Summary
리스테리아 단세포 유전자는 취약한 인구에 있는 임산부및 뇌막염에 있는 태아 감염을 일으키는 원인이 됩니다. 박테리아의 하위 인구는 심장 조직을 식민지화 할 수 있습니다, 환자와 실험실 동물에 심근염을 일으키는. 여기에서 우리는 감염된 동물에 있는 체외 및 심장 식민지에 있는 L. monocytogenes 심장 세포 침략을 평가하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
리스테리아 단세포 유전자는 면역 손상 환자, 노인 및 임산부에서 심각한 침습적 감염을 일으킬 수있는 그램 양성 성 세포 내 병원균입니다. 인간에 있는 listeriosis의 일반적인 표현은 뇌막염, 뇌염 및 태아 낙태를 포함합니다. 침략적인 L. monocytogenes 감염의 중요하지만 훨씬 적게 문서화된 속편은 심혼을 관련시킵니다. 심장 병에서 죽음 비율은 처리에도 불구하고 최대 35%까지 일 수 있습니다, 그러나 아주 거의 심장 조직 및 그것의 결과병학의 L. monocytogenes 식민지에 관하여 알려져 있습니다. 또한, 최근 L. 단세포 유전자의 하위 인구가 심장 조직 내에서 침입하고 성장할 수 있는 향상된 용량을 가지고 있다는 것이 명백해졌습니다. 이 프로토콜은 L. monocytogenes 분리의 심폐소생학을 평가하는 데 사용할 수있는 생체 외 및 생체 내 방법에 대해 자세히 설명합니다. 방법은 H9c2 쥐 심장 근막의 감염뿐만 아니라 감염된 마우스의 심장의 세균 식민지의 결정에 대해 제시된다. 이러한 방법은 감염된 동물의 심장 조직을 식민지화 할 수있는 잠재력을 가진 균주를 식별하는 데 유용할뿐만 아니라 심장 세포 침입및 / 또는 심장 병리학의 변화를 촉진하는 역할을하는 세균 성 유전자 제품의 식별을 용이하게 할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 다중 L. monocytogenes 균주 사이 심혈 성 부속의 직접적인 비교를 제공.
Introduction
리스테리아 단세포 유전자는 노인, 임산부, HIV/AIDS를 가진 사람들 및 화학요법을 받는 사람을 포함하여 취약한 인구에 있는 가혹한 질병을 일으키는 원인이 될 수 있는 그람 양성 세포내병원체입니다 1. 이 인구에 있는 감염은 수시로 오염한 식품을 섭취의 결과이고, 대부분의 감염은 대규모 식품 매개 발발과 연관됩니다2,3. 인간과 다른 포유동물에서, L. monocytogenes는 소장의 상피 경계를 가로질러 배설할 수 있고, 그 후에 간4,5로이송된다. 동물 모델은 섭취한 박테리아가 장 내의 담악과 포털 정맥을 통해 간으로 이동하거나 혈류로 막대한 림프절을 통해 퍼지며 간 및 비장에 혈액 선서를 통해 혈액 류로 확산되는 것을 제안한다6,7. 간과 비장에서 박테리아는 전문 식세포뿐만 아니라 상주 한창 세포로 섭취를 중재 할 수 있으며 이러한 장기 내에서 신속하게 감염을 확립합니다. 세균성 하중이 증가함에 따라, 수많은 박테리아는 혈액으로 다시 분산되어 중추 신경계와 태반 (현재)을 포함하여 취약한 조직을 더 식민지화 할 수 있습니다. 이 사이트의 식민지는 뇌막염, 뇌염 및 태아 낙태2를포함하여 인간에서 리스테리오증의 일반적인 표현을 배제합니다.
L. monocytogenes의 선택된 하위 인구는 최근에 심장 조직8내에서 침략하고 복제하는 향상된 능력을 갖는 것으로 나타났습니다. 심장 참여의 증상은 다양하며 내막염과 복막염에서 부터 전도 이상으로 완성된 충만성 심근염에 이르기까지다양하다. L. monocytogenes 심장 케이스의 전반적인 수는 1 년에 낮습니다 그러나 감염의 이 면이 일반적으로 잘 인식되지 않기 때문에 추정될 수 있습니다. 병원체에 의한 심장의 식민지화는 종종 기존의 용기 손상 또는 인공 심장 판막과 같은 호스트 소인이 필요합니다. 그러나, 어떤 심장 손상 및/또는 이상이 없는 경우에 감염된 동물의 심혼을 식민지화하는 그들의 능력에 대해 주목할 만한 확인된 L. monocytogenes의 격리가있습니다 8.
본명에서 조직 배양뿐만 아니라 살아있는 동물 감염에 침입 적인 소심을 이용하여 감염된 동물 내의 심장 조직의 세균성 식민지화를 평가하기 위한 체외 및 생체 내 방법으로 기재된다. 이러한 방법은 감염된 동물의 심장 조직을 식민지화 할 수있는 잠재력을 가진 균주를 식별하는 데 유용할뿐만 아니라 심장 세포 침입을 강화하고 심장 병리학의 변화를 초래하는 세균 성 유전자 제품의 식별에 유용해야합니다. 이러한 방법은 여러 균주 사이의 심부전의 비교를 용이하게. 여기서 설명된 방법에 대해, L. monocytogenes 10403S는 비심혈성 균주를 잘 연구한 대표자로 사용되며 임상 분리 07PF0776은 심장영양균의 대표적인 예로 사용된다. 이 두 균주는 생체 내에서 감염된 마우스의 심장의 체외 및 식민지에서 심장 세포의 세균성 침입에대한 비교를 제공하기 위해 선택되었다. 분리07PF0776은 HIV+ 환자8에서치명적인 부정맥을 일으킨 간 농양에서 회복된 임상 격리이다. L. monocytogenes 분리그들의 독성 잠재력에 다를 수 있습니다., 그리고 리스테리아 면역 억제와 임산부를 감염 하는 성향을 감안할 때, 이러한 인구 내의 사람들은 다른 임상 격리를 평가 하는 동안 주의 행사 해야.
