リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

Summary

リステリア単球遺伝子は、妊婦の胎児感染を引き起こし、感受性のある集団では髄膜炎を引き起こす。 細菌の亜集団は心臓組織を植民地化し、患者および実験動物に心筋炎を引き起こす可能性がある。 ここでは、感染した動物におけるL.単球遺伝子の心臓細胞浸潤および心臓コロニー形成を評価する方法を説明するプロトコルを提示する。

Abstract

リステリア単球遺伝子は、免疫不全患者、高齢者、および妊婦に重篤な侵襲感染を引き起こす可能性のあるグラム陽性の栄養性細胞内病原体である。 ヒトにおけるリステリア症の最も一般的な症状には、髄膜炎、脳炎、および胎児中絶が含まれる。 侵襲的なL.単球遺伝子感染の有意だが、はるかに文書化された後遺症は、心臓を含む。 心臓病による死亡率は治療にもかかわらず最大35%までであり得るが、心臓組織のL.単球遺伝子コロニー形成およびその結果として生じる病理に関してはほとんど知られていない。 さらに、最近では、L.モノサイト遺伝子の亜集団が心臓組織内に侵入し、成長する能力が強化されたことが明らかになりました。 このプロトコルは、L.単球遺伝子分離株の心肺を評価するために使用することができるインビトロおよびインビボ法で詳細に記述する。 組織培養におけるH9c2ラット心筋芽細胞の感染、ならびに感染したマウスの心臓の細菌コロニー形成の決定のための方法が提示される。 これらの方法は、感染した動物の心臓組織を植民地化する可能性のある株を同定するのに有用であるだけでなく、心臓細胞の浸潤を増強し、心臓病理学の変化を促進するのに役立つ細菌遺伝子産物の同定を促進する可能性がある。 これらの方法はまた、複数のL.単球遺伝子株間の心筋症の直接比較を提供する。

Introduction

リステリア単球遺伝子は、高齢者、妊婦、HIV/AIDSを有する人、および化学療法を受けている人を含む、感受性の高い集団において重篤な疾患を引き起こすことができるグラム陽性細胞内病原体^である。これらの集団における感染は、汚染された食品を摂取した結果が多く、ほとんどの感染症は大規模な食物媒介性の流行^2,3に関連している。ヒトおよび他の哺乳動物において、L.単球遺伝子は小腸の上皮境界を越えて転位することが可能であり、その後肝臓^4,5に輸送される。動物モデルは、摂取した細菌が腸絨毛内で複製し、門脈静脈を通って肝臓に移動したり、腸間膜リンパ節を介して血流に広がったりし、肝臓および脾臓への血中血球播種化につながることを示唆^{している。}肝臓および脾臓において、細菌は、プロの食細胞と常駐的なパレンキマル細胞の両方への取り込みを媒介することができ、これらの器官内の感染を迅速に確立する。細菌の負荷が増加するにつれて、多数の細菌が血液中に分散され、中枢神経系および胎盤(存在する場合)を含む感受性の組織をさらに植民地化することができる。これらの部位のコロニー形成は、髄膜炎、脳炎、および胎児中絶を含むヒトにおけるリステリア症の最も一般的な症状を妨げる^2。

選択されたL.単球遺伝子の亜集団は、最近、心臓組織⁸内に侵入し、複製する能力が増強されたことが示されている。心臓の関与の症状は様々であり、心内膜炎および心膜炎から伝導異常を伴うフルミナント心筋炎^まで9-13の範囲である。1年間のL.モノサイトゲネス心臓症例の総数は低いが、この感染のファセットが一般的に十分に認識されていないので、推定される可能性がある。病原体による心臓のコロニー形成には、多くの場合、既存の弁膜損傷または人工心臓弁などの宿主素因が必要である。しかし、心臓損傷および/または異常がない場合に感染した動物の心臓を植民地化する能力のために顕著であるL.単球遺伝子の単離者⁸がある。

