notare che due dei ceppi di L. monocytogenes meglio caratterizzati, 10403S ed EGD, sono risultati essere poveri colonizzatori di cellule cardiache e tessuti. Il sequenziamento del genoma dell'isolato 07PF0776 non ha rivelato la presenza di nuove isole patogenicità né fornito prove di ammassi geneticiunici 19; questo suggerisce che lo 07PF0776 prende di mira le cellule cardiache per l'invasione attraverso la modifica del suo arsenale esistente di prodotti genetici di virulenza. L'analisi istochimica preliminare indica che 07PF0776 forma ascessi all'interno di cuori di topo infetti che appaiono simili all'ascesso osservato all'interno del paziente umano infetto originale (dati non mostrati). Resta da determinare se altri isolati cardiotropici di L. monocytogenes inducano una formazione simile di ascesso cardiaco.

I test qui presentati possono essere facilmente modificati per facilitare l'esame dei diversi aspetti dell'infezione. Le singole coverlips possono essere fissate e macchiate per microscopia a base di luce o fluorescenza, i tempi di incubazione della coltura tissutale possono essere aumentati per la misurazione e il confronto dei tassi di crescita intracellulare dei batteri, i tessuti e gli organi possono essere incorporati e elaborati in paraffina per un esame microscopico per esaminare la formazione di ascesso e la distribuzione batterica a livello cellulare. Quando si valutano i livelli di invasione batterica delle cellule di coltura tissutale o colonizzazione dei tessuti ospiti, ci sono limitazioni in termini di quantità minima di batteri che ogni saggio può rilevare. I test di invasione in vitro hanno un limite inferiore di rivelazione di circa 300 CFU per coverlip. La regolazione del volume d'acqua utilizzata per vortice dei coprispavimenti può migliorare il rilevamento di un basso numero di batteri, con volumi di lisi cellulare fino a 500 μl che si rivelano utili per rilevare ceppi scarsamente invasivi. Le copertine possono essere brevemente imbrosi in acqua sterile per rimuovere la gentamicina in eccesso prima della llisi delle cellule ospiti in volumi inferiori. Livelli di volume fino a 5 ml o più possono essere utilizzati per enumerare correttamente i ceppi altamente invasivi. Negli animali, gli omogeneati di organi possono essere generati in volumi di 5 ml o 10 ml di ddH20, con volumi inferiori utili per rilevare livelli più bassi di batteri e volumi più elevati per enumerare meglio gli organi fortemente colonizzati. L'intervallo minimo di rilevamento per gli organi infetti è di circa 100 CFU. Se gli organi sono costantemente colonizzati ad alti livelli, prendere in considerazione l'utilizzo di un volume maggiore di acqua (10 ml) e l'esecuzione di più diluizioni all'interno della piastra da 96 porsi.

I metodi descritti possono essere applicati ad organi e tessuti al di fuori del cuore. Test di invasione e infezioni del topo come questi sono stati utilizzati per valutare la colonizzazione in una moltitudine di siti, tra cui placenta, cervello, cistifellea, fegato e intestino. Le modifiche dei protocolli sopra descritti possono anche essere fatte al fine di ospitare ceppi iperinvasivi e / o ipervirulenti, e la sostituzione delle cellule cardiache con altri tipi di cellule può essere fatta per valutare i fenotipi di invasione in siti al di fuori del sistema cardiovascolare. Poiché diversi tipi di cellule hanno alterato le suscettibilità all'invasione di L. monocytogenes, possono essere necessari parametri di regolazione come MOI e tempi di incubazione per recuperare accuratamente i dati dai test.

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Disclosures

Gli autori non segnalano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del Servizio Sanitario Pubblico AI41816 e AI099339 (N.E.F.) e da F31AI094886-01 (P.D.M.) di NIAID. I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali delle fonti di finanziamento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco BHI Broth Base 237200 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2 kg of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12 mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14 ml Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75 cm2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

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References

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Infezione Problema 99 Patogenesi batterica patogeno intracellulare tropismo tissutale invasione batterica infezione cardiaca listeriosi
Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti <em>utilizzando listeria monocytogenes</em>
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McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

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