Summary
Listeria monocytogenes forårsaker fosterinfeksjoner hos gravide kvinner og meningitt i utsatte populasjoner. Subpopulasjoner av bakterier kan kolonisere hjertevev, forårsaker myokarditt hos pasienter og laboratoriedyr. Her presenterer vi en protokoll som beskriver hvordan man vurderer L. monocytogenes hjertecelleinvasjon in vitro og hjertekolonisering hos smittede dyr.
Abstract
Listeria monocytogenes er et Gram-positivt fakultets intracellulært patogen som er i stand til å forårsake alvorlige invasive infeksjoner hos immunkompromitterte pasienter, eldre og gravide kvinner. De vanligste manifestasjonene av listeriose hos mennesker inkluderer meningitt, encefalitt og fosterabort. En betydelig, men mye mindre dokumentert oppfølger av invasiv L. monocytogenes infeksjon involverer hjertet. Dødsraten fra hjertesykdom kan være opptil 35% til tross for behandling, men svært lite er kjent angående L. monocytogenes kolonisering av hjertevev og dets resulterende patologier. I tillegg har det nylig blitt tydelig at subpopulations av L. monocytogenes har en forbedret kapasitet til å invadere og vokse innen hjertevev. Denne protokollen beskriver i detalj in vitro- og in vivo-metoder som kan brukes til å vurdere kardiotropisme av L. monocytogenes isolerer. Metoder presenteres for infeksjon av H9c2 rotte hjerte myoblaster i vevskultur samt for bestemmelse av bakteriell kolonisering av hjertene til infiserte mus. Disse metodene er nyttige ikke bare for å identifisere stammer med potensial til å kolonisere hjertevev hos infiserte dyr, men kan også lette identifisering av bakterielle genprodukter som tjener til å forbedre hjertecelleinvasjon og / eller drive endringer i hjertepatologi. Disse metodene sørger også for direkte sammenligning av kardiotropisme mellom flere L. monocytogenes stammer.
Introduction
Listeria monocytogenes er et Gram-positivt intracellulært patogen som er i stand til å forårsake alvorlig sykdom i utsatte populasjoner, inkludert eldre, gravide kvinner, personer med HIV / AIDS og personer som mottar kjemoterapi1. Infeksjon i disse populasjonene er ofte et resultat av inntak av forurensede matvarer, og de fleste infeksjoner er forbundet med store matbårne utbrudd2,3. Hos mennesker og andre pattedyr er L. monocytogenes i stand til å translokalisere over tynntarmens epitelgrense, og deretter transporteres til leveren4,5. Dyremodeller antyder at inntatte bakterier replikerer i tarm villi og transitt til leveren gjennom portalvenen eller sprer seg via de mesenteriske lymfeknuter inn i blodstrømmen, noe som fører til hematogen formidling til leveren og milt6,7. I leveren og milten er bakterien i stand til å formidle opptak til både profesjonelle fagocytter så vel som bosatte parenchymale celler, og etablerer raskt infeksjoner i disse organene. Etter hvert som bakteriebelastningen øker, spres mange bakterier tilbake i blodet, hvor de er i stand til å kolonisere mottakelige vev ytterligere, inkludert sentralnervesystemet og morkaken (hvor de er til stede). Kolonisering av disse stedene utelukker de vanligste manifestasjonene av listeriose hos mennesker, inkludert meningitt, encefalitt og foster abort2.
Utvalgte subpopulations av L. monocytogenes har nylig vist seg å ha en forbedret kapasitet til å invadere og replikere innenfor hjertevev8. Manifestasjoner av hjerteinvolvering er varierte, og spenner fra endokarditt og perikarditt, til fulminant myokarditt komplett med ledningsavvik9-13. Det totale antallet L. monocytogenes hjertetilfeller per år er lavt, men kan være undervurdert, da denne fasetten av infeksjon generelt ikke er godt anerkjent. Kolonisering av hjertet av patogener krever ofte vertdisposisjoner som eksisterende valvulær skade eller kunstige hjerteklaffer. Det er imidlertid isolerer av L. monocytogenes som er identifisert som er kjent for deres evne til å kolonisere hjertene til infiserte dyr i fravær av hjerteskader og / eller abnormiteter8.