本明細書明細書 では 、生体内および 生体内 で、生きた動物感染と同様に組織培養における浸潤アッセイを用いて感染動物内の心臓組織の細菌コロニー形成を評価する方法について説明する。これらの方法は、感染した動物の心臓組織を植民地化する可能性のある株を同定する上で有用であるだけでなく、心臓細胞の浸潤を増強し、心臓病理の変化をもたらす細菌遺伝子産物の同定にも有用であることが証明されている。これらの方法は、複数の株間の心筋症の比較を容易にする。ここで説明する方法については 、L.モノサイトゲネス 10403Sは、非心熱帯性株の十分に研究された代表として使用され、臨床分離株07PF0776は、心熱帯株の代表例として使用される。これら2つの株は、 生体内で の心臓細胞の細菌浸潤と 生体内での感染したマウスの心臓のコロニー形成との比較を提供するために選ばれた。分離株07PF0776は、HIV+患者⁸において致命的な不整脈を引き起こした心室間膿瘍から回復した臨床的分離株である。 L. 単球遺伝子 単離株は、その毒性の可能性が異なる可能性があり、 リステリア が免疫抑制および妊婦に感染する傾向を考えると、これらの集団内の人々は、異なる臨床分離株を評価しながら注意を払うべきである。

Protocol

1. L. 単球遺伝子 株の保存と培養条件

1. 脳心注入寒天(BHI)をオートクレーブし、溶融培地をシャートリプレートに注ぐことで固体培地を準備する。プレートを室温で一晩乾燥させ、その後37°Cで再び一晩乾燥させます。
2. 滅菌ループを使用して、以前に作られた冷凍庫のストック(BHI液体培地中の20%グリセロールに懸濁した細菌、-80°Cで保存された細菌)または以前に単離のために打たれたコロニーを含む寒天プレートから 、L.モノサイトゲネス の小さなサンプルを得る。
3. 無菌技術を使用して、単一コロニー分離のためのサンプルをストリークする。クロスストリーク間のループを殺菌して過剰な持ち越しを防止し、評価される株の個々のコロニーの分離を確実にしてください。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
4. 滅菌ループを使用して、14mlポリスチレンチューブで分離物のコロニーを1つ取り除き、2mlのBHIブロス(寒天なし)を接種します。
5. アッセイおよび感染症の場合、37°Cインキュベーターで一晩(振盪せずに)静かな(振盪せずに)スープ培養液をインキュベートする。培養した分離株のストッキングのために、180〜200rpmで一晩振盪して37°Cで培養したスープをインキュベートする。培養物は、グリセロールを20%の最終濃度に加え、-80°Cで密閉管を無期限に保存することによって貯蔵することができる。

2. H9c2心臓筋芽細胞様細胞の貯蔵と培養条件

1. H9c2細胞の冷凍ストック、高グルコースおよびピルビン酸を含むデュベルコの修飾イーグル培地(DMEM)、胎児ウシ血清(FBS)、L-グルタミン(グルト)、ペニシリンストレプトマイシン-グルタミン混合物(PSG)を購入または取得します。 FBS、大食い、およびPSGは-20°Cでストックする必要があり、DMEMは4°Cで保存することができます。 凍結前にFBSを50mlの円錐形チューブにアリクォートするのに役立ちます。
2. 層流フードでは、FBSの2つのアリコートを解凍します。1つの500 mlボトルのDMEMにアリコートを1つ加え、10%FBS/DMEM混合物を作ります。これに、6 ml のグルトを加え、得られた溶液を 4 °C でストックします。 このソリューションは、「抗生物質なしのDMEM」とラベル付けすることができます。(DMEM -アブ)
3. DMEMの2番目の500 mlボトルに、FBSの他の50 mlアリコートを加えます。このソリューションには、6 ml の PSG と 4 °C の在庫を加えます。 このソリューションは、「抗生物質を伴うDMEM」とラベル付けすることができます。(DMEM +アブ)
4. 薄層フードの中で、DMEM +Abの10mlを取り除き、25mlの組織培養フラスコに入れる。
5. フラスコをラミネールフードに残し、液体窒素中に貯蔵されたH9c2細胞の凍結アリコートを取り除き、培養液が解凍されるまで37°Cの水浴にチューブを素早く入れます。
6. チューブに70%エタノールをスプレーして消毒し、フードに戻します。濃縮DMSOで細胞時間を最小限に抑えるために迅速に働き、DMEM +Abの10 mlに細胞の完全なアリコートを加える。 これは、一晩の細胞生存率および付着のためにDMSOを十分に希釈する。
7. フラスコを組織培養インキュベーターの37°C、5%C0_2、湿度95%で一晩置きます。
8. 翌朝、セル層を確認して、接着を確認します。細胞は、この時間までに80〜100%コンフルエントの間にある可能性が高い。
9. 組織培養フード内で、フラスコ内に含まれる培地を真空を使用して取り出し、フラスコ内の細胞のみを残します。
10. 約2mlの0.25%トリプシン-EDTAを細胞に加え、約3秒間静かに揺れる。
11. トリプシン溶液が単層に接触しなくなったようなフラスコを反転させ、真空によってトリプシンを取り除く。
12. トリプシンの2mlアリコートを細胞に加え、フラスコを反転顕微鏡に移動させます。フラスコを穏やかに揺らしながら細胞を観察し、単層が分散することを確認します。
13. 単層が分散されたら、すぐに組織培養フードに戻り、4mlのDMEM+Abを細胞懸濁液に加える。
14. 細胞懸濁液の2ml部分を取り除き、23mlのDMEM+Abを含む50mlの組織培養フラスコに加え、フラスコを穏やかに揺らし、ステップ2.5に記載された条件で組織培養インキュベーターに入れる。
15. 約80%の合流(1mlあたり約2.0〜4.0 x 10^細胞 )に達するまで、細胞を毎日チェックしてください。細胞が¹⁴ 時間の長期にわたってFBSに飢えたときに骨格筋筋チューブに分化し、この分化が細菌の侵入を変える可能性があるため、細胞があまりにもコンフルエントにならないことは非常に重要です。 細胞を注意深く監視し、培養がコンフルエントになった場合は、細胞の新しいチューブから始めます。
16. 細胞が80%合流に達すると、それらがちょうど述べたように別の50 mlフラスコに通されるか、または侵略アッセイのために準備することができる。