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Protocol
1. L. 단세포 유전자 균주에 대한 저장 및 문화 조건
- 뇌 심장 주입 한천 (BHI)을 자동화하고 용융 된 미디어를 페트리 플레이트에 부어 고체 미디어를 준비하십시오. 플레이트가 실온에서 하룻밤 동안 건조한 다음 다시 37°C에서 하룻밤을 건조시도록 합니다.
- 멸균 루프를 사용하여 이전에 만든 냉동고 주식(BHI 액체 미디어에서 20% 글리세롤에 매달린 박테리아, -80°C에 저장됨) 또는 이전에 는 콜로니를 함유한 한천판으로부터 L. 단세포유전자의 작은 샘플을 획득하여 이전에 는 격리를 위해 강타하였다.
- 무균 기술을 사용하여 단일 콜로니 격리를 위해 샘플을 줄입니다. 초과 이월을 방지하고 평가되는 균주의 개별 식민지의 격리를 보장하기 위해 크로스 줄무늬 사이의 루프를 소독해야합니다. 플레이트(들)를 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 멸균 루프를 사용하여 14ml 폴리스티렌 튜브에서 분리및 2 ml의 BHI 국물(agar 제외)의 콜로니를 제거합니다.
- 해석 및 감염의 경우, 37°C 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 국물 배양을 정전기(흔들림 없이)로 배양한다. 배양 된 분리물의 스타킹을 위해, 하룻밤 180-200 rpm에서 흔들어 37 °C에서 국물 문화를 배양. 배양은 글리세롤을 최종 농도 20%에 추가하고 밀봉된 튜브를 무기한 -80°C로 저장하여 비축할 수 있다.
2. H9c2 심장 Myoblast 와 같은 세포의 저장 및 배양 조건
- H9c2 세포의 냉동 재고뿐만 아니라 높은 포도당과 피루바트, 태아 소 혈청 (FBS), L-글루타민 (Glut), 페니실린 - 스트렙토마이신 - 글루타민 혼합물 (PSG)을 포함하는 두벨코의 수정 독수리 의 매체 (DMEM)를 구입하거나 얻을 수 있습니다. FBS, 글루트 및 PSG는 -20°C에서 재고해야 하며 DMEM은 4°C로 보관할 수 있습니다. 동결 전에 50ml 원추형 튜브로 FBS를 알리쿼트하는 것이 도움이됩니다.
- 라미나르 플로우 후드에서 FBS의 두 알리쿼트를 해동합니다. DMEM 500ml 병에 알리쿼트 1개를 추가하여 10% FBS/DMEM 혼합물을 만듭니다. 이를 위해, 6 ml의 글루트를 넣고 결과 용액을 4°C로 비축한다. 이 해결책은 "항생제없이 DMEM"이라고 표시 될 수 있습니다. (DMEM –Ab)
- DMEM의 두 번째 500ml 병에, FBS의 나머지 50ml 알리쿼트추가. 이 용액에 PSG 6 ml를 추가하고 4 °C에서 재고를 넣습니다. 이 해결책은 "항생제를 가진 DMEM"이라고 표시될 수 있습니다. (DMEM +Ab)
- 라미나르 후드에 있는 동안, DMEM +Ab 10ml를 제거하고 25ml 조직 배양 플라스크에 놓습니다.
- 플라스크를 라미나르 후드에 두고 액체 질소에 저장하여 H9c2 세포의 냉동 알리쿼트를 제거하고 배양물이 해동될 때까지 튜브를 37°C 수조에 빠르게 배치합니다.
- 튜브를 70% 에탄올로 분사하여 살균한 다음 후드로 돌아갑니다. 집중된 DMSO의 세포 시간을 최소화하기 위해 신속하게 작동하여 DMEM +Ab의 10ml에 세포의 전체 알리쿼트를 추가합니다. 이렇게 하면 DMSO가 하룻밤 세포 생존 가능성과 준수를 위해 충분히 희석됩니다.
- 플라스크를 조직 배양 인큐베이터에 37°C, 5% C02및 95% 습도에 배치합니다.
- 다음 날 아침, 셀 레이어를 확인하여 준수를 확인합니다. 세포는 이 때까지 80-100% 컨서적 일 것입니다.
- 조직 배양 후드에서, 플라스크 내에서 만 세포를 떠나, 진공을 사용하여 플라스크 내에 포함 된 미디어를 제거합니다.
- 약 2 ml의 0.25% 트립신-EDTA를 세포에 넣고 약 3초 동안 부드럽게 흔들어 주세요.
- 트립신 용액이 더 이상 단층과 접촉하지 않는 것을 방지하고 진공으로 트립신을 제거하십시오.
- 두 번째 2 ml의 트립신 알리쿼트를 세포에 추가하고 플라스크를 반전 된 현미경으로 옮기십시오. 단층이 분산되도록 플라스크를 부드럽게 흔들면서 세포를 관찰하십시오.