Her er beskrevet in vitro og in vivo metoder for å vurdere bakteriell kolonisering av hjertevev i infiserte dyr ved hjelp av invasjonsanalyser i vevskultur samt levende dyreinfeksjoner. Disse metodene har vist seg nyttige i ikke bare for å identifisere stammer med potensial til å kolonisere hjertevev hos infiserte dyr, men bør også være nyttige for identifisering av bakterielle genprodukter som tjener til å forbedre hjertecelleinvasjon og / eller resultere i endringer i hjertepatologi. Disse metodene letter sammenligningen av kardiotropisme mellom flere stammer. For metodene beskrevet her, L. monocytogenes 10403S brukes som en godt studert representant for en ikke-kardiotropisk stamme og den kliniske isolasjonen 07PF0776 brukes som et representativt eksempel på en kardiotropisk stamme. Disse to stammene ble valgt for å gi en sammenligning for bakteriell invasjon av hjerteceller in vitro og kolonisering av hjerter av infiserte mus in vivo. Den isolerende 07PF0776 er en klinisk isolerende gjenopprettet fra en interventricular abscess som forårsaket en dødelig arytmi hos en HIV + pasient8. L. monocytogenes isolerer kan variere i deres virulenspotensial, og gitt tilbøyelighet til listeria til å infisere personer med immunsuppresjon og gravide kvinner, bør personer i disse populasjonene utvise forsiktighet mens de vurderer ulike kliniske isolasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lagrings- og kulturforhold for L. monocytogenes stammer
- Forbered faste medier ved å autoklavere hjernehjerteinfusjonsagar (BHI) og hell det smeltede mediet i petriske plater. La platene tørke over natten ved romtemperatur, deretter over natten igjen ved 37 °C.
- Bruk en steril sløyfe, få en liten prøve av L. monocytogenes fra enten tidligere laget frysebestander (bakterier suspendert i 20% glyserol i BHI flytende medier, lagret ved -80 °C) eller fra en agarplate som inneholder kolonier som tidligere ble rammet for isolasjon.
- Bruk aseptisk teknikk til å strekke prøven for isolasjon av enkeltkolonier. Pass på å sterilisere sløyfen mellom kryssstriper for å forhindre overflødig overføring og sikre isolering av individuelle kolonier av stammen som vurderes. Inkuber platen(e) over natten ved 37 °C.
- Bruk en steril sløyfe, fjern en koloni av isolasjonen og inokuler 2 ml BHI buljong (uten agar) i et 14 ml polystyrenrør.
- For analyser og infeksjoner, inkuber kjøttkraftkulturen statisk (uten risting) over natten i en 37 °C inkubator. For strømpe av dyrkede isolasjoner, inkuber kjøttkraftkulturen ved 37 °C med risting ved 180-200 o/min over natten. Kulturer kan lagres ved å legge glyserol til en endelig konsentrasjon på 20% og lagre forseglede rør ved -80 °C på ubestemt tid.
2. Lagrings- og culturing forhold til H9c2 Cardiac Myoblast-lignende celler
- Kjøp eller få et frossent lager av H9c2-celler, samt Dubelcos Modified Eagle's Medium (DMEM) som inneholder høy glukose og pyruvat, Fetal Bovine Serum (FBS), L-glutamin (Glut) og en Penicillin-Streptomycin-Glutamine blandinger (PSG). FBS, Glut og PSG skal lagres ved -20 °C, mens DMEM kan oppbevares ved 4 °C. Det er nyttig å aliquot FBS i 50 ml koniske rør før frysing.
- I en laminær strømningshette, tin to aliquots av FBS. Tilsett en aliquot til en 500 ml flaske DMEM, noe som gjør en 10% FBS / DMEM blanding. Til dette, tilsett 6 ml glut og lager den resulterende løsningen ved 4 °C. Denne løsningen kan merkes "DMEM uten antibiotika." (DMEM –Ab)
- Til en andre 500 ml flaske DMEM, tilsett de andre 50 ml aliquot av FBS. Til denne løsningen, tilsett 6 ml PSG og lager ved 4 °C. Denne løsningen kan merkes "DMEM med antibiotika." (DMEM +Ab)
- Mens du er i laminær hetten, fjern 10 ml DMEM +Ab og legg i en 25 ml vevskulturflaske.
- La kolben stå i laminær hetten, fjern et frossent aliquot av H9c2-celler fra lagring i flytende nitrogen og legg raskt røret i et 37 ° C vannbad til kulturen har tint.
- Spray røret med 70% etanol for å desinfisere, og gå deretter tilbake til hetten. Arbeide raskt for å minimere celletid i konsentrert DMSO, legge til full aliquot av celler til 10 ml DMEM +Ab. Dette fortynner DMSO tilstrekkelig for nattcelle levedyktighet og overholdelse.
- Plasser kolben i en vevskulturinkubator ved 37 °C, 5 % C02og 95 % fuktighet over natten.
- Neste morgen, sjekk cellelaget for å sikre overholdelse. Celler vil sannsynligvis være mellom 80-100% sammenløp innen denne tiden.
- I vevskulturhetten fjerner du mediet som finnes i kolben ved hjelp av vakuumet, slik at bare cellene i kolben blir igjen.
- Tilsett ca. 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA i cellene og berg forsiktig i ca. 3 sek.
- Snu kolben slik at trypsinoppløsningen ikke lenger er i kontakt med monolayeren, og fjern trypsin ved vakuum.
- Tilsett en annen 2 ml aliquot trypsin til cellene, og flytt kolben til et invertert mikroskop. Vær oppmerksom på cellene mens du forsiktig gynger kolben for å sikre at monolayeren sprer seg.