3. 侵略アッセイのためのH9c2細胞の準備

1. 組織培養フードでは、真空吸引を用いて80%合流に達したH9c2細胞の50mlフラスコから培地を取り除きます。
2. 0.25%トリプシン-EDTA溶液を4mlを単層に加え、真空吸引を使用してすぐに取り除きます。
3. 0.25%トリプシンEDTAの別の4 ml部分をフラスコに加え、フラスコを反転顕微鏡に移動して単層の分散を観察します。
4. 細胞が分散したら、フードに戻り、4 ml の DMEM –Ab を細胞に加えます。溶液を上下にピペット化することで、フラスコの底部から細胞を完全に除去できます。
5. 単層の再懸濁液に続いて、すべての懸濁液を取り除き、50mlの円錐形チューブに入れます。
6. この懸濁液の20ul部分を取り除き、ヘモサイトメーターを使用してミリリットル当たりの細胞数を数えます。
7. 溶液中の細胞の濃度が決定されたら、新鮮なDMEM -Abに適切な量の細胞溶液を添加して、2.25 x 10⁴ 細胞/mlに濃度を調整します。調整された溶液の総容積は25mlでなければならない。
8. ボンネットの中で、90%エタノールに浸し、各カバースリップを炎に短時間入れて、ガラスカバーリップを殺菌します。滅菌された直後に、24ウェル組織培養処理プレートの個々のウェルに各カバースリップを追加します。
9. すべての井戸が個々のカバースリップを持った後、25 mlのピペットを使用してプレート内の各ウェルに希釈セル溶液1mlを加え、各カバースリップを無菌針で押し下げる。
10. 反転した顕微鏡を使用して各ウェルをチェックして、同様の量の細胞が各ウェルにあることを確認します。24ウェルプレートを組織培養インキュベーターに一晩37°Cで5%CO2と湿度95%で入れます。
11. 翌朝、各井戸を見て、カバーリップが同等の量の付着筋芽細胞を持ち、カバーリップが井戸に浮かんでいないことを確認します。

4. 侵略アッセイのための L.単球遺伝子 の株の準備

注:すべてのラボ作業は、CDCバイオセーフティレベル2ガイドラインに従って行われます。

1. 24ウェルプレートをアッセイ用に調製した後、殺菌されたループを使用して、細菌の侵入を検査する株の単一コロニーを除去し、それぞれを2mlのBHIブロスを含む個々の14mlチューブに接種する。
2. 接種チューブを45°で傾けた37°Cインキュベーターに入れ、一晩静に(揺れずに)インキュベートします。
3. 翌朝、培養管をインキュベーターから取り出し、ボルテックスを短時間取り出して、細菌の均一な懸濁を確実にする。
4. 分光光度計を用いて600nm波長の培養物の光学濃度を測定する。光学濃度を読み取る前に、滅菌BHIブロスを使用して分光光度計をゼロにしてください。
5. L.単球遺伝子の場合、光学密度は1ml当たりの細菌の濃度に直接関係し、1ml当たり1.000=1.0 x¹⁰⁹ CFUの密度となる。
6. 2.25 x 10⁴ 細胞に2.25 x 10^6(MOI = 100)を感染させるために必要な培養量を計算します。
7. 必要な培養量を取り除き、1.5ml遠心管に入れる。
8. 19,000 x g で培養を 3 分間回転させてから、上清を捨てます。チューブのリップに付いた余分なメディアを除去するために、ペーパータオルに対してチューブの開いた端をタップします。
9. 細菌を1mlの滅菌PBSで再懸濁し、ボルテックスを十分に混合するようにする。この混合物は、約2.25 x 10⁶ CFUあたり20 ul(1.125 x 10⁸ CFU/ml)を含む必要があります。