- 단층이 분산되면 즉시 조직 배양 후드로 돌아가 세포 현탁액에 DMEM +Ab 4 ml를 추가하십시오.
- 세포 현탁액의 2ml 부분을 제거하고, DMEM +Ab. 플라스크 23ml를 포함하는 50ml 조직 배양 플라스크에 부드럽게 플라스크를 넣은 다음, 2.5 단계에 나열된 조건에서 조직 배양 인큐베이터에 놓습니다.
- 약 80%의 합류(ml당 약 2.0-4.0 x 10 5세포)에 도달할 때까지 매일 세포를 확인하십시오. 세포가 너무 혼잡하지 않는 것이 매우 중요합니다, 그들은 시간의 연장 된 기간 동안 FBS의 굶주림 때 골격 근육 근투로 분화 할 수 있기 때문에14 이 분화는 세균성 침략을 변경할 수 있습니다. 세포를 주의 깊게 모니터링하고 배양이 수렴되면 새로운 세포 튜브로 시작합니다.
- 일단 세포가 80% 합류에 도달하면, 그(것)들은 다만 설명한 대로 다른 50 ml 플라스크로 통과될 수 있고, 침략 분석에 대 한 준비.
3. 침략 분석에 대한 H9c2 세포 준비
- 조직 배양 후드에서, 진공 포부를 사용하여 80 %의 합류에 도달 한 H9c2 세포의 50ml 플라스크에서 미디어를 제거합니다.
- 단층층에 0.25% 트립신-EDTA 용액 4ml를 추가하고 진공 포부를 사용하여 즉시 제거하십시오.
- 플라스크에 0.25% 트립신-EDTA의 또 다른 4ml 부분을 추가하고 플라스크를 반전된 현미경으로 이동하여 단층의 분산을 관찰합니다.
- 세포가 분산되면 후드로 돌아가 4 ml의 DMEM –Ab를 세포에 추가하십시오. 용액을 위아래로 파이프팅하면 플라스크 바닥에서 셀을 완전히 제거합니다.
- 모노레이어의 재서스펜션에 따라 모든 서스펜션을 제거하고 50ml 원문 튜브에 놓습니다.
- 이 현탁액의 20ul 부분을 제거하고 혈종계를 사용하여 밀리리터당 세포 수를 계산합니다.
- 용액내의 세포 농도가 결정되면, 신선한 DMEM–Ab에 적절한 셀 용액을 추가하여 농도를 2.25 x 104 세포/ml로 조정한다. 조정된 용액의 총 부피는 25ml여야 합니다.
- 후드에 있는 동안, 90% 에탄올에 담그고 각 커버슬립을 화염을 통해 간략하게 전달하여 유리 커버립을 살균합니다. 각 커버슬립을 살균 후 직접 처리한 24웰 조직 배양소의 개별 웰에 추가합니다.
- 모든 우물에는 개별 커버 슬립이있는 후 25ml 파이프를 사용하여 접시의 각 우물에 희석 된 세포 용액 1 ml을 추가하고 각 커버 슬립을 멸균 바늘로 아래로 밀어 넣습니다.
- 비슷한 양의 세포가 각각 잘 있는지 확인하기 위해 반전 된 현미경을 사용하여 각 우물을 확인하십시오. 조직 배양인 인큐베이터에 24개의 웰 플레이트를 5% CO2 및 95%의 습도로 37°C로 하룻밤 동안 넣습니다.
- 다음 날 아침, 각 우물을 확인하여 커버립이 비슷한 양의 밀집 성술을 가지고 있고 커버립이 우물에 떠 있지 않도록 합니다.
4. 침공 분석에 대한 L. 단세포 유전자의 균주 준비
참고: 모든 실험실 작업은 CDC 생물 안전 수준 2 지침에 따라 수행됩니다.
- 분석용 24웰 플레이트를 준비한 후, 살균 루프를 사용하여 세균 침입을 검사하는 균주의 단일 식민지를 제거하고 BHI 국물 2ml를 포함하는 개별 14ml 튜브로 각각 접종한다.
- 접종된 튜브를 45°로 기울어진 37°C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 사이에 정적(흔들리지 않고) 배양합니다.
- 다음 날 아침, 박테리아의 균일한 현탁액을 보장하기 위해 배양 튜브를 인큐베이터와 소용돌이에서 간단히 제거합니다.
- 600nm 파장에서 분광계를 사용하여 배양의 광학 밀도를 측정합니다. 광학 밀도를 읽기 전에 멸균 BHI 국물을 사용하여 분광계를 0으로 설정하십시오.
- L. monocytogenes의경우, 광학 밀도는 ml당 박테리아의 농도와 직접적으로 관련이 있으며, 이러한 밀도는 ml당 1.000 = 1.0 x 109 CFU의 밀도이다.
- 2.25 x 104 셀을 2.25 x 106(MOI = 100)으로 감염하는 데 필요한 배양량을 계산합니다.
- 필요한 배양량을 제거하고 1.5ml 원심분리기 튜브에 놓습니다.
- 문화를 19,000 x g에서 3분 동안 회전한 다음 상퍼를 폐기합니다. 튜브의 입술에 붙어 과잉 미디어를 제거하기 위해 종이 타월에 대한 튜브의 열린 끝을 누릅니다.