- Når monolayeren er spredt, gå umiddelbart tilbake til vevskulturhetten og tilsett 4 ml DMEM + Ab til cellefjæringen.
- Fjern en 2 ml del av cellesuspensjonen, og legg den til en 50 ml vevskulturflaske som inneholder 23 ml DMEM +Ab. Rock kolben forsiktig, og legg den deretter i vevskulturinkubatoren under forholdene som er oppført i trinn 2.5.
- Kontroller cellene daglig til de når ca. 80% samløp (ca. 2,0-4,0 x 105 celler per ml). Det er svært viktig at celler ikke blir for konfluente, da de kan skille seg ut i skjelettmuskulatur myotubes når sultet av FBS i lengre perioder på tid14, og denne differensiering kan endre bakteriell invasjon. Overvåk cellene nøye og start med et nytt rør av celler hvis en kultur blir flytende.
- Når cellene når 80% samløp, kan de enten passeres inn i en annen 50 ml kolbe som nettopp beskrevet, eller forberedt på invasjonsanalyse.
3. Forbereder H9c2-celler for invasjonsanalyse
- I vevskulturhetten fjerner du mediet fra en 50 ml kolbe av H9c2-celler som har nådd 80% sammenløp ved hjelp av vakuumaspirasjon.
- Tilsett 4 ml 0,25% Trypsin-EDTA-oppløsning til monolayeren og fjern umiddelbart ved hjelp av vakuumaspirasjon.
- Tilsett en annen 4 ml del av 0,25% Trypsin-EDTA i kolben og flytt kolben til et invertert mikroskop for å observere spredningen av monolayeren.
- Når cellene har spredt seg, gå tilbake til hetten og tilsett 4 ml DMEM -Ab til cellene. Pipettering av løsningen opp og ned sikrer fullstendig fjerning av celler fra bunnen av kolben.
- Etter resuspensjon av monolayer, fjern all suspensjonen og legg den i et 50 ml konisk rør.
- Fjern en 20 ul del av denne suspensjonen og telle antall celler per milliliter ved hjelp av et hemocytometer.
- Når konsentrasjonen av celler i løsningen er bestemt, juster konsentrasjonen til 2,25 x 104 celler / ml ved å legge til riktig volum celleløsning til fersk DMEM -Ab. Det totale volumet av den justerte løsningen skal være 25 ml.
- Mens du er i hetten, steriliser glassdeksler ved å dyppe dem i 90% etanol og kort passere hver dekslelip gjennom en flamme. Tilsett hver dekslelip til en individuell brønn av en 24-brønns vevskulturbehandlet plate rett etter at den er sterilisert.
- Etter at alle brønnene har en individuell dekslelip, bruk en 25 ml pipet for å tilsette 1 ml av den fortynnede celleoppløsningen til hver av brønnene i platen, og skyv hver deksleslip ned med en steril nål.
- Sjekk hver brønn ved hjelp av et invertert mikroskop for å sikre at lignende mengder celler er i hver brønn. Sett 24 brønnplaten i vevskulturinkubatoren over natten ved 37 °C i 5 % CO2 og 95 % fuktighet.
- Neste morgen, se hver brønn for å sikre at dekslene har sammenlignbare mengder tilhenger myoblaster og at dekslene ikke flyter i brønnen.
4. Forbereder stammer av L. monocytogenes for invasjonsanalyser
MERK: Alt laboratoriearbeid utføres i henhold til CDC Biosafety Level 2 retningslinjer.
- Etter å ha forberedt 24-brønnsplaten for analyse, bruk en sterilisert løkke for å fjerne enkeltkolonier av stammene som skal undersøkes for bakterieinvasjon og inokulere hver i individuelle 14 ml rør som inneholder 2 ml BHI-buljong.
- Plasser de inokulerte rørene i en 37 °C inkubator vippet ved 45° og inkuber statisk (uten risting) over natten.
- Neste morgen, fjern kulturrøret fra inkubatoren og virvelen kort for å sikre jevn suspensjon av bakteriene.
- Mål kulturens optiske tetthet ved hjelp av et spektrofotometer ved 600 nm bølgelengde. Pass på at du nullstiller spektrofotometeret ved hjelp av steril BHI-buljong før du leser den optiske tettheten.
- For L. monocytogeneser den optiske tettheten direkte relatert til konsentrasjonen av bakterier per ml, slik at en tetthet på 1.000 = 1,0 x 109 CFU per ml.
- Beregn mengden kultur som trengs for å infisere 2,25 x 104 celler med 2,25 x 106 (MOI = 100).
- Fjern mengden kultur som trengs og legg den i et 1,5 ml sentrifugerør.
- Snurr kulturen på 19 000 x g i 3 minutter, og kast deretter supernatanten. Trykk den åpne enden av røret mot et papirhåndkle for å fjerne overflødige medier som sitter fast i rørets leppe.
- Resuspend bakteriene i 1 ml steril PBS, og virvel for å sikre tilstrekkelig blanding. Denne blandingen skal inneholde ca. 2,25 x 106 CFU per 20 ul (1,125 x 108 CFU/ml).