5. 侵略アッセイの実行

1. 侵入アッセイの前日に、セクション3に記載されているようにH9c2細胞の24ウェルプレートを調製し、またセクション4に記載されているように リステリア の所望の株で無菌BHIブロスを接種する。
2. セクション4のプロトコルを使用して、浸潤を評価する株のPBS再懸濁培養を調製する。注:感染力価は、各サンプルの希釈を固体培地にめっきし、一晩インキュベーション後にコロニーを列挙することによって、この時点で評価することができる。
3. 24ウェルプレートの個々の井戸にPBS-バクテリア溶液の少なくとも20 ulをロードします。3重化の結果を得るためには、各株に少なくとも3つの個々のウェルが必要であるため、最大8株を並行して評価することができます。
4. 細菌で井戸をロードした後、プレートを穏やかに揺らし、井戸内の各サンプルの均質な広がりを促し、24ウェルプレートをインキュベーターに戻し、37°Cと湿度95%で45分間、5%CO2で置きます。
5. このインキュベーション中に、DMEM – Ab (セクション 2) のアリコートを準備するには、DMEM –Ab を 25 ml 除去し、それを 50 ml のハヤブサチューブ (または同等物) に入れるだけで済みます。
6. 15 ug/ml (50 mg/ml ストック溶液の 7.5 ul) の濃度に 25 ml DMEM –Ab アリコートにゲンタマイシンを加えます。DMEM –Ab +ゲント溶液を37°Cの水浴に入れ、45分間のインキュベーションを行います。
7. アリコート25mlのPBSを50mlのハヤブサチューブに入れ、45分インキュベーション中に37°Cの水浴に入れる。
8. 45分のインキュベーションが完了したら、24ウェルプレートを取り外し、ボンネットに入れなさい。真空吸引によって各ウェルから細菌を含む培地を取り除き、異なる株間でガラスピペットの先端を変更します。
9. 細胞の表面から緩やかに付着した細菌を洗浄するために、各ウェルに約1mlのPBSを加え、次に真空吸引を用いてPBSを除去する。
10. PBSを完全に除去した後、 DMEM –Ab +ゲントを各ウェルに 1 ml 追加します。ゲンタマイシンは細胞の外に残っている細菌のみを殺すため、細胞内の細菌は生存可能なままです。
11. 24ウェルプレートをインキュベーターに戻し、さらに1時間インキュベートします。
12. 1時間の長いインキュベーションの間に、各チューブに1mlの無菌ddH₂0を加えて14mlのポリプロピレンチューブを調製する。カバースリップごとに1本のチューブが必要になりますので、24ウェルプレート1個の場合は合計24本のチューブを用意します。
13. 1時間の長いインキュベーションの後、インキュベーターから24ウェルプレートを取り出し、ステップ5.12で準備したチューブと一緒にボンネットに入れます。
14. 滅菌ピンセットを使用して、それぞれのウェルから各カバースリップを取り外し、すぐに個々のチューブに入れます。混入防止のため、ピンセットをエタノールに浸し、各カバースリップの間に炎を当てるようにしてください。
15. すべてのカバーリップを取り外して個々のチューブに入れた後、24ウェルプレートを捨てます。
16. ベンチに戻り、各チューブを5〜10秒間渦に戻します。
17. 各チューブから一部を取り出し、各サンプルを96ウェルプレートの個々のウェルに入れ、1:10希釈液を使用して各サンプルを1:100希釈まで連続して希釈します。
18. プリウォームとドライLBプレートを使用して、寒天プレートに希釈シリーズの各スポットプレート。マルチチャンネルパイプは、各サンプルの希釈系列から5〜10 μlのスポットをプレートするために使用できます。
19. また、希釈されていないウェルとスポットプレートから20μlのサンプルを取り除き、希釈シリーズから別のプレート上のLB寒天に直接この量をスポットプレートします。(この大きなボリュームは、侵襲性の低い株を列挙するために使用することができます)。
20. すべてのサンプルがスポットメッキされた後、カバーリップを含む14mlチューブを捨てます。96ウェルプレートをパラフィルムし、必要に応じて再めっきのために-80°Cの冷凍庫ボックスに入れます。
21. スポットを完全に乾燥させます。このプロセスは、ボンネットにプレートを配置し、蓋を取り除くことによって大幅に急がれます。
22. スポットが乾燥した後、プレートを一晩37°Cインキュベーターに入れます。
23. 翌朝、コロニー数を簡単に評価できる希釈系列の各スポットのコロニー数を数え(約5~50コロニー)(図1)、評価した各菌株のカバースリップ当たりの細菌数を計算する。