- 세균을 멸균 PBS 1 ml, 소용돌이로 재봉하여 충분한 혼합을 보장합니다. 이 혼합물은 20 ul (1.125 x 108 CFU / ml)당 약 2.25 x 106 CFU를 포함해야합니다.
5. 침공 분석 수행
- 침공 분석 전날, 섹션 3에 설명된 바와 같이 H9c2 세포의 24웰 플레이트를 준비하고, 또한 섹션4에 설명된 바와 같이 리스테리아의 원하는 균주와 멸균 BHI 국물을 접종한다.
- 섹션 4의 프로토콜을 사용하여 침략에 대해 평가할 균주의 PBS 재일시 된 문화를 준비하십시오. 참고: 전염성 티터는 각 샘플의 희석을 고체 미디어에 도금하고 하룻밤 잠복 후 식민지를 열거하여 이 시점에서 평가할 수 있습니다.
- PBS 박테리아 용액의 적어도 20ul을 24웰 플레이트의 개별 우물에 적재합니다. 트리플리케이트의 결과를 얻기 위해서는 각 변형에 대해 최소 3개의 개별 우물이 필요하므로 최대 8개의 균주를 동시에 평가할 수 있습니다.
- 박테리아와 우물을 적재한 후, 플레이트를 부드럽게 흔들어 각 시료의 균질확산을 장려하고, 24웰 플레이트를 인큐베이터에 37°C, 습도 가 95% 5%CO2로다시 배치한다.
- 이 인큐베이션 동안 DMEM – Ab (섹션 2)의 알리쿼트(섹션 2)를 단순히 DMEM –Ab 25ml를 제거하고 50ml 팔콘 튜브(또는 동등한)에 배치하여 준비합니다.
- 겐타미신을 25ml DMEM –Ab 알리쿼트에 15 ug/ml(50 mg/ml 스톡 솔루션7.5ul)에 추가합니다. DMEM –Ab +Gent 용액을 37°C 수조에 배치하여 45분 동안 배양합니다.
- 50ml 팔콘 튜브에 PBS의 알리 쿼트 25 ml와 45 분 배양 동안 37 °C 수조에 배치.
- 45분 인큐베이션이 완료되면 24웰 플레이트를 제거하고 후드에 놓습니다. 진공 포부로 각 우물에서 박테리아가 함유 된 미디어를 제거하여 다른 균주 사이의 유리 파이프 팁을 변경합니다.
- 세포의 표면에서 느슨하게 부착 된 박테리아를 세척하기 위해 각 우물에 PBS의 약 1 ml를 추가 한 다음 진공 포부를 사용하여 PBS를 제거하십시오.
- PBS를 완전히 제거한 후 DMEM -Ab +Gent를 각 웰에 1 ml를 추가합니다. 젠타미신은 세포 외부에 남아있는 박테리아만 죽일 것이고, 따라서 세포 내 박테리아는 실행 가능한 상태로 유지됩니다.
- 24웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 추가 시간 동안 배양할 수 있습니다.
- 1시간 동안 의복식 동안 각 튜브에 멸균 ddH20 1ml를 추가하여 폴리 프로필렌 튜브 14ml를 준비하십시오. 각 커버슬립에 튜브 1개가 필요하므로 24웰 플레이트 1개에 총 24개의 튜브를 준비합니다.
- 1시간 길이의 인큐베이션에 따라 인큐베이터에서 24웰 플레이트를 제거하고 후드에 놓고 5.12 단계에서 제조된 튜브와 함께 배치합니다.
- 멸균 핀셋을 사용하여 각 커버슬립을 각각의 우물에서 제거하고 개별 튜브에 즉시 배치합니다. 에탄올에 핀셋을 담그고 오염을 방지하기 위해 각 커버슬립 사이에 화염을 피하십시오.
- 모든 커버립을 제거하고 개별 튜브에 넣은 후 24웰 플레이트를 폐기하십시오.
- 벤치로 돌아가 서 5-10 초 동안 각 튜브를 소용돌이.
- 각 튜브에서 일부를 제거하고 각 샘플을 96웰 플레이트의 개별 우물에 배치한 다음 1:10 희석제를 사용하여 각 샘플을 1:1,000 희석까지 연속적으로 희석시 합니다.
- 예온 및 건조 LB 플레이트를 사용하여 각 희석 계열을 한천 판에 반점하십시오. 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 샘플의 희석 계열에서 5-10 μl 반점을 플레이트할 수 있습니다.
- 또한 희석되지 않은 각 에서 20 μl 샘플을 제거하고 희석 계열에서 별도의 플레이트에 LB 한천에 직접 이 양을 반점 플레이트. (이 더 큰 부피는 제대로 침략적인 균주를 열거하는 데 사용할 수 있습니다).
- 모든 샘플이 스팟 도금된 후 커버립을 포함하는 14ml 튜브를 폐기하십시오. 파라필름 96 웰 플레이트는 필요한 경우 - 80 °C의 냉동고 상자에 넣습니다.
- 반점이 완전히 건조되도록 하십시오. 이 과정은 접시를 후드에 놓고 뚜껑을 제거하여 크게 서두르게됩니다.
- 반점이 말린 후 플레이트를 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.
- 다음 날 아침, 콜로니 숫자를 쉽게 평가할 수 있는 희석 시리즈의 각 지점에서 콜로니수를 계산하고(약 5~50개의 콜로니 사이)(그림1)및 계열을 사용하여 각 변형에 대해 커버슬립당 세균의 수를 계산한다.