5. Utføre invasjonsanalysen
- Dagen før invasjonsanalysen utarbeider du 24-brønnsplater av H9c2-celler som beskrevet i avsnitt 3, og inokulerer også steril BHI-buljong med ønsket stamme(r) av Listeria som beskrevet i avsnitt 4.
- Ved hjelp av protokollen i avsnitt 4 forbereder du PBS-resuspenderte kulturer av stammene som skal vurderes for invasjon. Merk: Infeksiøs titer kan vurderes på dette tidspunktet ved å plating fortynning av hver prøve på faste medier og liste opp kolonier etter natt inkubasjon.
- Last minst 20 ul av PBS-bakterieløsningen inn i individuelle brønner på 24-brønnsplaten. Merk at det er behov for minst tre individuelle brønner for hver belastning for å oppnå resultater i triplikat, slik at opptil 8 stammer kan vurderes i tandem.
- Etter å ha lastet brønnene med bakterier, rock platen forsiktig for å oppmuntre til homogen spredning av hver prøve i brønnen, og legg 24-brønnsplaten tilbake i inkubatoren i 45 min inkubasjon ved 37 °C og 95 % fuktighet, med 5 % CO2.
- Under denne inkubasjonen, lag en aliquot av DMEM – Ab (avsnitt 2) ved ganske enkelt å fjerne 25 ml DMEM -Ab og plassere den i et 50 ml falkerør (eller tilsvarende).
- Tilsett gentamicin til 25 ml DMEM –Ab aliquot i en konsentrasjon på 15 ug/ml (7,5 ul av en 50 mg/ml lageroppløsning). Plasser DMEM –Ab +Gent-oppløsningen i et vannbad på 37 °C i løpet av inkubasjonen på 45 minutter.
- Aliquot 25 ml PBS i et 50 ml falkerør og plasser i 37 °C vannbad under inkubasjonen på 45 minutter.
- Etter at inkubasjonen på 45 min er fullført, fjern 24-brønnsplaten og legg den i hetten. Fjern mediet som inneholder bakterier fra hver brønn ved vakuumaspirasjon, og endre glasspipetspisser mellom forskjellige stammer.
- Tilsett ca. 1 ml PBS til hver brønn for å vaske løst tilhengerbakterier fra overflaten av cellene, og fjern deretter PBS ved hjelp av vakuumaspirasjon.
- Etter fullstendig fjerning av PBS, tilsett 1 ml DMEM -Ab +Gent til hver brønn. Gentamicin vil bare drepe de bakteriene som forblir utenfor cellene, og dermed vil de som er intracellulære forbli levedyktige.
- Plasser 24-brønnsplaten tilbake i inkubatoren og la den inkubere i en ekstra time.
- I løpet av den timelange inkubasjonen, lag 14 ml polypropylenrør ved å tilsette 1 ml steril ddH20 til hvert rør. Ett rør vil være nødvendig for hver dekslelip, så for en 24-brønns plate, forberede 24 rør totalt.
- Etter den timelange inkubasjonen fjerner du 24-brønnsplaten fra inkubatoren og legger den i hetten, sammen med rørene som er tilberedt i trinn 5.12.
- Bruk sterile pinsett, fjern hver dekslelip fra sin respektive brønn og plasser den umiddelbart i et individuelt rør. Pass på å dyppe pinsettene i etanol og flamme dem mellom hver dekslelip for å forhindre forurensning.
- Etter at alle dekslene er fjernet og plassert i individuelle rør, kast 24-brønnsplaten.
- Gå tilbake til benken og virvel hvert rør i 5-10 sek.
- Fjern en del fra hvert rør og legg hver prøve i en individuell brønn på en 96-brønns plate, og fortynn deretter hver prøve serielt ved hjelp av 1:10 fortynning opp til en 1:1000 fortynning.
- Bruk forvarmede og tørre LB-plater, spotplate hver av fortynningsseriene på agarplatene. En flerkanals pipet kan brukes til å plate 5-10 μl flekker fra hver prøves fortynningsserie.
- Fjern også 20 μl prøver fra hver ufortynnet brønn og spotplate denne mengden direkte på LB agar på en separat plate fra fortynningsserien. (Dette større volumet kan brukes til å liste opp dårlig invasive stammer).
- Etter at alle prøvene er flekkbelagt, kast de 14 ml rørene som inneholder dekslene. Parafilm 96-brønnsplaten og legg den i en fryseboks ved -80 °C for replating, om nødvendig.
- La flekkene tørke helt. Denne prosessen fremskyndes sterkt ved å plassere platene i hetten og fjerne lokkene.
- Etter at flekkene har tørket, legg platene i en 37 ° C inkubator over natten.
- Neste morgen teller du antall kolonier i hvert sted i fortynningsserien som kolonitallene lett kan vurderes for (mellom ca. 5 og 50 kolonier) (figur 1), og bruker serien til å beregne antall bakterielle perlipdeksler for hver stamme som vurderes.