6. マウス感染のための L.単球遺伝子 の株を準備する

1. 感染前の夜には、殺菌されたループを使用して、所望の株の単一コロニーを除去し、それぞれを2mlのBHIブロスを含む個々の14mlチューブに接種する。
2. 接種チューブを45°で傾けた37°Cインキュベーターに入れ、一晩静に(揺れずに)インキュベートします。
3. 翌朝、培養管をインキュベーターから取り出し、ボルテックスを短時間取り出し、細菌の均一な懸濁を確実にする。
4. 分光光度計を用いて600nm波長の培養物の光学濃度を測定する。光学濃度を読み取る前に、滅菌BHIブロスを使用して分光光度計をゼロにしてください。 (L. モノサイト遺伝子の場合、光学密度は 1 ml 当たりの細菌の濃度に直接関係し、1ml当たり 1.000 = 1.0 x 10^{9 CFU} の密度が関係します)
5. 各動物に感染するために必要な培養量を計算します。注射は通常、10,000 CFUの個々の株のPBSの200 μlを含み、所望の濃度である5.00 x 10⁴ CFU/mlに変換されます。
6. 各最終希釈液の5μlアリコートを取り除き、LB寒天に直接広げます。 37°Cで一晩インキュベートし、接種に使用した濃度を確認します。
7. 希釈の1時間以内に各CFU懸濁液を注入します(下記参照)。

7. 尾静脈注射によるマウスへの L.単球遺伝子 の接種と肝臓、脾臓、心臓内の細菌負担の評価

注:すべての動物の作業は、CDCバイオセーフティレベル2ガイドラインに従って行われます。 マウスは通常、1週間前に1週間順に並べられ、ケージあたり5匹の動物と共にケージに入れられます。マウスは、注射前に4日間、新しい実験室環境に順応することが可能である。これらの実験では、バリア環境でケージに5匹収容され、制限のない食事を与えられた6〜8週齢のスイスウェブスターマウスを使用した。