6. 마우스 감염을 위한 L. 단세포 유전자의 긴장 준비
- 감염 전날 밤, 살균 루프를 사용하여 원하는 균주의 단일 식민지를 제거하고 BHI 국물 2 ml를 포함하는 개별 14ml 튜브로 각각 접종하십시오.
- 접종된 튜브를 45°로 기울어진 37°C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 사이에 정적(흔들리지 않고) 배양합니다.
- 다음 날 아침, 박테리아의 균일한 현탁액을 보장하기 위해 배양 튜브를 인큐베이터및 소용돌이로부터 간단히 제거합니다.
- 600nm 파장에서 분광계를 사용하여 배양의 광학 밀도를 측정합니다. 광학 밀도를 읽기 전에 멸균 BHI 국물을 사용하여 분광계를 0으로 설정하십시오. (L. monocytogenes의경우, 광학 밀도는 ml당 박테리아의 농도와 직접적으로 관련이 있으며, 이러한 밀도는 ml당 1.000 = 1.0 x 109 CFU의 밀도)
- 각 동물을 감염하는 데 필요한 배양의 양을 계산합니다. 주사는 일반적으로 5.00 x 104 CFU/ml의 원하는 농도로 변환 개별 변형의 10,000 CFU와 PBS의 200 μl을 포함한다.
- 각 최종 희석의 5 μl 알리쿼트를 제거하고 LB 한천에 직접 스퍼플레이트를 퍼놓습니다. 접종에 사용되는 농도를 확인하기 위해 37 °C에서 하룻밤 을 배양한다.
- 희석의 1 시간 이내에 각 CFU 서스펜션을 주입 (아래 참조).
7. L. 단세포 유전자를 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스로 접종하고 간, 비장 및 심장 내세균의 부담을 평가합니다.
참고: 모든 동물 작업은 CDC 생물 안전 수준 2 지침에 따라 수행됩니다. 마우스는 일반적으로 1 주일 전에 주문하고 케이지 당 5 마리의 동물과 함께 갇혀 있습니다. 마우스는 주입 4 일 전에 새로운 실험실 환경에 적응할 수 있습니다. 이 실험은 장벽 환경에 있는 케이지에 5를 보관하고 비 제한적인 규정식을 공급한 6-8 주 된 여자 스위스-웹스터 마우스를 이용했습니다.
- 뚜껑과 음식/물통을 제거하고 케이지를 열램프 아래에 5분간 배치하여 한 번에 한 마리의 마우스 케이지를 준비합니다. 이 과정은 꼬리 정맥이 팽창 할 수 있습니다, 주사를 수행하기 쉽게 만들기.
- 한 동물을 제거하고 주입 하는 동안 동물을 억제 하기 위해 하네스 (또는 끝이 잘라 매 튜브)에 배치합니다.
- 알코올 패드를 사용하여 주사 부위를 청소하고 알코올이 증발할 수 있도록 합니다. 이것은 사이트를 정화 할뿐만 아니라 꼬리 정맥을 더 넓히게합니다.
- 27.5 게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기를 사용하여 원하는 배양물의 200 μl을 사용하여 마우스를 꼬리 정맥에 부드럽게 주입합니다.
- 거즈를 사용하여 주사로 인해 발생할 수있는 출혈을 멈추고 동물을 신선한 케이지에 놓습니다.
- 나머지 동물과 균주에 대한이 과정을 반복합니다. 동물의 각 케이지에 필요한 균주와 라벨을 부착해야 합니다.
- 매일 동물을 확인하고, 병에 걸린 것처럼 보이는 동물을 제거하고 희생하십시오. 동물이 질병의 징후를 보이지 않는 경우, 모든 동물을 희생하기 전에 감염이 72 시간 동안 진행되도록하십시오.
- 희생하려면 모든 호흡이 멈출 때까지 병에 든 소스에서 CO2 마취를 사용한 다음 자궁 경부 탈구를 사용하여 동물이 죽었는지 확인하십시오.
- 희생 후, 해부를 위한 조직 배양 후드로 동물을 옮기다.
- 해부 블록을 사용하여 동물의 각 다리를 큰 게이지 바늘로 고정하고 포화 될 때까지 70 %의 에탄올로 동물을 분사하십시오.
- 복부와 흉부의 피부를 다시 잘라 내고 질 개회에서 xiphoid 과정까지 확장되는 Y 자형 절개를 사용하여 각 팔의 차실라까지 진행합니다.
- 피부를 뒤로 당기고 각 다리에서 바늘을 제거하여 해부를 열어 두습니다.
- 복막을 부드럽게 자르고 내장, 위, 간 및 비장을 노출시십시오.
- 먼저 간 상단에 간 정맥과 관상 인대를 절단하여 간을 제거하기 시작합니다. 제거 할 추가 인대는 간 아래에서 발견되며, 소장의 첫 번째 섹션뿐만 아니라 뒤쪽의 근육에 연결합니다.
- 간을 멸균 ddH20 5ml에 50ml 의 매 튜브에 놓습니다.
- 다음으로 비장을 분리하고 혈관과 인대를 부드럽게 절단하여 비장을 제거합니다. 비장간보다 더 쉽게 제거됩니다. 비장을 5ml 멸균 ddH20이 들어 있는 별도의 매 관에 놓습니다.
- 흉막을 시각화하기 위해 다이어프램을 찾아 흉곽을 따라 부드럽게 자른다. 흉부를 열고 심장과 폐를 노출시키기 위해 시포이드 과정과 흉골을 목 수준으로 잘라냅니다.