6. Forbereder stammer av L. monocytogenes for museinfeksjoner
- Natten før infeksjon, bruk en sterilisert løkke for å fjerne enkeltkolonier av stammene ønsket og inokulere hver i individuelle 14 ml rør som inneholder 2 ml BHI buljong.
- Plasser de inokulerte rørene i en 37 °C inkubator vippet ved 45° og inkuber statisk (uten risting) over natten.
- Neste morgen, fjern kulturrøret fra inkubatoren og virvelen kort for å sikre en jevn suspensjon av bakteriene.
- Mål kulturens optiske tetthet ved hjelp av et spektrofotometer ved 600 nm bølgelengde. Pass på at du nullstiller spektrofotometeret ved hjelp av steril BHI-buljong før du leser den optiske tettheten. (For L. monocytogeneser den optiske tettheten direkte relatert til konsentrasjonen av bakterier per ml, slik at en tetthet på 1.000 = 1,0 x 109 CFU per ml)
- Beregn mengden kultur som trengs for å infisere hvert dyr. Injeksjoner inneholder vanligvis 200 μl PBS med 10.000 CFU av en individuell stamme, noe som betyr en ønsket konsentrasjon på 5,00 x 104 CFU / ml.
- Fjern en 5 μl aliquot av hver endelige fortynning og spred platen direkte på LB agar. Inkuber over natten ved 37 °C for å bekrefte konsentrasjonen som brukes til inokulering.
- Injiser hver CFU-suspensjon innen 1 time etter fortynning (se nedenfor).
7. Inokulere L. monocytogenes i mus via hale vene injeksjon og vurdere bakteriell byrde i leveren, milten og hjertet
Merk: Alt dyrearbeid utføres i henhold til CDC Biosafety Level 2 retningslinjer. Mus bestilles vanligvis en uke i forveien og bures sammen med 5 dyr per bur. Mus har lov til å akklimatisere seg til det nye laboratoriemiljøet i fire dager før injeksjon. Disse eksperimentene brukte 6-8 uker gamle kvinnelige Swiss-Webster-mus som ble plassert 5 til et bur i et barrieremiljø og matet et ikke-begrenset kosthold.
- Forbered ett bur med mus om gangen ved å fjerne lokket og mat / vannbeholdere, og plasser buret under en varmelampe i fem minutter. Denne prosessen gjør det mulig for haleårene å utvide, noe som gjør injeksjoner lettere å utføre.
- Fjern ett dyr og legg det i en sele (eller falkerør med enden avskåret) for å begrense dyret under injeksjonen.
- Rengjør injeksjonsstedet med en alkoholpute, og la alkoholen fordampe. Dette renser ikke bare stedet, men utvider også halevenen ytterligere.
- Bruk en 1 ml sprøyte utstyrt med en 27,5 gauge nål, injiser musen forsiktig med 200 μl av ønsket kultur i halevenen.
- Bruk en gasbind for å stoppe blødninger som kan oppstå som følge av injeksjonen, og legg dyret i et friskt bur.
- Gjenta denne prosessen for de resterende dyrene og stammene. Pass på å merke hvert bur av dyr med belastningen de har mottatt.
- Sjekk dyrene daglig, fjern og ofre dyr som ser ut til å være syke. Hvis ingen dyr viser tegn på sykdom, la infeksjonene fortsette i 72 timer før du ofrer alle dyr.
- For å ofre, bruk CO2 anestesi fra en flaskekilde til alle åndedrett har stoppet, og bruk deretter cervical dislokasjon for å sikre at dyret er dødt.
- Etter offer, flytt dyrene til en vevskultur hette for disseksjon.
- Bruk en disseksjonsblokk, fest hvert ben av dyret med store nåler og spray dyret med 70% etanol til det er mettet.
- Klipp huden på magen og thoraxen tilbake ved hjelp av et Y-formet snitt som strekker seg fra vaginalåpningen opp til xiphoid-prosessen, og gå deretter opp til axillaen på hver arm.
- Trekk tilbake huden og fjern nålene fra hvert ben for å holde disseksjonen åpen.
- Klipp forsiktig gjennom bukhinnen, utsette tarmene, magen, leveren og milten.
- Ved først å kutte levervenen og koronal ligamentet på toppen av leveren, begynn å fjerne leveren. Ytterligere leddbånd som skal fjernes, finnes under leveren, forbinder den med den første delen av tynntarmen, samt til muskulaturen på ryggen.
- Plasser leveren i 5 ml steril ddH20 i et 50 ml falkerør.
- Deretter fjerner du milten ved å isolere den og forsiktig kutte bort vaskulaturen og leddbåndene. Milten vil bli fjernet lettere enn leveren. Plasser milten i et separat falkerør som inneholder 5 ml steril ddH20.
- Lokaliser membranen og kutt forsiktig langs ribbeina for å visualisere thoraxen. Skjær gjennom xiphoid-prosessen og brystbenet til nakkenivået for å åpne thoraxen, utsette hjertet og lungene.