1. ふたと食べ物/水のビンを取り外し、5分間ヒートランプの下にケージを置くことによって、一度に1つのケージを準備します。このプロセスは、尾静脈を拡張することを可能にし、注射を行いやすくする。
2. 1匹の動物を取り除き、注射中に動物を拘束するためにハーネス(または端が切り取られたハヤブサチューブ)に入れられます。
3. アルコールパッドを使用して注射部位をきれいにし、アルコールを蒸発させる。これは、サイトを浄化するだけでなく、さらに尾静脈を拡張します。
4. 27.5ゲージ針を装着した1mlシリンジを使用して、目的の培養液を200μlで尾静脈にそっと注射します。
5. ガーゼを使用して、注射の結果として発生する出血を止め、動物を新鮮なケージに入れます。
6. 残りの動物や株に対してこのプロセスを繰り返します。動物のケージごとに、受け取った菌株を必ず貼り付けてください。
7. 病気と思われる動物を取り除き、犠牲にして、毎日動物をチェックしてください。 動物が病気の徴候を示さない場合は、すべての動物を犠牲にする前に、感染を72時間進行させます。
8. 犠牲にするには、すべての呼吸が停止するまで、ボトル入りソースからの_CO2 麻酔を使用し、動物が死んでいることを保証するために子宮頸部脱臼を使用します。
9. 犠牲に続いて、解剖のために動物を組織培養フードに移動させる。
10. 解剖ブロックを使用して、大きなゲージ針で動物の各脚をピン留めし、それが飽和するまで70%エタノールで動物をスプレーします。
11. 膣の開口部からxiphoidプロセスまで延びるY字型の切開を使用して腹部と胸部の皮膚を切り取り、各腕の腋窩まで進行する。
12. 皮膚を引き戻し、各脚から針を取り除き、解剖を開いたままにします。
13. 腹膜を優しく切り抜き、腸、胃、肝臓、脾臓を露出させる。
14. 最初に肝臓の上部にある肝静脈とコロナリ靭帯を切断することによって、肝臓を取り除き始める。取り除かれる追加の靭帯は肝臓の下にあり、小腸の最初のセクションと背中の筋肉に接続します。
15. 50mlのハヤブサチューブに5mlの無菌ddH₂0に肝臓を入れる。
16. 次に、脾臓を単離し、血管系と靭帯を軽く切断して脾臓を取り除きます。脾臓は肝臓よりも容易に除去されます。.5 mlの無菌ddH₂0を含む別のハヤブサチューブに脾臓を入れる。
17. 胸郭を視覚化するために、ダイヤフラムを見つけ、胸部に沿ってそっと切ります。胸郭を開くために、xiphoidプロセスと胸骨を首のレベルまで切り抜け、心臓と肺を露出させます。
18. 鉗子を使用して、その頂点で心臓を穏やかにつかみ、大動脈および肺の血管が緊張しているようなそれを持ち上げる。これらの血管を切って心臓を解放する。
19. 5 mlの無菌ddH₂0を含む50mlのハヤブサチューブに心臓を入れる。
20. マウスの死体を捨てて、各臓器に5mlの無菌ddH₂0を含むきれいなハヤブサチューブを使用して、すべての動物に対してこのプロセスを繰り返します。
21. すべての臓器が取り除かれた後、ワークステーションを清掃してベンチに戻ります。
22. 5匹のマウス(5 つの肝臓に5つのチューブセット、5つの脾臓用5本のチューブ、5つの心臓に5つのチューブ)から各器官のホモジナイザーを洗浄し、殺菌するために使用される5つのチューブのセットを準備します。各管の4つは30 mlの生殖不能ddH₂0で満たされるべきであり、1つは30 ml 90%EtOHで満たされるべきである。
23. ティッシュマスター(または同等のホモジナイザー)を使用して、ホモジナイザーを(実行中に)ステップ7.21で作成したチューブに次のように浸してプローブを洗浄します。
24. チューブ 1 (ddH₂O)
    チューブ 2 で 5 秒 (ddH₂O)
    チューブ 3 (EtOH) で 5 秒
    チューブ 4 (ddH₂O) で 5 秒
    チューブ 5 (ddH₂O) で 5 秒
25. ホモジナイザーを使用して1つの肝臓を少なくとも2分間、または臓器の可視部分が残らないまで均質化する。ピンセットを使用して、プローブから大きな破片を取り除く。
26. ステップ 7.22 で説明したクリーニングプロセスを繰り返します。
27. 他の肝臓についても均質化プロセスを繰り返し、ステップ7.22で説明したプロセスを用いて各肝臓間でプローブを洗浄することを確認する。
28. すべての肝臓が完全に均質化された後、肝臓の洗浄管(1-5)を捨てる。
29. 脾臓と心臓の両方に均質化/クリーンなプロセスを繰り返し、一連の器官ごとに新しい洗浄チューブのセットを使用してください。洗浄チューブが濁った場合は、それらを廃棄し、シリーズを終了するために新しいチューブに交換します。
30. すべての器官が均質化された後、ホモジナイザーで最後の洗浄サイクルを1回行い、貯蔵のためにそれをよく乾燥させる。
31. 各臓器の約200 μlを96ウェルプレートの個々のウェルに入れる。
32. 1:10,000希釈(肝臓および脾臓)または1:1000希釈(心臓)までのシリーズの1:10を希釈することによって、器官サンプルに連続希釈を行う。
33. 事前に温めたLB寒天に希釈シリーズをスポットプレート。また、不十分なコロニー形成された器官からCFUを列挙するために、希釈されていない各器官とプレートの20 ulを別々のLB寒天プレートに取り除きます。
34. 均質化された器官を含むハヤブサの管を捨て、希釈系列を含む96ウェルプレートをパラフィルムで包み、-80°Cの冷凍庫箱に入れます。
35. スポットを乾燥させます。このプロセスは、ボンネットにプレートを配置し、蓋を取り外すことによって迅速化されます。
36. スポットが乾燥した後、プレートを一晩37°Cインキュベーターに入れます。
37. 翌朝、各スポットのコロニー数を数え、希釈系列を使用して臓器あたりの細菌の総数を計算します。