- 집게를 사용하여 정점에 의해 부드럽게 심장을 잡고 대동맥과 폐 용기가 장력에 있는 것처럼 들어 올립니다. 이 혈관을 잘라 서 심장을 해방.
- 심장을 멸균 ddH20 5 ml가 들어 있는 50ml 팔콘 튜브에 넣습니다.
- 마우스 시체를 버리고 제거된 각 기관에 대해 5ml의 멸균 ddH20이 포함된 깨끗한 매 관을 사용하여 모든 동물에 대해 이 과정을 반복합니다.
- 모든 장기가 제거된 후 워크스테이션을 청소하고 벤치로 돌아갑니다.
- 5마리의마우스(예: 5마리의 쥐를 위한 5개의 튜브 세트, 5개의 비장용 튜브 5개, 하트 5개)에서 각 장기 세트에 대해 균질화제를 세척하고 살균하는 데 사용할 5개의 튜브 세트를 준비한다. 각 튜브 의 4 개는 30ml 멸균 ddH20으로 채워져야하며, 하나는 30ml 90 % EtOH로 채워야합니다.
- 티슈마스터(또는 이에 상응하는 균질제)를 사용하여, 프로브를 청소하기 위해 다음과 같이 7.21 단계에서 제조된 균질화제(실행 중)를 튜브에 담급니다.
- 튜브 1 (ddH2O)
튜브 2 에서 5 초 (ddH2O)
튜브 3에서 5 초 (EtOH)
튜브 4에서 5 초 (ddH2O)
튜브 5에서 5 초 (ddH2O) - 적어도 2 분 동안 균질화를 사용하여 하나의 간을 균질화, 또는 장기의 눈에 보이는 부분이 남아있을 때까지. 핀셋을 사용하여 프로브에서 큰 이물질을 제거합니다.
- 7.22 단계에서 설명된 세척 과정을 반복하십시오.
- 다른 간을 위한 균질화 과정을 반복하여 7.22 단계에서 설명된 과정을 사용하여 각 간 사이의 프로브를 세척하십시오.
- 모든 간이 완전히 균질화 된 후 간 세척 튜브 (1-5)를 폐기하십시오.
- 비장과 하트 모두에 대한 균질화 / 깨끗한 과정을 반복하여 각 장기 시리즈에 대한 새로운 세척 튜브 세트를 사용하십시오. 어떤 시점에서 세척 튜브가 탁탁이되면, 그들을 버리고 시리즈를 완료하는 새로운 튜브로 교체.
- 모든 장기가 균질화 된 후, 균질화에 마지막 청소 주기를하고 저장을 위해 잘 건조.
- 각 기관의 약 200 μl을 96웰 플레이트의 개별 우물에 넣습니다.
- 1:10,000 희석(간 및 비장) 또는 최대 1:1,000 희석(심장)까지 연속으로 1:10을 희석하여 장기 샘플에 직렬 희석을 수행합니다.
- 현물 플레이트는 희석 시리즈를 미리 데운 LB 한천에 놓습니다. 또한 제대로 식민지화 된 장기에서 CFU를 열거하기 위해 각 희석되지 않은 장기와 접시의 20 ul을 별도의 LB 한천 판에 제거하십시오.
- 균질화된 장기를 함유한 매관을 버리고, 희석 계열을 포함하는 96웰 플레이트를 파라필름으로 감싸고 -80°C의 냉동고 상자에 넣습니다.
- 반점이 건조하도록 허용하십시오. 이 과정은 접시를 후드에 놓고 뚜껑을 제거하여 빠를 수 있습니다.
- 반점이 말린 후 플레이트를 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.
- 다음 날 아침 각 지점에서 콜로니 수를 계산하고 희석 계열을 사용하여 기관당 총 박테리아 수를 계산합니다.
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Representative Results
L. monocytogenes의 선택된 분리는 세포 배양및 감염의 마우스 모형에서 심장 세포의 강화한 침략을 전시합니다. 도 1은 한천 매체에서 현탁액의 현탁액을 반점 도금 한 다음 세균성 식민지가 어떻게 나타날 수 있는지를 보여주는 예입니다. 이 방법을 사용하면 많은 수의 천 미디어 플레이트를 사용하지 않고 샘플 내에서 CFO를 정확하게 평가할 수 있습니다. 도 2는 긴장07PF0776의 심장 세포를 침범하는 균주 10403S의 능력을 비교하는 조직 배양 기반 분석의 예를 나타낸다. 10403S에 감염된 세포에 비해 젠타미신 치료에 따른 감염된 H9c2 심장 세포로부터 2배 이상 많은 07PF0776세균CFU를 회수할 수 있다. 2 ~ 4 배의 차이는 이 분석기를 사용하여 심장 tropic 긴장에 대해 일상적으로 관찰됩니다. 도 3은 감염 후 3일 동안 간, 비장 및 감염된 마우스의 심장으로부터 박테리아가 회복된 예를 나타낸다. 심폐소생균 07PF0776 또는 균주 10403S를 가진 마우스의 감염은 감염된 마우스의 간과 비장에서 회수된 박테리아의 비교 수에 기인합니다, 그러나 07PF0776에 감염된 마우스는 심혼에서 박테리아의 검출 가능한 수를 산출하고 이 기관에 있는 더 중대한 세균 부담을 전시하기 위하여 확률이 높습니다.