- Bruk tang, ta tak i hjertet forsiktig ved toppen, og løft det slik at aorta- og lungefartøyene er i spenning. Klipp disse karene for å frigjøre hjertet.
- Plasser hjertet i et 50 ml falkerør som inneholder 5 ml steril ddH20.
- Kast musekroppen, og gjenta denne prosessen for hvert dyr, ved hjelp av rene falkerør som inneholder 5 ml steril ddH20 for hvert organ som fjernes.
- Når alle organene er fjernet, rengjør du arbeidsstasjonen og går tilbake til benken.
- Forbered et sett med 5 rør som skal brukes til rengjøring og sterilisering av homogenisatoren for hvert sett med organer fra fem mus (dvs. ett 5 rørsett for 5 lever, 5 rør for 5 milt og 5 rør for 5 hjerter). Fire av hver av rørene skal fylles med 30 ml steril ddH20, og en skal fylles med 30 ml 90% EtOH.
- Bruk en TissueMaster (eller tilsvarende homogenisator), dypp homogenisatoren (mens du løper) inn i rørene som er utarbeidet i trinn 7.21 som følger for å rengjøre sonden:
- Rør 1 (ddH2O)
5 sek i rør 2 (ddH2O)
5 sek i rør 3 (EtOH)
5 sek i rør 4 (ddH2O)
5 sek i rør 5 (ddH2O) - Homogeniser en lever ved hjelp av homogenisatoren i minst 2 min, eller til ingen synlige deler av organet forblir. Bruk pinsett for å fjerne store rester fra sonden.
- Gjenta rengjøringsprosessen som er beskrevet i trinn 7.22
- Gjenta homogeniseringsprosessen for de andre leveren, sørg for å vaske sonden mellom hver lever ved hjelp av prosessen beskrevet i trinn 7.22.
- Etter at alle leveren er helt homogenisert, kast vaskerørene (1-5) for leveren.
- Gjenta homogeniserings-/ren-prosessen for både milten og hjertene også, og sørg for å bruke et nytt sett med vaskerør for hver serie organer. Hvis vaskerørene på noe tidspunkt blir uklare, kast dem og erstatt dem med nye rør for å fullføre serien.
- Etter at alle organene er homogenisert, gjør en siste rengjøringssyklus på homogenisatoren og tørk den godt for lagring.
- Plasser ca. 200 μl av hvert organ i en individuell brønn med en 96-brønnsplate.
- Utfør serielle fortynninger på organprøvene ved å fortynne 1:10 i en serie opp til en 1:10,000 fortynning (lever og milt) eller opptil en 1:1,000 fortynning (hjerte).
- Spotplate fortynningsserien på forvarmet LB agar. Fjern også 20 ul av hvert ufortynnet organ og plate på separate LB agarplater for å liste opp CFU fra dårlig koloniserte organer.
- Kast falkerørene som inneholder de homogeniserte organene, og pakk de 96-brønnsplatene som inneholder fortynningsserien med parafilm og legg den i en fryseboks ved -80 °C.
- La flekkene tørke. Denne prosessen skjerpes ved å plassere platene i hetten og fjerne lokkene.
- Etter at flekkene har tørket, legg platene i en 37 ° C inkubator over natten.
- Tell antall kolonier på hvert sted neste morgen og bruk fortynningsserien til å beregne totalt antall bakterier per organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvalgte isolasjoner av L. monocytogenes viser forbedret invasjon av hjerteceller i cellekultur og i musemodeller av infeksjon. Figur 1 viser et eksempel på hvordan bakteriekolonier kan oppstå etter spotbelegg av suspensjoner på agarmedier. Denne metoden tillater nøyaktig vurdering av CFUer i en prøve uten å bruke et stort antall agarmedieplater. Figur 2 viser et eksempel på en vevskulturbasert analyse som sammenligner evnen til stamme 10403S til å invadere hjerteceller med stammen 07PF0776. Mer enn dobbelt så mange 07PF0776 bakteriell CFU kan gjenvinnes fra infiserte H9c2 hjerteceller etter gentamicin behandling i forhold til celler infisert med 10403S. Forskjeller på 2 til 4 ganger observeres rutinemessig for kardiotrope stammer ved hjelp av denne analysen. Figur 3 viser et eksempel på gjenoppretting av bakterier fra leveren, miltene og hjertene til infiserte mus etter 3 dager etter infeksjon. Infeksjonen av mus med kardiotrope stammen 07PF0776 eller stamme 10403S resulterer i sammenlignbare antall bakterier gjenvunnet fra leveren og miltene til infiserte mus, men mus smittet med 07PF0776 er mer sannsynlig å gi påvisbare antall bakterier fra hjertet og å vise større bakterielle byrder i dette organet.