Representative Results

選択した単球遺伝子の単離株は、細胞培養およびマウス感染モデルにおける心臓細胞の侵入を増強する。図1は、細菌コロニーが寒天培地上の懸濁液のスポットめっき後にどのように現れるかの例を示す。この方法により、多数の寒天メディアプレートを使用することなく、サンプル内のCFUsを正確に評価できます。図2は、株07PF0776の株と心臓細胞に侵入する株10403Sの能力を比較する組織培養ベースのアッセイの一例を示す。10403Sに感染した細胞と比較して、ゲンタマイシン治療後の感染したH9c2心臓細胞から2倍以上の07PF0776細菌CFUを回収することができる。このアッセイを用いた心性向きの株に対しては、2~4倍の違いが日常的に観察される。図3は、感染後3日での肝臓、脾臓、および感染したマウスの心臓からの細菌の回復の例を示す。心性異性器株07PF0776または株10403Sを有するマウスの感染は、感染したマウスの肝臓および脾臓から同じ数の細菌を生じるが、07PF0776に感染したマウスは、心臓から検出可能な数の細菌を生じさせ、この器官でより大きな細菌負担を示す可能性が高い。

図1:細菌CFUsを決定するためのスポットめっき技術の例。 ガラスカバーリップ上で増殖し 、L.モノサイトゲネス に感染したH9c2細胞を溶解し、懸濁液を1:10希釈まで1:10希釈(左パネル)で連続希釈した。マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから10ulをLB寒天プレートに直接ピペットし、プレートを37°C(右パネル)で一晩インキュベートした。カバースリップ当たりの細菌数は、適切な希釈に関連する細菌CFUを数えることによって評価される。

図2: L. 単球遺伝子 株 07PF0776 は、組織培養における心臓細胞の侵入の強化を示す。浸潤アッセイは、MOI=100を用いてH9c2細胞で行った。グラフは、10403S(黒)に感染した細胞から回収された細胞内細菌CFUsの平均数を示しています+/- SE対心熱帯07PF0776株(青)。** は p 0.01 の有意性を示<。

図3: L. 単球遺伝子 株 07PF0776 は、マウス感染モデルにおける心臓の侵入の強化を示す。動物は尾静脈を介して10,000 CFUで接種した。感染は72時間進行させ、その時点で動物は屠殺され、肝臓、脾臓、心臓を採取して処理して、臓器1個あたりの細菌CFUを決定した。実円は、個々のマウスから得られたCFUを表し、グループ内のすべての動物の平均値は+/-SEで示される。パーセンテージ値は、心臓内で検出可能な細菌CFUを含む動物の数を示す。* p < 0.05 の有意性を示す。

Discussion

L. 単球遺伝子 は、広範囲に及び、よく特徴づけられるヒト病原体であり、多くの異なる疾患症状を引き起こすことができる^15。細菌は、中枢神経系に到達し、植民地化し、胎児を発達させるために、血液脳関門や胎盤胎児障壁などの障壁を越えて移動する能力について以前に説明されています。これらの組織を植民地化する生物の 生体内 能力は、多くの場合、標的となる器官を構成する培養中の代表的な細胞に侵入する インビトロ 能力によって補完される。例えば、脈絡叢における上皮細胞の侵入は、CNS¹⁶を植民地化する生物の能力と関連している。絨毛性トロホブラストの外植物は、母体胎児の障壁¹⁷を表すために使用されてきた。本プロトコルでは、培養中の心臓細胞の細菌浸潤を評価する場合や、肝臓および脾臓のコロニー形成に対する個々の分離株に対する心臓の細菌コロニー形成の比較に有用である方法が記載されている。

このプロトコルには多くの重要なステップが含まれていますが、最も重要なものの中には、カバーリップで増殖した組織培養細胞の感染または動物の感染に正しい細菌CFUを使用するものがあります。細菌のCFU数が異なる井戸と動物の間で正しく制御されていない場合、サンプル間の直接比較は行うことができません。細菌CFU数が正確に推定されていることを保証するために、メディアプレート上の最終希釈液の直接めっきによってイノクラを生成するために使用される希釈系列を再確認することが重要です。

これらのアッセイで使用されるH9c2細胞は、主に心室組織¹⁸を含む13日間の胚性ラット心臓の下半分に由来する。細胞は単核筋細胞として増殖し、組織培養フラスコまたは皿中の合流に達すると、多核尿管構造を形成し始める。セルの生成時間は約 30 時間^{18 です}。H9c2細胞の血清飢餓は骨格筋細胞への細胞の分化と関連しているのに対し、10nM全トランスレチ ノイン酸による筋芽細胞の治療は心筋細胞¹⁴への筋芽細胞分化と関連している。このプロトコルは 、L.モノサイトゲネス ・ミオブラスト細胞の浸潤に焦点を当てたが、H9c2細胞株は、細菌の侵入に対する制御された細胞分化の影響を調査するために使用できる汎用性の高い細胞株である。