그림 1: 세균성 CfU를 결정하기 위한 스팟 도금 기술의 예. H9c2 세포는 유리 커버립에서 재배되고 L. monocytogenes에 감염된 용액은 lysed되었고 현탁액은 1:10 희석액까지 1:10 희석(왼쪽 패널)을 사용하여 연속적으로 희석되었다. 멀티채널 파이펫은 LB 한천판에 직접 각각 10ul을 배관하는 데 사용되었고, 플레이트는 37°C(오른쪽 패널)에서 하룻밤 사이에 배양되었다. 커버슬립당 박테리아의 수는 적절한 희석과 관련된 세균성 CFU를 계산하여 평가된다.
도 2: L. 단세포유전자 균주 07PF0776은 조직 배양에서 심장 세포의 강화된 침입을 나타낸다. 침략 적 세약은 MOI = 100을 사용하여 H9c2 세포에서 수행되었다. 그래프는 10403S(블랙)에 감염된 세포로부터 회복된 세포내 세균성 CFU의 평균 수와 심폐소생섭 07PF0776 균주(파란색)를 묘사합니다. ** p <0.01의 중요성을 나타냅니다.
도 3: L. 단세포유전자 균주 07PF0776마우스 감염 모델에서 심장의 강화된 침입을 나타낸다. 동물은 꼬리 정맥을 통해 10,000 CFU로 접종되었다. 감염은 72 시간 동안 진행될 수 있었고, 이 시점에서 동물이 희생되고 간, 비장 및 심혼이 수집되어 기관당 세균CFU를 결정하도록 처리되었습니다. 솔리드 원은 개별 마우스로부터 얻은 CFU를 나타내며, 선 +/-SE로 표시된 그룹 내의 모든 동물에 대한 평균 값입니다. 백분율 값은 심장 내의 검출 가능한 세균성 CFU를 포함하는 동물의 수를 나타냅니다. * p <0.05의 중요성을 나타냅니다.
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Discussion
L. 단세포 유전자는 광범위하고 잘 특징인 인간 병원체, 다른 질병 표현의 다수를 일으키는 원인이 될 수 있는15. 박테리아는 이전에 중앙 신경계에 도달하고 식민지화하고 태아를 개발하기 위하여 혈액 두뇌 장벽 및 태반 태아 장벽과 같은 장벽을 가로질러 배분하는 기능에 대해 설명되었습니다. 이 조직을 식민지화하는 유기체의 생체 내 능력은 종종 표적 장기를 구성하는 배양에서 대표 세포를 침입하는 체외 능력에 의해 보완됩니다. 예를 들어, 코로이드 신경총에서 상피 세포의 침입은 CNS16을식민지화하는 유기체의 능력과 연관되어 있다; 그리고 사악한 열대 성소 이출은 모계 태아 장벽(17)을나타내는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜에서, 방법은 간 및 비장의 식민지화에 비해 개별 격리에 대한 심장의 세균 성 식민지화의 비교뿐만 아니라 배양에서 심장 세포의 세균 적 침입을 평가하는 데 유용하다고 설명되었다.
이 프로토콜은 중요한 단계의 수를 포함합니다, 그러나 가장 중요한 중커버기에서 성장한 조직 배양 세포의 감염 또는 동물의 감염에 대한 정확한 세균성 CFU의 사용을 관련시키는 그입니다. 세균성 CFU 번호가 다른 우물과 동물 사이에서 올바르게 제어되지 않으면 샘플 간의 직접 비교를 할 수 없습니다. 세균CFU 번호가 정확하게 추정되었음을 보장하기 위해 미디어 플레이트에 최종 희석제를 직접 도금하여 접종을 생성하는 데 사용되는 희석 계열을 다시 확인하는 것이 중요하다.
이러한 애사에 사용된 H9c2 세포는 주로 심실조직(18)을포함하는 13일 배아 쥐 심장의 하반부로부터 유래된다. 세포는 단핵근세포로 전파되고 조직 배양 플라스크 또는 접시에 합류하게 되면 다핵관 구조를 형성하기 시작합니다. 세포는 약 30 시간18의생성 시간을 갖는다. H9c2 세포의 혈청 기아는 골격 근육 세포로 세포의 분화와 관련이 있는 반면, 10nM올-트랜스 망막산을 가진 myoblasts의 치료는 심장 근세포로의 myoblast 분화와 연관되어 있다14. 이 프로토콜은 L. monocytogenes myoblast 세포 침략에 초점을 맞추었지 만, H9c2 세포주는 세균성 침략에 대한 통제된 세포 분화의 효력을 조사하기 위하여 이용될 수 있던 다목적 세포주입니다.