Figur 1: Eksempel på punktbeleggteknikk for å bestemme bakterielle CFUer. H9c2 celler dyrket på glass coverlips og infisert med L. monocytogenes ble lysed og suspensjoner ble serielt fortynnet ved hjelp av 1:10 fortynning opp til en 1:1,000 fortynning (venstre panel). En flerkanals pipet ble brukt til å røre 10 ul fra hver brønn direkte på en LB agarplate, og platen ble inkubert over natten ved 37 °C (høyre panel). Antall bakterier per deksler vurderes ved å telle bakteriell CFU forbundet med riktig fortynning.
Figur 2: L. monocytogenes stamme 07PF0776 viser forbedret invasjon av hjerteceller i vevskultur. Invasjonsanalyser ble utført i H9c2-celler ved hjelp av en MOI = 100. Graf viser gjennomsnittlig antall intracellulære bakterielle CFUer gjenvunnet +/- SE fra celler infisert med 10403S (svart) versus kardiotrope 07PF0776 belastning (blå). ** indikerer en signifikans av p <0,01.
Figur 3: L. monocytogenes stamme 07PF0776 viser forbedret invasjon av hjertet i museinfeksjonsmodeller. Dyr ble inokulert med 10.000 CFU via halevenen. Infeksjoner fikk lov til å utvikle seg i 72 timer, da dyrene ble ofret og leveren, miltene og hjertene ble samlet inn og behandlet for å bestemme bakteriell CFU per organ. Faste sirkler representerer CFU oppnådd fra individuelle mus, med gjennomsnittsverdien for alle dyr i en gruppe indikert med en linje +/- SE. Prosentverdiene indikerer antall dyr som inneholder påviselig bakteriell CFU i hjertet. * indikerer en betydning av p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L. monocytogenes er et utbredt og godt karakterisert menneskelig patogen, som er i stand til å forårsake en rekke forskjellige sykdoms manifestasjoner15. Bakterien har tidligere blitt beskrevet for sin evne til å translokalisere på tvers av barrierer, for eksempel blod-hjerne-barriere og placental-foster barrierer, for å nå og kolonisere sentralnervesystemet og utvikle foster, henholdsvis. Organismens in vivo evne til å kolonisere disse vevene kompletteres ofte av en in vitro evne til å invadere de representative cellene i kulturen som utgjør organene som er målrettet. For eksempel har invasjon av epitelceller i choroid plexus vært forbundet med organismens evne til å kolonisere CNS16; og villous trophoblast explants har blitt brukt til å representere mors-fosterbarrieren17. I denne protokollen er det beskrevet metoder som er nyttige for å vurdere bakteriell invasjon av hjerteceller i kultur, samt for sammenligning av bakteriell kolonisering av hjertet for individuelle isolasjoner i forhold til kolonisering av leveren og milten.
Denne protokollen inneholder en rekke kritiske trinn, men blant de mest kritiske er de som involverer bruk av riktig bakteriell CFU for enten infeksjon av vevskulturceller dyrket på deksler eller infeksjon av dyr. Hvis bakteriell CFU-nummer ikke kontrolleres riktig mellom forskjellige brønner og dyr, kan det ikke foretas direkte sammenligninger mellom prøver. Det er viktig å dobbeltsjekke fortynningsserien som brukes til å generere inocula ved direkte plating av de endelige fortynningene på medieplater for å garantere at bakteriell CFU-nummer er nøyaktig estimert.
H9c2-cellene som brukes i disse analysene er avledet fra den nedre halvdelen av et 13 dagers embryonalt rottehjerte som for det meste inkluderte ventrikkelvev18. Cellene forplanter seg som mononukleerte myoblaster og når de når samløp i vevskulturflasker eller retter begynner å danne multinukleerte rørformede strukturer. Cellene har en generasjonstid på ca. 30 timer18. Serum sult av H9c2 celler har vært assosiert med differensiering av cellene i skjelettmuskulaturceller, mens behandling av myoblaster med 10 nMall-trans retinoinsyre har vært forbundet med myoblast differensiering i hjerte myocytter14. Denne protokollen var fokusert på L. monocytogenes myoblastcelleinvasjon, men H9c2-cellelinjen er en allsidig cellelinje som kan brukes til å undersøke effekten av kontrollert celledifferensiering på bakterieinvasjon.
L. monocytogenes stamme 07PF0776 ble opprinnelig isolert fra en HIV-infisert pasient som hadde en ikke-resusitatable asystolisk arrestasjon på grunn av en invasiv L. monocytogenes infeksjon i hjertet8. Etterfølgende analyse av denne belastningen i museinfeksjonsmodeller indikerte at den hadde en forbedret kapasitet til å målrette og invadere hjertevev. En begrenset analyse av ytterligere tilfeldige isolasjoner av L. monocytogenes antyder at subpopulasjoner av bakterielle isolasjoner er i stand til å infisere musenes hjerter i fravær av tidligere skade på hjertevev eller hjerteklaffer8. Interessant nok ble to av de best karakteriserte L. monocytogenes stammer, 10403S og EGD, funnet å være dårlige kolonisatorer av hjerteceller og vev. Genomsekvensering av 07PF0776-isolasjonen avslørte ikke tilstedeværelsen av noen nye patogenitetsøyer eller gir bevis på unike genklynger19; Dette antyder at 07PF0776 retter seg mot hjerteceller for invasjon gjennom modifikasjon av sitt eksisterende arsenal av virulensgenprodukter. Foreløpig histokjemisk analyse indikerer at 07PF0776 danner abscesser i infiserte musehjerter som ser ut som abscess observert i den opprinnelige infiserte menneskelige pasienten (data ikke vist). Hvorvidt andre kardiotrope L. monocytogener isolerer induserer lignende hjerteabscessdannelse gjenstår å bestemme.