L.単球遺伝子株07PF0776は、もともと心臓⁸の侵襲的なL.単球遺伝子感染のために非再起性の収縮期逮捕を有するHIV感染患者から単離された。マウス感染モデルにおけるこの株のその後の分析は、心臓組織を標的と侵略する能力が増強されたことを示した。L. 単球遺伝子の追加のランダム分離株の限定的な分析は、細菌分離株のサブ集団が心臓組織または心臓弁への任意の以前の損傷がない場合にマウスの心臓に感染することができることを示唆している^8.興味深いことに、最も特徴付けられるL.モノサイトゲネス株の2つは、10403SおよびEGD、心臓細胞および組織の貧しいコロニー形成器であることが判明した。07PF0776単離のゲノムシーケンシングは、新しい病原性の島の存在を明らかにしたり、ユニークな遺伝子クラスター¹⁹の証拠を提供しませんでした。これは、07PF0776が病原性遺伝子産物の既存の兵器の改変を通じて侵入のために心臓細胞を標的とすることを示唆している。予備的な組織内化学分析は、07PF0776が感染したマウスの心臓内に膿瘍を形成し、元の感染したヒト患者内で観察された膿瘍と同様に見えることを示している(データは示していない)。他の心熱帯L.単球遺伝子が類似の心臓膿瘍形成を誘導する分離物であるかどうかはまだ決定されていない。

ここで提示されるアッセイは、感染のさまざまな側面の検査を容易にするために容易に修正することができる。個々のカバーリップは、光または蛍光ベースの顕微鏡検査のために固定および染色することができ、組織培養の培養時間を増加させ、細菌の細胞内増殖速度の測定および比較のために、組織および器官は、細胞レベルでの膿瘍形成および細菌分布を調べるためにパラフィン埋め込みおよび処理することができる。組織培養細胞の細菌浸潤または宿主組織のコロニー形成のレベルを評価する場合、各アッセイが検出できる細菌の最小量の点で制限がある。 インビトロ 浸潤アッセイは、カバースリップあたり約300 CFUの検出の下限を有する。カバーリップを渦巻くために使用される水の量を調整すると、低い数の細菌の検出を強化し、細胞のリシス量が500μlの低い場合、侵襲性の低い株を検出するのに役立ちます。カバーリップは、より小さな体積の宿主細胞のリシスの前に過剰なゲンタマイシンを除去するために滅菌水に短時間浸漬することができる。5 ml 以上のボリューム レベルは、侵襲性の高い株を適切に列挙するために使用できます。動物では、臓器ホモジネートは、5mlまたは10mlのddH₂0の体積で生成することができ、より低い量の細菌を検出するのに有用であり、より高い体積は、より大きくコロニー形成された器官をより良く列挙するのに有用である。感染した臓器の最小検出範囲は約100 CFUです。臓器が一貫して高レベルで植民地化されている場合は、より大きな量の水(10 ml)を使用し、96ウェルプレート内でより多くの希釈を行う方法を検討してください。

記載された方法は、心臓外の器官および組織に適用することができる。このような侵入アッセイやマウス感染症は、胎盤、脳、胆嚢、肝臓、腸を含む多数の部位での植民地化を評価するために使用されてきた。上記のプロトコルの修飾はまた、過侵襲および/または過毒性株を収容するために行うことができる、および他の細胞型との心臓細胞の置換は、心血管系外の部位での浸潤表現型を評価するために行われ得る。異なる細胞タイプが L.単球遺伝子 の侵入に感受性を変化させるので、アッセイから正確にデータを回復するためにMOIやインキュベーション時間などのパラメータを調整する必要があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Difco	BHI Broth Base	237200	2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco	Agar	214510	2 kg of Granulated Agar
Difco	BHI Agar	241810	2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen	LB Broth Base	12975-084	2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher	Glass Coverslips	12-545-80	12 mm glass coverslips
Falcon	24-well Tissue Culture Plate	35-3047	24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon	14mL Polystyrene tube	352051	14 ml Polystyrene tubes
Falcon	96-well U-bottom plate	35-3077	Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning	0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning	DMEM (High glucose, high pyruvate)	15-013-CU	DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning	Pen/Strep/Glut Solution	30-009-CI	Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning	Gentamicin	30-005-CR	50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning)	L-Glutamine	25005197	Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville	75cm^2 Flask	T1225	75 cm2 tissue culture treated flask
Denville	1.5mL microcentrifuge tubes	2013004	1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC	H9c2 Cardiac Myoblasts	CRL-1446	Rat cardiac myoblasts
Hyclone	Fetal Bovine Serum	SH30070.63	Fetal Bovine Serum