L. monocytogenes 균주 07PF0776은 원래 심장8의침습적인 L. 단세포 유전자 감염으로 인한 비 침습성 염수 검정증을 가진 HIV 감염 환자로부터 분리되었다. 마우스 감염 모형에 있는 이 긴장의 후속 분석은 심장 조직을 표적으로 하고 침략하는 향상된 수용량을 가졌다는 것을 표시했습니다. L. monocytogeness의 추가 무작위 분리의 제한된 분석은 세균 분리의 하위 인구가 심장 조직 또는 심장 판막에 어떤 이전 손상의 부재에 마우스의 심혼을 감염시킬 수 있다는 것을 건의합니다8. 흥미롭게도, 최고의 특징인 L. monocytogenes 균주, 10403S 및 EGD의 두 가지는 심장 세포와 조직의 가난한 식민지인 것으로 나타났습니다. 07PF0776 분리의 게놈 염기서열분석은 새로운 병원성 섬의 존재를 밝히지 않았거나 독특한 유전자클러스터(19)의증거를 제공하지 않았다. 이것은 07PF0776이 독성 유전자 제품의 기존 무기고의 수정을 통해 침략을 위한 심장 세포를 표적으로 한다는 것을 건의합니다. 예비 조직화학 적 분석은 07PF0776이 원래 감염된 인간 환자 내에서 관찰 된 농양과 유사한 것으로 나타나는 감염된 마우스 심장 내의 농양을 형성한다는 것을 나타냅니다 (데이터는 표시되지 않음). 다른 심근L. 단세포 유전자 분리 유사한 심장 농양 형성을 유도 하는지 여부는 결정 될 남아.
여기에 제시된 소약은 감염의 다른 양상의 검사를 용이하게 하기 위하여 쉽게 수정될 수 있습니다. 개별 커버립은 빛 또는 형광계 현미경 검사법을 위해 고정및 염색될 수 있고, 조직 배양 배양 시간은 박테리아 세포내 성장속도의 측정 및 비교를 위해 증가할 수 있고, 조직 및 기관은 세포 수준에서 농양 형성 및 세균 분포를 검사하기 위하여 현미경 검사를 위해 파라핀 내장 및 처리될 수 있다. 조직 배양 세포의 세균 성 침략 의 수준을 평가하거나 호스트 조직의 식민지, 각 분석이 감지 할 수있는 박테리아의 최소 금액의 측면에서 제한이 있다. 시험관 내 침입 은 커버 슬립 당 약 300 CFU의 검출의 낮은 한계를 가지고있다. 커버립을 소용돌이에 사용하는 물의 양을 조정하면 낮은 수의 박테리아의 검출을 향상시킬 수 있으며, 셀 용액부수는 500 μl로 낮게 조절되지 않는 균주를 검출하는 데 유용합니다. 커버립은 소량의 숙주 세포의 리시스 이전에 과도한 젠타미신을 제거하기 위해 멸균 물에 잠깐 담근 수 있습니다. 최대 5ml 이하의 체적 레벨을 사용하여 매우 침습적인 균주를 적절하게 열거할 수 있습니다. 동물에서 장기 균질화는 5ml 또는 ddH20의 10 ml의 부피에서 생성될 수 있으며, 낮은 부피로 박테리아의 낮은 수준을 감지하는 데 유용하고, 더 높은 부피가 있어 식민지화된 장기를 더 잘 열거할 수 있습니다. 감염된 장기에 대한 최소 검출 범위는 약 100 CFU입니다. 장기가 지속적으로 높은 수준에서 식민지인 경우, 더 큰 양의 물(10 ml)을 사용하고 96웰 플레이트 내에서 더 많은 희석을 수행하는 것이 좋습니다.
설명된 방법은 심장 의 외부 장기 및 조직에 적용될 수 있습니다. 이러한 침입 검사 및 마우스 감염태 반을 포함 하 여 사이트의 다수에서 식민지를 평가 하는 데 사용 되었습니다., 두뇌, 담낭, 간, 그리고 창 자. 전술한 프로토콜의 수정은 또한 초침습 및/또는 초악성 균주를 수용하기 위하여 이루어질 수 있고, 다른 세포 모형을 가진 심장 세포의 대체는 심장 혈관 시스템의 외부 사이트에 침입 표현형을 평가하기 위하여 행해질 수 있다. 상이한 세포 유형이 L. monocytogenes 침공에 대한 감수성을 변경했기 때문에, 분석에서 데이터를 정확하게 복구하기 위해서는 MOI 및 잠복기와 같은 매개 변수를 조정하는 것이 필요할 수 있다.
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Disclosures
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 보고하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 공중 보건 서비스 보조금 AI41816 및 AI099339 (N.E.F.) 및 NiAID의 F31AI094886-01 (P.D.M)에 의해 지원되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 자금 출처의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco | BHI Broth Base | 237200 | 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar) |
| Difco | Agar | 214510 | 2 kg of Granulated Agar |
| Difco | BHI Agar | 241810 | 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar |
| in vitrogen | LB Broth Base | 12975-084 | 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar) |
| Fisher | Glass Coverslips | 12-545-80 | 12 mm glass coverslips |
| Falcon | 24-well Tissue Culture Plate | 35-3047 | 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate |
| Falcon | 14mL Polystyrene tube | 352051 | 14 ml Polystyrene tubes |
| Falcon | 96-well U-bottom plate | 35-3077 | Non-tissue culture treated 96-well plate |
| Corning | 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture |
| Corning | DMEM (High glucose, high pyruvate) | 15-013-CU | DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics |
| Corning | Pen/Strep/Glut Solution | 30-009-CI | Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture |
| Corning | Gentamicin | 30-005-CR | 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture |
| Cellgro (Corning) | L-Glutamine | 25005197 | Stock L-glutamine solution without antibiotics |
| Denville | 75cm^2 Flask | T1225 | 75 cm2 tissue culture treated flask |
| Denville | 1.5mL microcentrifuge tubes | 2013004 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| ATCC | H9c2 Cardiac Myoblasts | CRL-1446 | Rat cardiac myoblasts |
| Hyclone | Fetal Bovine Serum | SH30070.63 | Fetal Bovine Serum |
References
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