Analysene som presenteres her kan enkelt endres for å lette undersøkelsen av ulike aspekter ved infeksjon. Individuelle deksler kan festes og farges for enten lys eller fluorescensbasert mikroskopi, vevskulturinkubasjonstider kan økes for måling og sammenligning av bakterier intracellulære vekstrater, vev og organer kan være parafin innebygd og behandlet for mikroskopisk undersøkelse for å undersøke abscessdannelse og bakteriell fordeling på cellenivå. Ved vurdering av nivåer av bakteriell invasjon av vevskulturceller eller kolonisering av vertsvev, er det begrensninger når det gjelder den minste mengden bakterier hver analyse kan oppdage. In vitro invasjonsanalyser har en nedre grense for påvisning av ca. 300 CFU per deksler. Justering av volumet av vann som brukes til å virvele dekslene kan forbedre påvisning av lavt antall bakterier, med cellelysvolumer så lave som 500 μl som viser seg nyttige for å oppdage dårlig invasive stammer. Deksler kan dyppes kort i sterilt vann for å fjerne overflødig gentamicin før lysis av vertsceller i mindre mengder. Volumnivåer opp til 5 ml eller mer kan brukes til å liste opp svært invasive stammer riktig. I dyrene kan organhomogenater genereres i volumer på 5 ml eller 10 ml ddH20, med lavere volumer som er nyttige for å oppdage lavere nivåer av bakterier, og høyere volumer for bedre å liste opp sterkt koloniserte organer. Minimumsdeteksjonsområdet for infiserte organer er ca. 100 CFU. Hvis organer konsekvent koloniseres ved høye nivåer, bør du vurdere å bruke et større volum vann (10 ml) og utføre flere fortynninger i 96-brønnsplaten.
Metodene som er beskrevet kan brukes på organer og vev utenfor hjertet. Invasjonsanalyser og museinfeksjoner som disse har blitt brukt til å vurdere kolonisering på en rekke steder, inkludert morkake, hjerne, galleblæren, leveren og tarmen. Modifikasjoner av protokollene beskrevet ovenfor kan også gjøres for å imøtekomme hyperinvasive og / eller hypervirulente stammer, og substitusjon av hjerteceller med andre celletyper kan gjøres for å vurdere invasjonsfenotyper på steder utenfor kardiovaskulærsystemet. Siden forskjellige celletyper har endret følsomheten for invasjonen av L. monocytogenes, kan det være nødvendig å justere parametere som MOI og inkubasjonstider for å kunne gjenopprette data nøyaktig fra analysene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Public Health Service tilskudd AI41816 og AI099339 (N.E.F.) og av F31AI094886-01 (P.D.M.) fra NIAID. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til finansieringskildene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco | BHI Broth Base | 237200 | 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar) |
| Difco | Agar | 214510 | 2 kg of Granulated Agar |
| Difco | BHI Agar | 241810 | 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar |
| in vitrogen | LB Broth Base | 12975-084 | 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar) |
| Fisher | Glass Coverslips | 12-545-80 | 12 mm glass coverslips |
| Falcon | 24-well Tissue Culture Plate | 35-3047 | 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate |
| Falcon | 14mL Polystyrene tube | 352051 | 14 ml Polystyrene tubes |
| Falcon | 96-well U-bottom plate | 35-3077 | Non-tissue culture treated 96-well plate |
| Corning | 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture |
| Corning | DMEM (High glucose, high pyruvate) | 15-013-CU | DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics |
| Corning | Pen/Strep/Glut Solution | 30-009-CI | Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture |
| Corning | Gentamicin | 30-005-CR | 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture |
| Cellgro (Corning) | L-Glutamine | 25005197 | Stock L-glutamine solution without antibiotics |
| Denville | 75cm^2 Flask | T1225 | 75 cm2 tissue culture treated flask |
| Denville | 1.5mL microcentrifuge tubes | 2013004 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| ATCC | H9c2 Cardiac Myoblasts | CRL-1446 | Rat cardiac myoblasts |
| Hyclone | Fetal Bovine Serum | SH30070.63 | Fetal Bovine Serum |
References
- Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
- Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
- Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
- Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
- Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
- Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
- Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
- Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
- Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
- Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
- Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
- Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
- McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
- Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
- Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
- Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
- Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
- McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).
